Спектр полиморфных вариантов в экзонах и нетранслируемых областях генов NPHS1 и NPHS2 у пациентов с нефротическим синдромом Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

УДК 577.21:616.61

А. А. Яцкив1, Н. В. Никитченко1, А. Г. Белькевич2, И. А. Козыро2, Р. И. Гончарова1

СПЕКТР ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ В ЭКЗОНАХ И НЕТРАНСЛИРУЕМЫХ ОБЛАСТЯХ ГЕНОВ NPHS1 И NPHS2 У ПАЦИЕНТОВ С НЕФРОТИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ

Тосударственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: a.yatskiv@igc.by ^Учреждение образования «Белорусский государственный медицинский университет» Республика Беларусь, 220083, г. Минск, пр. Дзержинского, 83

Определен спектр полиморфных вариантов генов NPHS1 и NPHS2 в экзонах, 5'- и 3'- не транслируемых областях (UTR) у 47 детей с нефротическим синдромом (НС). Посредством высокопроизводительного секвени-рования полных последовательностей этих генов выявлено 22 SNP: из них 31,8% замен были синонимичными, 22,7% — не синонимичными и 45,5% — вариантами в UTR. Несмотря на относительно небольшой объем выборки, удалось установить 44,0% (для гена NPHS1) и 78,6% (для гена NPHS2) содержащихся в базе Ensemble SNP исследуемых областей. Распределение аллелей по выявленным SNP среди белорусских пациентов с НС совпадает с распределением аллелей в европейской популяции. Показано, что аллель А в локусе rs12406197 5' UTR гена NPHS2 ассоциирован с гематурией (OR 3,3 [1,30-8,69], p = 0,017) при НС, которая является предиктором неблагоприятного почечного прогноза. Этот же вариант на уровне тенденции чаще встречался при стероид-резистентной форме заболевания, чем при стероид-зависимой (OR 3,68 [1,08-12,6], p = 0,057).

Ключевые слова: нефротический синдром, стероид-резистентность, генетический полиморфизм, NPHS1, NPHS2.

Введение

Нефротический синдром (НС) представляет собой клинико-лабораторный симптомо-комплекс, характеризующийся протеинурией, гипопротеинемией с гипоальбуминемией, ги-перлипидемией и отеками. Ежегодная частота возникновения НС составляет 2-7 первичных случаев на 100 000 детского населения, распространенность — 12-16 случаев [1]. У большинства детей НС является идиопатическим. В 10-20% случаев у пациентов наблюдается отсутствие ответа на стандартную терапию глюкокортикоидами, или стероид-резистентность (СР), которая ассоциирована с высоким риском развития хронической почечной недостаточности (ХПН).

В основе патогенеза НС лежит увеличение проницаемости клубочкового фильтра вследствие функционального или структурного повреждения. Фильтрационный барьер состоит из эндотелия капилляров, базальной мембраны

и щелей между ножками подоцитов — особых эпителиальных клеток на внешней поверхности клубочкового фильтрационного барьера. Первым в качестве неотъемлемого компонента щелевой диафрагмы был идентифицирован белок нефрин, выполняющий как структурные, так и сигнальные функции [2].

Показано, что протеинурия, обусловленная нарушением синтеза нефрина, возникает на ранних стадиях повреждения клубочков, и существует положительная корреляция данного явления с тяжестью заболеваний почек [3].

Передача сигналов, индуцируемых нефри-ном, значительно усиливается подоцином, который связывается с цитоплазматическим хвостом нефрина [4]. Подоцин экспрессиру-ется почти исключительно в подоцитах клубочков. Нарушение передачи сигналов через комплекс нефрин-подоцин способствует развитию дисфункции подоцитов. На сегодняшний день накоплено довольно много данных

о связи дефектов подоцина с протеинурией и терминальной стадией хронической болезни почки (ХБП) как у животных, так и у людей. Так, нокаут гена прк82 приводит к протеинурии и ХБП у мышей, а унаследованные мутации ЫРИ82 являются основной причиной стероид-резистентного НС у детей, который неизменно прогрессирует до терминальной ХБП [5-9].

Следует отметить, что основной фокус внимания исследований изменчивости генов ЫРШ1, ЫРИ82 был направлен на обнаружение патогенных мутаций, и работы, посвященные изучению более частых вариантов, так называемых SNP, относительно редки. Чаще всего в них фигурирует миссенс-вариант p.R229Q гена ЫРЖ2.

