CC BY
77
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
УДК 618.396-039.41-092:612.017.1]-078.33
Менжинская И.В., Кашенцева М.М., Ионанидзе Т.Б., Ванько Л.В., Сухих Г.Т.
СПЕКТР АНТИФОСФОЛИПИДНЫХ АНТИТЕЛ У ЖЕНЩИН С ПРИВЫЧНЫМ НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ И ИХ ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, 117997, г Москва
Антитела к кардиолипину (аКЛ) и р2-гликопротеину-1 (ар2-ГПЧ) относятся к классификационным критериям анти-фосфолипидного синдрома (АФС). Антифосфолипидные антитела (аФЛ), направленные к другим фосфолипидам (фосфатидилсерину (аФС), фосфатидилэтаноламину (аФЭ) и фосфолипид-связывающим протеинам (протромбину (аПТ), комплексу ФС-ПТ, аннексину V (аАнV), рассматриваются как перспективные маркеры АФС, одним из клинических проявлений которого является привычная потеря беременности (ППБ). Цель исследования определить спектр аФЛ у женщин с пПб и выявить факторы риска ранних потерь беременности. С помощью ИФА аФЛ были выявлены у 56 (61,5%) пациенток с ППБ неясного генеза (n = 91): аКЛ и/или ар2-ГП- - у 31 (34,1%), аФЛ другой специфичности - у 51 (56%) пациентки. Частота выявления IgM и IgG к Р2-ГПЧ, АнУ, IgG к КЛ, ФЭ, комплексу ФС-ПТ и их средний уровень в сыворотке крови были выше у пациенток с ППБ, чем у здоровых женщин (n = 104) (p < 0,05). Наиболее высокие значения OR (9,5 и 8,5; p < 0,01) были получены для IgG к Р2-ГП-1 и АнУ, значения AUC для них составили 0,710 и 0,746 (p < 0,001). У пациенток, серонегативных на аКЛ и ар2-ГП-1, часто выявлялись аАнУ (25%) и аФЭ (15%), аАнУ - чаще, чем аФС-ПТ, аПТ и аФС (p < 0,05). Среди аКЛ, ар2-ГП-1 и аАнУ преобладали IgG со средним (30-70%) и высоким (> 70%) индексом авидности. IgG были представлены четырьмя подклассами, среди аКЛ и ар2-ГП-1 преобладал подкласс IgG2. Таким образом, IgM и IgG к Р2-ГП-1, АнУ, IgG к КЛ, ФЭ и комплексу ФС-ПТ значительно ассоциируются с ППБ; IgG к Р2-ГП-! и АнУ могут рассматриваться как факторы риска ранней потери беременности. Антитела к АнУ представляют перспективный серологический маркер для диагностики АФС.
Ключевые слова: антифосфолипидные антитела; антифосфолипидный синдром; привычная потеря плода;
антитела к @2-гликопротеину-1; антитела к кардиолипину; антитела к аннексину V; антитела к комплексу фосфатидилсерин-протромбин; антитела к фосфатидилэтаноламину. Для цитирования: Менжинская И.В., Кашенцева М.М., Ионанидзе Т.Б., Ванько Л.В., Сухих Г.Т. Спектр антифосфо-липидных антител у женщин с привычным невынашиванием беременности и их диагностическое значение. Иммунология. 2016; 37 (1): 4-9. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-1-4-9.
Menzhinskaya I.V., Kashentseva M.M., Ionanidze T.B., Van'ko L.V., Sukhikh G.T.
