Спектр вариантов последовательности гена TP53 у женщин с раком молочной железы и без такового из когорты реки Теча Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ТОМ 4 / VOL. 4 ПРИЛОЖЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ III ВСЕРОССИЙСКОЙ КОНФЕРЕНЦИИ

29

Влияние энхансер-ассоциированной РНК вируса папилломы человека 16-го типа на вирусную транскрипцию

А.Э. Миннегалиева, П.М. Абрамов, М.Д. Федорова, Н.В. Говердовская, Д. С. Елкин, С. В. Винокурова, А.Н. Катаргин, Л. С. Павлова, Н.П. Киселева

ФГБУ«НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва

Длительная персистенция ВПЧ высокого онкоген-ного риска в эпителии шейки матки ассоциирована с развитием рака. Ключевыми факторами в злокачественной трансформации являются вирусные онкогены Е6 и Е7. В инфицированном эпителии при осуществлении жизненного цикла вируса оба онкогена находятся под жестким транскрипционным контролем. Утрата транскрипционного контроля приводит к повышению экспрессии онкогенов, что является фактором, направляющим неопластическую трансформацию клеток. Механизм нарушения контроля экспрессии онкогенов недостаточно изучен. Экспрессия онкогенов Е6 и Е7 регулируется частью генома ВПЧ, известной как регуляторный район (upstream regulatory region, URR), который содержит общие для 2 онкогенов промотор и энхансер. Известно, что клеточные энхансеры могут модулировать транскрипцию с помощью длинных некодирующих РНК, транскрибируемых двунаправленно с энхансеров РНК-полимеразой II. Методом обратной транскрипции с последующей ПЦР мы идентифицировали сенс и антисенс некодирующих РНК, ассоциированные с районом энхансера в URR ВПЧ 16-го типа в клеточных линиях и в 92 % опухолей шейки матки. Трансфекция клеток карцином шейки матки малыми интерферирующими РНК, комплементарными как к сенс-, так и антисенс-транскриптам некодирующих РНК, приводила к статистически значимому снижению уровня некодирующих РНК и подавлению экспрессии онкогенов Е6 и Е7.

Таким образом, впервые показано существование вирусных длинных некодирующих РНК в районе URR ВПЧ 16-го типа, участвующих в регуляции уровня транскрипции онкогенов, как в клеточных линиях, так и опухолях шейки матки. Обнаруженные эпигенетические регуляторы экспрессии вирусного генома могут служить мишенями для подавления экспрессии вирус -ных онкогенов.

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ

(грант № 15-15-00125).

Спектр вариантов последовательности гена TP53 у женщин с раком молочной железы и без такового из когорты реки Теча

В. П. Пушкарев, А. В. Возилова, В. С. Никифоров, Е.В. Киселева

Лаборатория радиационной генетики, ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России, Челябинск

Введение. Молочные железы у женщин являются наиболее радиочувствительным органом, и воздействие ионизирующей радиации играет важную роль в развитии РМЖ (UNSCEAR, 2000, 2006). Исследование заболеваемости РМЖ среди 10 тыс. женщин когорты р. Теча за 1954—2004 гг. выявило, что около 12 % из 109 наблюдаемых случаев могут быть вызваны ионизирующей радиацией (E. Ostroumova, 2008). Близнецовое исследование вклада наследственных факторов в риск развития злокачественных новообразований показало статистически значимый эффект для РМЖ (27 %; 95 % ДИ 4-41 %) (P. Lichtenstein, 2000). Ген ТР53, ген-супрессор опухолевого роста, кодирует транскрипционный фактор, действие которого направлено на остановку клеточного цикла, запуск старения и индукцию апоптоза. Соматические и наследуемые варианты гена TP53 имеют большое значение в развитии злокачественных новообразований.

Задачи исследования. Определить спектр, частоту, структурные особенности и функциональное значение вариантов гена ТР53 у облученных женщин когорты р. Теча с РМЖ и без такового.

Материалы и методы. Дизайн исследования — «случай-контроль». Обследовано 57 женщин когорты р. Те -ча. Индивидуальные дозы воздействия на красный костный мозг составляли от 0,003 до 4,6 1р (TRDS-2009). В основную группу вошли 29 женщин с РМЖ в возрасте 64 ± 12 лет (М ± с) на момент постановки диагноза; в контрольную группу — 28 женщин без злокачественных новообразований в анамнезе. ДНК выделяли из образцов цельной крови, хранящихся в биобанке лаборатории. Секвенировали по Сэнгеру 15 фрагментов ДНК, перекрывающих экзоны 2—11 гена ТР53. Сборку контиг, выравнивание последовательностей, сравнение с референтной последовательностью гена ТР53 (NG_017013) выполняли с помощью программы SeqScape v2.7 (Thermo Fisher Scientific, США). Биологическое значение детектированных вариантов анализировали с помощью IARC TP53 Database (R. 18, April 2016).

Результаты. В кодирующей части обнаружены варианты (опыт/контроль): g. 7579472G>C(rs1042522) — 7/11; g.7579579C>T(rs1800370) — 1/2; g.7578210T>C (rs1800372) — 1/1. В группе с РМЖ были найдены 2 варианта, которые отсутствовали в контроле: g.7578655T>A (rs145153611, 4 интрон) — у 1 человека, g.7572518G>T (rs191918079, 3'UTR) — у 1 человека. Последний

cv

CS

и ш u

ж ш

и

30

МАТЕРИАЛЫ III ВСЕРОССИЙСКОЙ КОНФЕРЕНЦИИ

ПРИЛОЖЕНИЕ ТОМ 4 / VOL. 4

CV

CS

и ш U

X ш

и

вариант отсутствует в базе данных IARC TP53 Database (R. 18, April 2016).