Кроме того, общеизвестно, что значительная часть SNP, ассоциированных с развитием патологических состояний, локализована в неко-дирующих областях генов, и установление их функциональной значимости сильно осложнено. Генетические вариации в нетранслируемых областях могут модифицировать регуляторные элементы и тем самым влиять на взаимодействие UTR с белками и микроРНК. Изменение этих регуляторных механизмов способно нарушить нормальное протекание клеточных процессов, потенциально приводя к развитию заболевания. Имеются данные, что генетические вариации в UTR играют роль в развитии таких патологий, как болезнь Альцгеймера, синдром ломкой Х-хромосомы, биполярное расстройство, множественная миелома, мела-нома, рак молочной железы [10, 11].

Работы по изучению генетического полиморфизма генов ЫРИБ1 и ЫРИБ2 вне последовательности экзонов единичны, касаются промо-торной области и экзон-интронных границ гена ЫРИ82 в группах пациентов итальянского, индийского и китайского происхождения [12-15].

В данной статье представлены впервые полученные результаты анализа генетического полиморфизма полных последовательностей экзонов и нетранслируемых областей генов ЫРЖ1 и ЫРЖ2 у детей с НС в Республике Беларусь.

Материалы и методы

Исследуемая группа состояла из 47 пациентов с НС, проходивших лечение на базе педиатрического отделения № 1 (для нефрологи-

ческих больных) УЗ «2-я городская детская клиническая больница» г. Минска (табл. 1). В зависимости от морфологических изменений пациенты с НС разделены на группы: болезнь минимальных изменений (БМИ), фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), диффузный мезангиопролифератив-ный гломерулонефрит (ДМПГН). Геномную ДНК выделяли из образцов периферической цельной крови стандартным фенол-хлороформным методом. Полные последовательности генов NPHS1 и NPHS2 амплифицировали с помощью long-range ПЦР (фрагменты в 5,38,5 kb). Целевые бэнды вырезали из агарозного геля и очищали с помощью набора реагентов для выделения ДНК «Нуклеосорб», комплектация «G» (ОДО «Праймтех»). Для приготовления библиотек использовали набор реагентов «Illumina DNA Prep» (Illumina). Высокопроизводительное секвенирование проводили на платформе MiSeq (Illumina). Файлы .vcf генерировали с помощью инструментов, доступных на платформе Galaxy (http://usegalaxy.org). Аннотацию вариантов выполняли в веб-версии программного пакета ANNOVAR (http:// wannovar.wglab.org/). Для поиска полиморфных вариантов в экзонах и UTR-областях исследуемых генов использовали фильтр по частоте (>0,01). Для оценки выявляемости SNP в исследуемых кодирующих и нетранслиру-емых областях генов обратились к данным проекта Ensemble. К общим перечням вариантов применили следующие фильтры: «Global MAF: 0.011-0.5», «Class: SNP», «Consequences: only exonic + 5 prime UTR variant + 3 prime UTR variant». Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ IBM SPSS Statistics 22.0 (SPSS Inc.), STATISTICA 7.0 (Statsoft), MS Excel 2010. Статистическую значимость различий между изучаемыми группами определяли с помощью Wilcoxon Signed-Rank-test и двустороннего точного критерия Фишера. Об ассоциации генотипов или аллелей с заболеванием судили по величине показателя отношения шансов и 95% доверительного интервала. Различия считались статистически значимыми при p <0,05.

Результаты и обсуждение

Анализ полученных данных высокопроизводительного секвенирования позволил оце-

Таблица 1

Клинико-анамнестическая характеристика исследуемой группы пациентов

Группы и подгруппы исследования Число пациентов Пол Возраст (годы на момент обследования) Возраст дебюта заболевания (годы) Ответ на гормональную терапию Гематурия Артериальная гипертензия

n (%) м / ж n (%) Средняя (m ± SD) Медиана (25-75%) Средняя (m ± SD) Медиана (25-75%) СЧ /СР/СЗ n (%) Есть / нет n (%) Есть / нет n (%)