RANGE OF ANTIPHOSPHOLIPID ANTIBODIES IN WOMEN WITH RECURRENT MISCARRIAGE AND THEIR DIAGNOSTIC YALUE
V.I. Kulakov Scientific center for obstetrics, gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russian, 117997, Moscow, Russia
Antibodies to cardiolipin (ACL) and p2-glycoprotein-I (ар2^Р-!) belong to the classification criteria of antiphospholipid syndrome (APS). Antiphospholipid antibodies (AFL) are directed to other phospholipids (phosphatidylserine (APs), phos-phatidylethanolamine (APE)) and phospholipid-binding proteins (prothrombin (apt), the complex of EF-TU, annexin У (аАнУ)), are considered as promising markers of the ASF, one of the clinical manifestations of which is habitual pregnancy loss (PPB). The purpose of the study to determine the spectrum of the AFL in women with PPB and to identify risk factors of early pregnancy losses. Using ELISA AFL were detected in 56 (61,5%) patients with PPB of unknown origin (n = 91): ACL and/or P2-GP-I-31 (34,1%), another AFL specificity - in 51 (56%) patients. The frequency of detection of IgM and IgG antibodies to P2-GP-I, АнУ, IgG to CL, FE, the complex of EF-TU and their levels in serum were higher in patients with PSP than in healthy women (n = 104) (p < 0,05). The highest values of OR (9,5; 8,5; p < 0,01) were obtained for IgG antibodies to P2-GP-I and АнУ, the values of AUC for them was and 0,710 0,746 (p < 0.001). In patients, seronegative for ACL and ар2^-!, often identified аАнУ (25%) and AFA (15%), аАнУ - more often than APs-PT, apt and APs (p < 0,05). Among ACL, аp2-GP-I and аАнУ prevailed IgG with medium (30-70%) and high (> 70%) the index of avidity. IgG were represented by four subclasses, among ACL and аp2-GP-I was dominated by the IgG2 subclass. Thus, IgM and IgG antibodies to P2-GP-I, АнУ, IgG of CL, PE and PS-PT is significantly associated with PPB; IgG antibodies to P2-GP-I and АнУ can be considered as risk factors for early pregnancy loss. Antibodies to АнУ represent a promising serological marker for the diagnosis of ASF. Key words: antiphospholipid antibodies; antiphospholipid syndrome; habitual fetal loss; antibodies to p2-glycoprotein-I; antibodies to cardiolipin; antibodies to annexin У; antibodies to a complex of phosphatidylserine-prothrombin; antibodies to phosphatidylethanolamine.
Для корреспонденции: Менжинская Ирина Владимировна (Menzhinskaya I.V.) - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, E-mail: [email protected]
ORIGINAL ARTICLE
citation: Menzhinskaya I.V., Kashentseva M.M., Ionanidze T.B., Van'ko L.V., Sukhikh G.T. Range of antiphospholipid antibodies in women with recurrent miscarriage and their diagnostic value. Immunologiya. 2016; 37 (1): 4-9. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-1-4-9.
For correspondence: Menzhinskaya Irina Vladimirovna, candidate of medical Sciences, senior researcher of laboratory
of clinical immunology "V. I. Kulakov Scientific center for obstetrics, gynecology and Perinatology". Ministry of Health of Russia, E-mail: [email protected]
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Funding. The study had no sponsorship.
Received 04.03.15 Accepted 18.06.15
Антифосфолипидный синдром (АФС) является системным аутоиммунным заболеванием и характеризуется повторными артериальными и/или венозными тромбозами и/или акушерскими осложнениями, главным образом, привычной потерей беременности (ППБ), ассоциированными с анти-фосфолипидными антителами (аФЛ). К лабораторным классификационным критериям АФС, принятым в настоящее время, относят наличие антител класса ^М и /или IgG к кар-диолипину (КЛ) в среднем или высоком титре (выше 99-го процентиля нормальной популяции), к р2-гликопротеину-1 (Р2-ГП-1) (выше 99-го процентиля) и волчаночного антикоагулянта (ВА) [1].
Однако аФЛ представляют собой гетерогенное семейство антител, которые реагируют с анионными фосфолипидами, фосфолипид-связывающими протеинами плазмы (главным образом, Р2-ГП-1, протромбином, аннексином V, протеином С, протеином S, окисленными липопротеинами низкой плотности) и комплексами фосфолипид-протеин [2]. Поэтому проведение более широкого исследования антител к другим мембранным фосфолипидам, протеинам и их комплексам значительно повышает эффективность диагностики АФС, особенно у больных, серонегативных по критериям АФС. По данным рабочей группы XIII Международного конгресса по антифосфолипидным антителам (2010; Гальвестон, США), наиболее перспективными на включение в классификационные критерии АФС являются антитела к фосфатидилэтано-ламину (ФЭ), фосфатидилсерину (ФС), протромбину (ПТ) и комплексу фосфатидилсерин-протромбин (ФС-ПТ), антитела к домену I молекулы Р2-ГП-1, ^А к КЛ и Р2-ГП-1, а также тест на резистентность к антикоагулянтной активности ан-нексина V (Ан V) [3].