Выводы. Увеличение размеров групп позволит в будущем сделать обоснованные выводы о роли вариантов в гене ТР53 в развитии РМЖ, индуцированного ионизирующей радиацией.

Статус метилирования LINE-1 при колоректальном раке

Н.Н. Тшошкина, И.Ю. Ефимова, М.А. Кожушко, Д. И. Водолажский

ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, Ростов-на-Дону

Введение. Статус метилирования повторяющихся мобильных элементов, в частности LINE-1, играет большую роль в поддержании геномной стабильности и используется в качестве показателя уровня метилирования всего генома при различных патологических состояниях, в том числе при злокачественных опухолях.

Задачи исследования. Оценить статус метилирования LINE-1 при колоректальном раке (КРР) в зависимости от клинико-патологических характеристик и метилирования промоторных областей ряда генов, ассоциированных с онкогенезом в толстой кишке.

Материалы и методы. Метод пиросеквенирования (PyroMark Q24, Qiagen, Германия) использован для количественного определения уровня метилирования СpG-сайтов LINE-1 и 8 генов-онкосупрессоров (APC, DAPK, CDH13, MLH1, MGMT, P16, RUNX3и RASSF1A) в опухолях и нормальной ткани кишки 61 пациента с диагнозом КРР различных TNM-стадий. В отношении 11 пациентов установлены клинические признаки наследственного КРР. Статистическая обработка результатов проведена с использованием пакета IBM SPSS Statistics v. 23.0.

Результаты. Уровень метилирования LINE-1 в опухолях составил 65,8 ± 0,89 %, что достоверно ниже (р = 0,0013) уровня, определяемого в условно нормальных тканях (74 ± 0,45 %). Доля опухолей со значимо сниженным уровнем метилирования данного маркера в группе лиц со спорадическим КРР и группе лиц с клиническими признаками наследственного КРР не различалась, составив 50 и 45 % соответственно. Исследованные онкосупрессоры были гиперметили-рованы в 70 % случаев спорадических аденокарцином толстой кишки.

Изменение метилирования LINE-1 не было связано с возрастом пациентов (в отличие от гена MGMT), стадией заболевания, степенью дифференцировки, локализацией опухоли и отягощенностью генеалогического анамнеза. Отрицательная корреляция метилирования опухоли связывала данный маркер с генами APC и CDH13 (r = -0,362 и -0,427 соответственно, p < 0,05). Использованная панель маркеров дискриминировала

опухоли дистального и проксимального отдела толстой кишки (р = 0,041), при этом в последних статистически значимо чаще встречался статус гиперметилирования генов CDH13 и DAPK (p = 0,004). Кроме того, в выборке пациентов с отягощенным семейным анамнезом статистически значимо повышался уровень метилирования RASSF1A (р = 0,0006).

Выводы. Анализ CpG-метилирования позволяет идентифицировать различные подгруппы КРР. Настоящее исследование продемонстрировало отсутствие ассоциации статуса метилирования LINE-1 с клинико-морфологическими особенностями опухолей. Однако высокая частота встречаемости гипометилирования LINE-1 вместе с оценкой гиперметилирования онко-супрессоров может быть полезным маркером для ранней диагностики и прогноза течения КРР.

Гиперметилируемые супрессорные микроРНК,вовлеченные в регуляцию генов CCND1 И BCL2 при раке молочной железы

Е.А. Филиппова1, И. В. Пронина1, В. И. Логинов1- 2, А.М. Бурденный1 3,Т.П. Казубская4, Н.Е. Кушлинский4, А.А. Соколовская1, Д.М. Зайченко1, А.А. Московцев1, Э.А. Брага1' 2, А.А. Кубатиев1

1ФГБНУ «НИИобщей патологии и патофизиологии», Москва;

2ФГБНУ«Медико-генетический научный центр», Москва;

3ФГБУН «Институт биохимической физики» им. Н.М. Эмануэля РАН», Москва; 4ФГБУ «НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва

Введение. Эпигенетические механизмы, включая метилирование ДНК и взаимодействие между ми-кроРНК и матричной РНК, являются наиболее динамичными в регуляции экспрессии генов.

Задачи исследования. Идентифицировать при раке молочной железы (РМЖ) новые микроРНК, которые вовлечены в регуляцию генов, задействованных в индукции клеточного цикла, апоптоза и/или эпители-ально-мезенхимального перехода.

Материалы и методы. Изучена репрезентативная выборка из 58 парных (опухоль/норма) образцов РМЖ и клеточная линия РМЖ MCF7, проведены метилспе-цифичная и количественная ПЦР, ДНК-цитометрия, статистическая обработка с использованием программного пакета IBM SPSS Statistics Base 20. Проанализированы профили экспрессии и метилирования 20 су-прессорных микроРНК и 15 опухолеассоциированных генов (отобранных как предсказанные потенциальные мишени с применением алгоритма CrossHub).

Результаты. Установлена значимая корреляция между метилированием промоторных областей и уровнями экспрессии генов 12 микроРНК, что подтверждает функциональную роль метилирования генов