Общая группа 47 (100,0) 31 / 16 (66 / 34) 7 ± 5,28 5 (3-11) 3,2 ± 2,92 2,6 (0-16,8) 6/29 / 12 (13 / 62 /25) 17 / 30 (36 / 64) 18 / 29 (38 / 62)

Морфологические варианты НС по результатам нефробиопсии

БМИ 12 (25,5) 8 / 4 (67 / 33 ) 10 ± 4,81 10 (5,8-15) 2,8 ± 0,57 2,9 (2,5-3,3) 0 / 8 / 4 (0 / 67 / 33) 1 / 11 (8 / 92) 1 / 11 (8 / 92)

ФСГС 17 (36,2) 13 / 4 (77 / 23) 8 ± 5,87 5 (4-15) 4,5 ± 4,29 3 (2-3,8) 0 / 14 / 3 (0 / 82 / 18) 8 / 9 (47 / 53) 10 / 7 (59 / 41)

ДМПГН 11 (23,4) 8 / 3 (73 / 27) 5 ± 4,81 3 (1,3-8,5) 1,8 ± 1,70 1,6 (0,3-2,4) 0 / 9 / 2 (0 / 82 / 18) 5 / 6 (45 / 55) 7 / 4 (64 / 26)

Нефробиопсия не показана или не информативна 7 (14,9) 2 / 5 (29 / 71) 4 ± 1,91 4 (3-5,5) 2,5 ± 1,32 2,3 (2,1-3,5) 6 / 1 / 0 (86 / 14 / 0) 3 / 4 (43 / 57) 0 / 7 (0 / 100)

Примечание. т ± SD (среднее значение плюс, минус стандартное отклонение); стероид-чувствительный (СЧ), стероид-резистентный (СР), стероид-зависимый (СЗ); болезнь минимальных изменений (БМИ), фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), диффузный мезангиопролиферативный гломерулонефрит (ДМПГН)

нить полиморфизм генов NPHS1 и NPHS2 в исследуемой выборке пациентов с НС. Выявлено 22 полиморфных варианта в кодирующих и UTR-областях генов (табл. 2); в том числе 31,8% замен были синонимичными, 22,7% — не синонимичными и 45,5% — вариантами в UTR-областях.

База данных проекта Ensemble содержит информацию о 23 SNP в 29 экзонах и UTRs гена NPHS1 (при этом 12 замен являются довольно редкими полиморфными вариантами с частотой минорного аллеля от 1 до 5%) и 14 SNP в 8 экзонах и UTRs гена NPHS2 (из них 3 также имеют частоту минорного аллеля в пределах 1-5%). Таким образом, несмотря на относительно небольшой объем выборки, нам удалось установить 78,6% SNP исследуемых областей в гене NPHS2. Что касается гена NPHS1, то выявленных rs148755697 и rs113825926 не оказалось в полученном перечне SNP из Ensemble. Эти два варианта были автоматически отфильтрованы ввиду низкой общей частоты минорного аллеля (0,01 и 0,004

соответственно), в то время как частота в базе Gnomad (№Б), которую использовали для фильтрации данных, полученных в исследовании, составила 0,03173 и 0,01339, соответственно. С учетом этих двух вариантов в исследуемой выборке выявлено 44,0% известных в экзонах и нетранслируемых областях бкрб.

Все обнаруженные варианты содержатся в базе данных СНпУаг, и почти все из них классифицированы как доброкачественные/ вероятно доброкачественные, 1 патогенная/ вероятно патогенная несинонимичная замена и 1 замена неопределенного клинического значения в UTR.

Сравнение частот альтернативных аллелей в исследуемой выборке и в базе данных Gnomad_NFE не выявило статистически значимых различий (р-уаЫв = 0,7646 для ЫРИБ2 ир-уа1пв = 0,3652 для ЫРИБ1), то есть в целом распределение аллелей по выявленным БКР в генах ЫРИБ1 и ЫРИБ2 среди белорусских пациентов с НС совпадает с распределением аллелей в европейской популяции.

f то

I §

■3

с

a

О/ §

t\i re s

TO §

s3

to

to Og

Таблица 2

Перечень выявленных БЫР в генах ЫРН81, ЫРН82 с указанием частоты альтернативного аллеля в базах данных и в