Аутоиммунные нарушения относятся к ведущим причинам ППБ и встречаются у 20% женщин с данной патологией [4, 5]. Антифосфолипидные антитела являются одним из наиболее частых аутоиммунных этиологических факторов ППБ. От 7 до 25% случаев необъяснимых привычных выкидышей ассоциируются с наличием аФЛ. У женщин с потерей беременности распространенность аФЛ колеблется от 4,6 до 50,7% и в среднем составляет 15,5%, а распространенность ВА варьирует от 0 до 14% и в среднем составляет 8,3% [6].
На основе наблюдений, проведенных в течение последних 10 лет, установлены различия между акушерским АФС и сосудистым АФС [7]. Показано, что у пациентов может наблюдаться сосудистый тромбоз без осложнений беременности или, напротив, только акушерские проявления АФС. Одновременно тромбоз и самопроизвольный выкидыш развиваются всего в 2,5-5% случаев беременностей на фоне АФС [6].
Антифосфолипидные антитела имеют диагностическое, патогенетическое и предиктивное значение как для сосудистого так и для акушерского АФС [8-11]. Постоянное присутствие аФЛ в крови служит фактором риска тромбоза и самопроизвольной потери беременности. Воздействуя на различные механизмы, аФЛ способствуют развитию состояния гиперкоагуляции на системном или локальном уровне в плодово-материнском кровотоке, нарушению плацентации
и развитию локального воспаления. Тромбофилическое состояние поддерживается воздействием аФЛ как на растворимые компоненты, так и на различные клетки, вовлеченные в каскад коагуляции. В результате этого нарушается функция естественных антикоагулянтов, ингибируется система протеин C/S и фибринолиз, активируется система комплемента. Взаимодействие аФЛ с фосфолипид-связывающими протеинами, экспрессированными на мембранах клеток (эндотели-альных, моноцитов, тромбоцитов), приводит к активации эндотелиальных клеток, повышению синтеза тромбокса-на, активации тканевого фактора и продукции цитокинов. Антифосфолипидные антитела снижают антикоагулянтную активность аннексина V и разрушают защитный аннекси-новый щит на фосфолипидной поверхности трофобласта и эндотелия сосудов. Более того, аФЛ способствуют нарушению плацентации вследствие прямого повреждения клеток, индукции апоптоза, ингибирования пролиферации и образования синцития, нарушения инвазии трофобласта, блокирования эндометриального ангиогенеза, и снижают продукцию хорионического гонадотропина [7, 10].
Большинство оригинальных статей были посвящены исследованию ассоциации между антителами к КЛ, ВА и ранним привычным выкидышем, реже исследовалось значение антител к Р2-ГП-1, в малом количестве статей с противоречивыми результатами оценивалось значение других аФЛ, которые не являются критериями АФС [12]. В связи с этим цель настоящего исследования состояла в изучении спектра аФЛ, включающего, кроме критериев АФС, антитела к АнУ, ПТ, комплексу ФС-ПТ, ФЭ, у женщин с привычным невынашиванием беременности и выявлении факторов риска ранних потерь беременности.
Материал и методы
В исследование были включены женщины с привычным невынашиванием беременности, проходившие клиническое и лабораторно-инструментальное обследование в НЦАГиП им. В.И. Кулакова. Иммунологические исследования включали определение методом иммуноферментного анализа (ИФА) широкого спектра аФЛ классов IgM и IgG: антител к КЛ (аКЛ), Р2-ГП-1 (ар2-ГП-Г), ФС (аФС), АнУ (аАнУ), ПТ (аПТ) с использованием наборов Orgentec Diagnostika (Германия), антител к ФЭ (аФЭ), к комплексу ФС-ПТ (аФС-ПТ) с использованием наборов AESKULISA (AESKU.DIAGNOS-TICS, Германия).