исследуемой выборке

Ген rs Функциональное значение Альтернативный аллель Частота в Gnomad_total Частота в Gnomad NFE Частота в исследуемой выборке ClinVar (ID, классификация) GWAS Catalog

rsl079292 synonymous, p.G34G С 0,971 0,993 0,987 260424, В -

rsl410592 synonymous, p.A250A A 0,6184 0,6308 0,592 260432, В -

rs3738423 synonymous, p.S96S A 0,07543 0,08498 0,051 260426, B/LB -

rs3818587 synonymous, p.L278L С 0,07549 0,08503 0,122 260425, B/LB -

rsl2406197 5'UTR, C.-51G > T A 0,2458 0,2774 0,388 225144, В -

NPHS2 rsl410590 3'UTR, c.*157G>A T 0,9126 0,932 0,915 224483, В -

rsl410591 3'UTR, *54G > С G 0,6139 0,6299 0,592 293845, В -

rs2274622 3'UTR, c.*258A> G С 0,2334 0,2772 0,244 224485, В -

rs2274623 3'UTR, c.*200G> A T 0,162 0,2039 0,256 224484, В -

rsl060775 3'UTR, c.*428A> G С 0,9098 0,9318 0,913 224486, В -

rs61747728 missense, p.R229Q T 0,03025 0,03601 0,037 5370, Р (4); LP(3); VUS (8); В (1) +

rs2071327 synonymous, p.S1105S T 0,3939 0,3849 0,5 259497, В -

rs3 92702 synonymous, p.P440P A 0,04953 0,03287 0,024 259484, В -

rs437168 synonymous, p.V763V A 0,08751 0,03534 0,025 259489, В -

rs73928331 5'UTR, c.-81C >G С 0,1498 0,02989 0,024 328887, В -

rsl48755697 3'UTR, c.**529C >T A 0,02199 0,03173 0,026 328849, VUS -

NPHS1 rs71354105 3'UTR, c.*538G> A T 0,07071 0,1025 0,103 328848, LB -

rs80296922 3'UTR, c.*706A> G С 0,03692 0,05277 0,122 328846, LB -

rs33950747 missense, p.R408Q T 0,04859 0,06283 0,095 259482, B/LB -

rs3814995 missense, p.E117K T 0,3195 0,3102 0,329 259500, В +

rs4806213 missense, p.N1077S с 0,09709 0,0969 0,073 259496, В -

rsll3825926 missense, p.T294I A 0,00797 0,01339 0,024 259508, B/LB -

к» On

ib. Л.

ь g

ей s:

0 Я

го

1

Я о Й S

2 о та е-я

о-

х и

-ё я

а

(Я (Я ш я л о я р:

По данным GWAS Catalog, полиморфный вариант rs3814995 гена NPHS1 ассоциирован со скоростью гломерулярной фильтрации и уровнем сывороточного креатинина и витамина Д; rs61747728 гена NPHS2 — с уровнями тромбомодулина, рецептора фактора некроза опухоли II, витамина Д и диастоли-ческим артериальным давлением. Тромбоэм-болические осложнения являются достаточно распространенным явлением при НС [16]. Tkaczyk M. и др. показали, что у детей с НС обнаруживаются маркеры эндотелиальной дисфункции, в том числе повышенный тром-бомодулин (интегральный мембранный белок, рецептор тромбина, находящийся на клетках эндотелия кровеносных сосудов и участвующий в системе антикоагуляции), при этом их уровень коррелирует со степенью активности заболевания [17].

Полиморфный вариант rs61747728 (p.R229Q) гена NPHS2 ранее был описан как «не нейтральный» и ассоциирован с развитием микроальбуминурии в общей популяции [18]. В популяциях европейского происхождения частота минорного аллеля варьируется от 2 до 7% [19]. Гомозиготность по данному варианту не всегда приводит к развитию НС, что можно объяснить следующим: либо он не является патогенным сам по себе, либо его пенетрант-ность неполная. Kerti A. и др. предположили, что данный вариант не является каузальным, но модифицирует эффект вариантов в других генах [20]. Tory К. и др. проливает свет на механизм, посредством которого замена p.R229Q может обусловливать возникновение заболевания. Авторы показали, что данный вариант является причиной СР НС только при сочетании с некоторыми мутациями гена NPHS2, особенно в экзонах 7 и 8, которые приводят к заменам С-концевых аминокислот подоцина [21]. Это было подтверждено Phelan P. J. и др.: при СР НС патогенные мутации L327F у мальчика с ФСГС и A297V у девочки с БМИ (обе локализованы в экзоне 8) были выявлены в ком-паунд-гетерозиготе с вариантом R229Q [22].

Предположительно, негативный эффект варианта p.R229Q обусловлен нарушением гетеродимеризаци и локализации белка [21]. Анализ in silico, проведенный Joshi B. B. и др. также показал наибольший вероятно повреждающий эффект замены p.R229Q (по срав-

нению с р^35Б и р.Р20Ц) [15].

Показано, что у лиц, несущих p.R229Q в компаунд-гетерозиготе с патогенной мутацией в ЫРИ82, наблюдается менее тяжелое течение НС с более поздним началом заболевания, чем в случае пациентов с двумя патогенными мутациями [21]. В нашем исследовании полиморфный вариант ге61747728 p.R229Q обнаружен у двух пациентов (частота минорного аллеля 3,7%): в гетерозиготном состоянии при СЧ НС, возраст дебюта заболевания 3 года 6 месяцев и в гомозиготном состоянии при врожденном СР НС. Следует отметить, что в последнем случае у пациента помимо p.R229Q было выявлено две патогенных мутации в гене ЫРИ81 в гетерозиготном состоянии.

В связи с тем, что артериальная гипертензия (АГ) и гематурия (ГУ) при НС являются предикторами неблагоприятного прогноза, свидетельствующими о более тяжелом поражении почек [23], мы проанализировали наличие связи выявленных полиморфных вариантов генов ЫРИБ1 и ЫРИБ2 с данными клинико-лабора-торными проявлениями в исследуемой выборке. При этом в группе пациентов со СР НС распространенность ГУ была в 2,6 раза выше, чем при СЗ НС (43% против 16,6%), хотя эти различия и не достигли уровня статистической значимости (р = 0,15).

Как следует из данных таблицы 3, альтернативный аллель А в локусе ге12406197 5' гена ЫРИ82 значительно чаще обнаруживался среди пациентов с ГУ (56,6% против 28,0%, OR 3,3 [1,30-8,69], р = 0,017). Кроме того, в группе пациентов со СР НС данный вариант встречался в 2,2 раза чаще, чем в группе с СЗ НС (44,0% против 20,0%, OR 3,68 [1,08-12,6], р = 0,057).

В работе Wynn Б. R, посвященной проблеме долгосрочного прогноза для пациентов с НС, было показано, что СР является признаком неблагоприятного исхода заболевания. Среди пациентов, умерших от почечных причин, ГУ изначально присутствовала у 41,0% пациентов и АГ — у 22,0%, по сравнению с 14,0% и 10,0% соответственно, среди тех, кто был жив на момент проведения исследования [24]. Также есть данные о том, что ГУ значительно чаще наблюдается (р = 0,008) у пациентов с часто рецидивирующим НС (два и более рецидива в течение шести месяцев после пер-

I

то

I

а: §

■3

¡г

о

О/

а: §

а:

то

2 §

53

Од

У"

(о С5 (о Од

Распределение частот аллелей в полиморфных локусах генов ЫРН81 и ЫРН82 при различных вариантах НС

Таблица 3

Ген Г8 Аллель Частота, %

СРНС сзнс Р-Л'а1ие АГ+ АГ- Р-л'а1ие ГУ+ ГУ- Р-гаЫе

ге1079292 С 1 0,95 0,29 1,0 0,98 1,0 1 0,98 1,0

ге1410592 А 0,652 0,389 0,77 0,61 0,59 1,0 0,57 0,60 0,81

ге3738423 А 0,063 0,056 1,0 0,1 0,02 0,29 0,066 0,04 0,99

ге3818587 С 0,06 0,1 0,62 0,09 0,04 0,64 0,06 0,04 1,0

ЫРЖ2 ге12406197 А 0,44 0,2 0,057 ОЫ 3,68 [1,08-12,6] 0,47 0,33 0,24 0,566 0,28 0,017 оыз,з [1,30-8,69]