С помощью ИФА определяли подклассы IgG и авид-ность аФЛ. Для определения подклассов IgG использовали конъюгаты мышиных моноклональных антител с биотином к IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека (Sigma Aldrich, США) в разведениях 1:2000, 1:12000, 1:2500, 1:2500; конъюгат стреп-тавидина с пероксидазой хрена (Sigma Aldrich.) в разведении 1:2000. Образцы сыворотки крови исследовали в разведении 1:100. Инкубации проводили на встряхивателе при 20±2oC в течение 1 ч, с конъюгатом стрептавидина - в течение 30 мин. Оптическую плотность (ОП) измеряли на фотометре MULTI-SKAN EX (Thermo Electron (Shanghai) Instrument Co., Китай) при длине волны 450 нм. Результат считали положительным,
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица
Частота выявления аФЛ (IgM, IgG) в сыворотке крови у пациенток с привычной потерей беременности и здоровых женщин при определении методом ИФА
Наименование антител и класс иммуноглобулинов
Частота выявления аФЛ в исследуемых группах, абс. ч. (%)
пациентки с ППБ
здоровые женщины
OR
аКЛ IgM 11 (12,1) 4 (3,8) 0,0571 3,44 [1,05-11,2] 0,0405
IgG 11 (12,1) 2 (1,9) 0,0104 7,01 [1,51-32,54] 0,0129
аР2-ГШ IgM 16 (17,6) 3 (2,9) 0,0117 7,18 [2,02-25,54] 0,0023
IgG 20 (22) 3 (2,9) 0,0001 9,48 [2,71-33,13] 0,0004
аФС IgM 7 (7,7) 2 (1,9) 0,1129 4,25 [0,86-21,0] 0,0759
IgG 7(7,7) 2 (1,9) 0,1129 4,25 [0,86-21,0] 0,0759
аАн У IgM 14 (15,4) 3 (2,9) 0,0047 6,12 [1,7-22,05] 0,0056
IgG 13 (14,3) 2 (1,9) 0,0029 8,5 [1,86-38,77] 0,0057
аПТ IgM 5(5,5) 2 (1,9) 0,3353 2,97 [0,56-15,67] 0,2007
IgG 4 (4,4) 1 (1) 0,2983 4,74 [0,52-43,16] 0,1678
аФС-ПТ IgM 11 (12,1) 4 (3,8) 0,0571 3,44 [1,05-11,20] 0,0405
IgG 14 (15,4) 3 (2,9) 0,0047 6,12 [1,7-22,05] 0,0056
аФЭ IgM 12 (13,2) 5 (4,8) 0,0688 2,48 [0,89-6,91] 0,0819
IgG 14 (15,4) 4 (3,8) 0,0109 4,55 [1,44-14,36] 0,0099
если средняя ОП исследуемого образца сыворотки крови превышала более чем на три стандартных отклонения среднюю ОП контрольных сывороток здоровых женщин.
Авидность аФЛ антител определяли методом ИФА с использованием хаотропного агента на этапе связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе, как описано S. Сисшк и соавт. [13]. Образцы сыворотки крови разводили в буферном растворе, содержащем повышенную концентрацию №С1 (0,5 М). Индекс авидности (ИА) рассчитывали по формуле: ИА = ОП1 х 100/ОП2 где ОП1 - ОП в лунках, в которых реакция антиген-антитело проводили в буфере, содержащем 0,5 М №С1; ОП2 - ОП в лунках, в которых использовали реакционный буфер, содержащий 0,15 М №С1.
В исследуемую группу включили 91 женщину с ранней ППБ неясного генеза со средним возрастом 30,5±5,0 лет и средним количеством потерь беременности в анамнезе 2,35±1,54 случаев. У 73 пациенток наблюдались по две последовательные потери беременности, у 18 пациенток - по 3 и более потери беременности в I триместре. В анамнезе у пациенток отмечались следующие гинекологические заболевания: эндометрит (у 10 (11%)), эндометриоз (у 12 (13,2%)), хронический сальпингоофорит (у 14 (15,4%)), цервицит (у 6 (6,6%)), инфекции половых органов (у 34 (37,4%)). Из экс-трагенитальной патологии наиболее часто наблюдались аллергии (у 19 (20,9%)), хронический тонзиллит (у 11 (12,1%)), хронические воспалительные заболевания органов мочевы-делительной системы (у 13 (14,3%)) и желудочно-кишечного тракта (у 7 (7,7%)). У 3 пациенток в анамнезе отмечался тромбоз глубоких вен нижних конечностей. Из исследования исключали пациенток с тяжелыми соматическими и аутоиммунными заболеваниями, пороками развития половых органов, носительством хромосомных перестроек, генетическими аномалиями плода, выраженными эндокринными нарушениями, инфекциями, передаваемыми половым путем. Контрольную группу составили 104 здоровые женщины со
средним возрастом 31,28±3,11 лет и с одной или двумя физиологическими беременностями в прошлом.
Статистический анализ полученных данных выполняли с использованием электронных таблиц Microsoft Excel, пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 10 (StatSoft Inc., США), MedCalc v. 12. Нормальность распределения значений в выборках оценивали с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий между группами определяли с использованием Х2-теста при сравнении частотных показателей, U-теста Манна-Уитни при сравнении непрерывных величин, для выявления взаимосвязи между переменными рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена, наличие связи между независимыми переменными и зависимой бинарной переменной оценивали с помощью анализа логистической регрессии и ROC-анализа. Различия считали статистически значимыми приp < 0,05.
Результаты и обсуждение
Среди пациенток с ППБ повышенные уровни аФЛ были обнаружены у 56 (61,5%) женщин: аКЛ - у 20 (22%), а|32-Ш-1 - у 29 (31,9%), аФС - у 14 (15,4%), аФЭ - у 20 (22%), аАнУ - у 23 (25,3%), аПТ - у 8 (8,8%), аФС-ПТ - у 19 (20,9%) пациенток. Антитела к Р2-ГП-1 выявлялись статистически значимо чаще, чем аФС (p = 0,0145) и аПТ (p = 0,0002), и несколько чаще, чем аФЛ другой специфичности. Частота выявления аФЛ классов IgM и IgG приведена в табл. 1. Антитела к Р2-ГП-1 и АнУ классов IgM и IgG, а также IgG к КЛ, ФЭ, комплексу ФС-ПТ выявлялись статистически значимо чаще у пациенток с ППБ, чем у здоровых женщин; наибольшие значения отношения шансов были получены для IgG к р2-ГП-I и АнУ (OR 9,48 и 8,5;p < 0,01).
Как известно, среди фосфолипид-связывающих протеинов Р2-ГП-! рассматривается как главная мишень аФЛ. р2-ГП-Ьзависимые аФЛ обладают специфическим тропизмом к плацентарной ткани, по-видимому, вследствие повышенной локальной экспрессии Р2-ГП-! на клетках трофобласта и децидуальных клетках [11]. Под их влиянием нарушаются некоторые функции клеток трофобласта, что приводит к дефектной плацентации. В то же время образование комплекса Р2-ГП-! с антителами может активировать комплемент, индуцируя местное воспалительное повреждение. Несмотря на то, что ФС экспонируется на поверхности клеток в течение дифференциации трофобласта и образования синцития, по данным Alijotas-Reig J. et al. [14], именно ар2-ГП-[, а не аФС, ассоциируются с привычным выкидышем и необъяснимыми потерями плода и должны рассматриваться как фактор риска потери беременности, что подтверждается результатами нашего исследования.
Недавно показана значительная ассоциация аФС-ПТ с венозным тромбозом, акушерскими осложнениями и активностью волчаночного антикоагулянта [15]. Atsumi T. et al. продемонстрировали, что антитела к комплексу ФС-ПТ по диагностической значимости для АФС не уступают аКЛ [16].