ге1410590 Т 0,92 0,85 0,66 0,94 0,89 0,69 0,906 0,92 1,0

ге1410591 в 0,652 0,389 0,09 0,61 0,59 1,0 0,57 0,60 0,81

ге2274622 С 0,28 0,2 0,56 0,25 0,25 1,0 0,16 0,30 0,19

ге2274623 т 0,196 0,35 0,21 0,21 0,27 0,78 0,25 0,26 1,0

ге1060775 с 0,917 0,85 0,66 0,93 0,89 0,7 0,90 0,92 1,0

ге61747728 т 0,038 0 1,0 0,058 0,02 0,57 0,058 0,021 0,57

ге2071327 т 0,479 0,5 1,0 0,44 0,54 0,49 0,47 0,52 0,81

геЗ 92702 А 0,04 0 1,0 0,066 0 0,13 0,066 0 0,13

ге437168 А 0,042 0 0,57 0,066 0 0,13 0,066 0 0,14

ге73928331 С 0,038 0 1,0 0,058 0 0,17 0,063 0 0,14

ге148755697 А 0,045 0 0,54 0,035 0,02 1,0 0 0,04 0,55

ЫРЖ1 ге71354105 Т 0,114 0,136 1,0 0,14 0,08 0,46 0,12 0,1 1,0

ге80296922 С 0,114 0,111 1,0 0,07 0,16 0,46 0,038 0,166 0,14

ге33950747 т 0,06 0,182 0,19 0,06 0,12 0,47 0,093 0,96 1,0

К538 1 49 95 т 0,312 0,273 0,78 0,30 0,34 0,8 0,3 0,35 0,81

ге4806213 с 0,04 0 1,0 0,06 0,08 1,0 0,13 0,04 0,18

ге113825926 А 0,019 0 1,0 0,03 0,02 1,0 0,058 0 0,16

к» 00

л. §

Ой г:

0 Я

го

1

Я

о Й я

2 О

та е-я

о-

х »

ё я

3 »

И

ш я л о я р:

воначального ответа на терапию или четыре и более рецидива в течение одного года) [25].

Хотя непосредственно вариант rs12406197 (c.-51G > T) гена NPHS2 в базе данных ClinVar обозначен как доброкачественный, в этой же базе содержится запись о патогенном га-плотипе c.[-52C > G(;)-51G > T] (Variation ID: 225143). Считается, что мутации NPHS2 связаны с патологией почек по аутосомно-ре-цессивному типу, то есть требуют наличия в генотипе гомозиготного варианта или компа-унд-гетерозиготы, и значение случаев только с одним гетерозиготным вариантом не вполне понятно. Развитие заболевания, вероятно, связано с наличием дополнительных мутаций в регуляторных регионах гена, либо мутации NPHS2 взаимодействуют с другими генами и вносят вклад в развитие заболевания только в определенном генетическом окружении [5].

Oleggini R. и др. показали, что область промотора гена NPHS2 с позиции -628 до ATG-кодона может специфически направлять экспрессию подоцина в разных клеточных линиях, включая клетки гломерулярного эпителия [26]. Так, в работе Di Duca M. и др. выявлены три функциональных полиморфных варианта в промоторе NPHS2 (-51T, -116T и -535 insCTTTTTT3), которые определяли значительное снижение (на 73,0; 59,0; и 82,0%, соответственно) экспрессии гена-репортера в трансфецированных подоцитах. Кроме того, авторы показали, что дикие варианты аллелей образовывали специфичные комплексы ДНК-белок. В случае с аллелем -51G, комплекс формировался с фактором USF1 (upstream stimulatory factor-1) [12], что может свидетельствовать в пользу функционального значения нуклеотидной замены rs12406197 (c.-51G > T).

Таким образом, полиморфный локус rs12406197, расположенный в 5' UTR гена NPHS2, ассоциирован с ГУ при НС у детей в Республике Беларусь.

Следует отметить, что исследуемая в настоящей работе выборка на 87,0% состоит из пациентов со СР и СЗ НС. Это не дает возможности оценить локус rs12406197 на предмет ассоциации с часто рецидивирующим течением НС у детей в Республике Беларусь в рамках представленной статьи. Однако анализ полученных результатов в совокупности с данными

из источников литературы позволяет предположить, что такая связь может существовать, и rs12406197 — потенциальный ДНК-маркер, который в комплексе с другими клинико-ла-бораторными данными может быть применен для выделения пациентов с НС в группу высокого риска частых рецидивов заболевания.