В табл. 2 представлены результаты определения уровня аФЛ классов IgM и IgG в сыворотке крови у пациенток с ППБ с указанием медианной величины и диапазона значений. Медианные уровни всех аФЛ были статистически значимо выше у пациенток с ППБ, чем у здоровых женщин (p < 0,05). У трех пациенток, позитивных на аФЛ, со случаями венозного тромбоза в анамнезе уровень IgG к КЛ и Р2-ГП-! был значительно выше (103,2±30,7; 120,3±85,7), чем у пациенток без тромботических осложнений (19,2±8,1; 17,9±17,6; p = 0,0357
ORIGINAL ARTICLE
Таблица 2
средний уровень аФЛ в сыворотке крови у пациенток с привычной потерей беременности и здоровых женщин при определении методом ИФА
Наименование антител и класс иммуноглобулинов Медианный уровень аФЛ в исследуемых группах, Ед/мл Р
пациентки с ППБ (n = 91) здоровые женщины (n = 104)
аКЛ IgM 1,8 [0,5-66,5] 1,25 [0,5-15,6] 0,0338
IgG 2,4 [0,5-185] 1,9 [0,5-12,5] 0,0209
аР2-ГШ IgM 2,4 [0,5-68,7] 2,1 [0,5-6,5] 0,0035
IgG 2,9 [0,5-217,1] 1,85 [0,5-7,4] 0,0012
аФС IgM 2,0 [0,5-69,8] 1,8 [0,5-12,1] 0,0405
IgG 2,4 [0,7-177] 2,1 [0,5-13,6] 0,0381
аАнУ IgM 2,8 [0,8-7,8] 2,55 [0,5-5,9] 0,0114
IgG 3,4 [1,5-69,8] 2,85 [0,7-8,1] 0,0009
аПТ IgM 2,4 [0,5-25,0] 2,25 [0,5-12,3] 0,0140
IgG 4,6 [0,5-172] 3,2 [0,5-15,2] 0,0023
аФС-ПТ IgM 3,9 [0,8-92,1] 3,3 [0,8-24,1] 0,0232
IgG 7,7 [2,1-130,6] 6,1 [1,9-22,3] 0,0040
аФЭ IgM 8,5 [2,7-195,3] 6,8 [2,5-27,9] 0,0103
IgG 7,6 [2,8-215,4] 6,2 [2,2-20,9] 0,0099
и p = 0,0071), у них отмечалась положительная реакция на ВА. Эти результаты согласуются с данными, полученными Gardiner С. et al., о значительно более высоком уровне антител к КЛ и ß2-rn-I у пациенток с тромбозом в анамнезе, чем у пациенток только с акушерским АФС. По их данным, более 50% женщин с клиническими признаками акушерского АФС, но не тромбоза, имели низкие титры антител к КЛ и/или ß2-ГП-I в отсутствие ВА [17].
При проведении регрессионного анализа и ROC-анализа достоверные результаты были получены только для IgG к ß2-ГП-I и АнУ. Так, значения OR для этих антител составляли соответственно 1,5 (95% ДИ [1,15-1,94]; p = 0,0023) и 1,95 (95% ДИ [1,37-2,77]; p = 0,0002), чувствительность - 59,3% и 78%, специфичность - 72,1% и 58,7%, значения AUC - 0,710 и 0,746 (p < 0,001). Следовательно, можно предположить, что из всех тестированных аФЛ именно IgG к ß2-ГП-I и АнУ являются факторами риска развития ранней потери беременности.
Результаты нескольких исследований показали более высокую частоту выявления и уровень антител к АнУ у пациенток с ППБ неясного генеза по сравнению с контролем, в том числе у пациенток, негативных на аКЛ [18-20]. В то же время N. Bizzaro и соавт. в проспективном исследовании продемонстрировали бесполезность этих антител в оценке риска самопроизвольного выкидыша [21]. По мнению J.H. Rand и соавт., ассоциация между аАнУ и ППБ остается спорной в генеральной популяции, в то же время у пациенток с АФС опосредованное аФЛ разрушение кристаллического аннек-синового щита на апикальной поверхности плацентарного трофобласта и сосудистых эндотелиальных клетках, контактирующих с текущей кровью, может представлять механизм, приводящий к потере беременности и тромбозу [22].