Заключение

С помощью высокопроизводительного сек-венирования исследован спектр полиморфных вариантов кодирующих и нетранслируемых областей генов нефрина (NPHS1) и подоцина (NPHS2) у педиатрических пациентов с неф-ротическим синдромом.

Было идентифицировано 22 полиморфных варианта с частотой альтернативного аллеля в европейской популяции от 1,3 до 99,3%. Значительная часть замен — 45,5% — локализована в нетранслируемых областях генов, 31,8% замен были синонимичными, 22,7% — не синонимичными.

Показано, что аллель А в локусе rs12406197 в 5' UTR гена NPHS2 ассоциирован с гематурией (OR 3,3 [1,30-8,69], p = 0,017), которая является предиктором неблагоприятного прогноза при нефротическом синдроме. Этот же вариант на уровне тенденции чаще встречался при стероид-резистентной форме заболевания, чем при стероид-зависимой (OR 3,68 [1,0812,6], p = 0,057). Таким образом, данный локус можно рекомендовать в качестве ДНК-маркера для определения стратегии лечения и прогноза заболевания у пациентов с НС.

Работа выполнена в рамках задания 2.2.4 ГПНИ «Биотехнологии-2» на 2021-2025 гг.

Список использованных источников

1. Детская нефрология / под ред. Э. Лой-манн, А. Н. Цыгин, А. А. Саркисян. - Москва: Литтера, 2010. - 390 с.

2. Patrakka, J. Nephrin — a unique structural and signaling protein of the kidney filter / J. Patrakka, K. Tryggvason // Trends in molecular medicine. - 2007. - Vol. 13, № 9. - P. 396-403.

3. Nephrin — a biomarker of early glomerular injury / Y. Kandasamy [et al.] // Biomarker research. - 2014. - Vol. 2, № 21. - P. 1-8.

4. Interaction with podocin facilitates nephrin signaling / T. B. Huber [et al.] // Journal of

biological chemistry. - 2001. - Vol. 276, № 45.

- P. 41 543-41 546.

5. Identification of podocin (NPHS2) gene mutations in African Americans with nondiabetic end-stage renal disease / J. A. Dusel [et al.] // Kidney Int. - 2005. - Vol. 68. - P. 256-262.

6. Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice / S. Roselli [et al.] // Mol. Cell Biol. - 2004. -Vol. 24. - P. 550-560.

7. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome / N. Boute [et al.] // Nat. Genet. - 2000. - Vol. 24. - P. 349-354.

8. Recurrence of focal segmental glomerulosclerosis after renal transplantation in patients with mutations of podocin / R. Bertelli [et al.] // Am. J. Kidney Dis. - 2003. - Vol. 41. - P. 1 314-1 321.

9. Caridi, G. NPHS2 (Podocin) mutations in nephrotic syndrome. Clinical spectrum and fine mechanisms / G. Caridi, F. Perfumo, G. M. Ghig-geri // Pediatr. Res. - 2005. - Vol. 57. - P. 54-61.

10. Genome-wide functional screen of 3' UTR variants uncovers causal variants for human disease and evolution / D. Griesemer [et al.] // Cell. - 2021. - Vol. 184, № 20. - P. 5 247-5 260.

11. Genetic variants in mRNA untranslated regions / M. Steri [et al.] // Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. - 2018. - Vol. 9, № 4. - e1474.

12. Cis and trans regulatory elements in NPHS2 promoter: Implications in proteinuria and progression of renal diseases / M. Di Duca [et al.] // Kidney international. - 2006. - Vol. 70, № 7. -P. 1 332-1 341.

13. Molecular analysis of NPHS2 and ACTN4 genes in a series of 33 Italian patients affected by adult-onset nonfamilial focal segmental glomerulosclerosis / F. Aucella [et al.] // Nephron Clinical Practice. - 2005. - Vol. 99, № 2. - P. c31-c36.

14. Mutations in NPHS2 in familial steroid-resistant nephrotic syndrome in Southern Chinese Han ethnic group / R. Fu [et al.] // Zhonghua er ke za zhi = Chinese Journal of Pediatrics. - 2008.

- Vol. 46, № 8. - P. 591-596.

15. Characterization of NPHS2 gene polymorphisms associated to steroid resistance nephrotic syndrome in Indian children / B. B. Joshi [et al.] // Gene. - 2017. - Vol. 628. - P. 134-140.

16. Singhal, R. Thromboembolic complications

in the nephrotic syndrome: pathophysiology and clinical management / R. Singhal, K. S. Brimble // Thrombosis research. - 2006. - Vol. 118, № 3.

- P. 397-407.

17. Markers of endothelial dysfunction in children with idiopathic nephrotic syndrome / M. Tkaczyk [et al.] // American journal of nephrology. - 2008. - Vol. 28, № 2. - P. 197-202.

18. NPHS2 R229Q functionalvariant is associated with microalbuminuria in the generalpopulation / A. C. Pereira [et al.] // Kidney Int. - 2004. - Vol. 65. - P. 1 026-1 030.

19. NPHS2 gene, nephrotic syndrome and focal segmental glomerulosclerosis: a HuGE review / N. Franceschini [et al.] // Genetics in Medicine.

- 2006. - Vol. 8, № 2. - P. 63-75.

20. NPHS2 homozygous p.R229Q variant: potential modifier instead of causal effect in focal segmental glomerulosclerosis / A. Kerti [et al.] // Pediatr. Nephrol. - 2013. - Vol. 28, № 10. -P. 2 061-2 064.

21. Mutation-dependent recessive inheritance of NPHS2-associated steroid-resistant nephrotic syndrome / K. Tory [et al.] // Nat. Genet. - 2014.

- Vol. 46, № 3. - P. 299-304.

22. Variability in phenotype induced by the podocin variant R229Q plus a single pathogenic mutation / P. J. Phelan [et al.] // Clinical Kidney Journal. - 2015. - Vol. 8, № 5. - P. 538-542.

23. Клинические и морфологические особенности фокально-сегментарного гломеруло-склероза у детей казахской национальности / А. Е. Наушабаева [и др.] // Клиническая нефрология. - 2013. - № 2. - С. 51-53.

24. Wynn, S. R. Long-term prognosis for children with nephrotic syndrome / S. R. Wynn, G. B. Stickler, E. C. Burke // Clinical pediatrics.

- 1988. - Vol. 27, № 2. - P. 63-68.

25. Ali, S. H. The predictive factors for relapses in children with steroid-sensitive nephrotic syndrome / S. H. Ali, A. M. Ali, A. H. Najim // Saudi Journal of Kidney Diseases and Transplantation. - 2016. - Vol. 27, № 1. -P. 67-72.

26. Rare functional variants ofpodocin (NPHS2) promoter in patients with nephrotic syndrome / R. Oleggini [et al.] // GeneExpr. -2006. - Vol. 13. - P. 59-66.

H. A. Yatskiu1, N. V. Nikitchenko1, H. G. Bialkevich2, I. A. Kazyra2, R. I. Goncharova1

THE SPECTRUM OF POLYMORPHIC VARIANTS IN EXONS AND UTRS OF NPHS1 AND NPHS2 GENES IN PATIENTS WITH NEPHROTIC

SYNDROME

1 State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: a.yatskiv@igc.by ^Educational Institution "Belarusian State Medical University" 83 Dzerzhinsky Ave., 220083 Minsk, the Republic of Belarus

Polymorphic variants in coding and untranslated regions (UTRs) of NPHS1 and NPHS2 genes of 47 children with nephrotic syndrome (NS) were studied using complete sequences obtained with NGS technology. 22 SNPs were identified: 31.8% of the substitutions were synonymous, 22.7% were non-synonymous, and 45.5% were UTR variants. Despite the relatively small sample size, it was possible to establish 44.0% and 78.6% of the SNPs of the studied regions listed in the Ensemble database for NPHS1 and NPHS2 genes respectively. The distribution of alleles in these loci among Belarusian patients with NS did not differ from the distribution of alleles in the European population. Allele A in the rs12406197 locus of the 5'-UTR of the NPHS2 gene was shown to be associated with hematuria (OR 3.3 [1.30-8.69], p = 0.017) in NS, which is known to be a predictor of poor renal prognosis. The same variant at the trend level was more common in the steroid-resistant form of the disease than in the steroid-dependent one (OR 3.68 [1.08 - 12.6], p = 0.057).

Keywords: nephrotic syndrome, steroid resistance, genetic polymorphism, NPHS1, NPHS2.

Дата поступления в редакцию: 24 августа 2023 г.