Между уровнями аКЛ, аФС и аß2-ГП-I как IgM, так и IgG класса, наблюдалась сильная корреляционная связь (r от 0,885 до 0,9676; p < 0,0001). Корреляционная связь средней силы наблюдалась между IgG к ФЭ и IgG к КЛ, ФС и ПТ (r = 0,56; r = 0,58; r = 0,67; p < 0,0001), а также между IgG к комплексу ФС-ПТ и IgG к КЛ, ФС и ß2-m-I (r = 0,52; r = 0,48; r = 0,61; p < 0,0001). Корреляционной связи между
аАнУ и аФЛ антителами другой специфичности не наблюдалось. Также не отмечалось значительной корреляционной связи между аПТ и аФС-ПТ. Как показали ВегЫассш МХ. et а1., несмотря на то, что антитела к ПТ и комплексу ФС-ПТ ассоциируются с клиническими проявлениями АФС и коррелируют друг с другом, они принадлежат к различным популяциям аутоантител, даже в случаях присутствия у одного пациента [23].
Антитела к КЛ и Р2-ГПЛ были выявлены всего у 31 (34,1%) пациентки с ППБ, из 60 пациенток негативных на аКЛ и ар2-ГП-! у 25 (41,7%) выявлялись аФЛ другой специфичности: аАнУ - у 15 (25%), аФЭ - у 9 (15%), аФС-ПТ - у 5 (8,3%), аПТ - у 4 (6,7%), аФС - у 1 (1,3%). При этом аАнV выявлялись чаще других и значительно чаще, чем аФС-ПТ, аПТ и аФС (р < 0,05); медианный уровень аАнУ IgG (21,5 [6,2-69,8] Ед/мл) был значительно выше, чем у пациенток с аКЛ и/или ар2-ШЛ (7,2 [6,8-8] Ед/мл; р = 0,0425). У пациенток позитивных на аКЛ и/или ар2-ГП-! антитела другой специфичности, кроме IgG к АнУ выявлялись чаще, а антитела к ФС, IgG к ФЭ и комплексу ФС-ПТ выявлялись статистически значимо чаще, чем у пациенток негативных на аКЛ и ар2-ГП-[ (р < 0,05).
Среди пациенток негативных на аКЛ и ар2-ГП-! довольно часто выявлялись аФЭ (у 15%). Недавно с помощью тонкослойной хроматографии показана высокая частота выявления аФЛ у пациентов с «серонегативным» АФС в 58,3% случаев, в 30,5% из них детектировались аФЭ [24]. Предполагается, что аФЭ могут быть зависимыми или независимыми от присутствия кининоге-нов, высокомолекулярных протеинов, связывающих кининоге-ны, и протромбина. Некоторые аФЭ, по-видимому, распознают фактор XI и прекалликреин. Нарушение калликреин-кининовой системы под влиянием аФЭ может играть патогенетическую роль при ранних потерях беременности [25].
С использованием хаотропного агента исследовали авидность антител класса IgG к КЛ, Р2-ГПЛ и АнУ Среднее значение индекса авидности аКЛ составляло 57,11±21,22%, ар2-ГП-! - 64,82±19,65%, аАнУ - 68,22±12,98%. ДО к КЛ и Р2-ГП-! имели высокую авидность (ИА > 70%) в 33,3% и 30% случаев, среднюю авидность (30% < ИА < 70%) - в 53,3% и 65% случаев, низкую авидность (ИА < 30%) - в 13,3% и 5% случаев. Высокая авидность IgG к АнУ наблюдалась в 61,5% случаев, средняя авидность - в 38,5% случаев. Таким образом, у пациенток с ППБ наиболее часто выявлялись аКЛ, ар2-ГПЛ и аАнУ со средним и высоким уровнем авидности IgG. У 3 пациенток с тромботически-ми осложнениями в анамнезе наблюдался не только высокий уровень, но и высокая авидность IgG к КЛ и Р2-ГП-! (ИА > 90%).
Ранее В. Bozic и соавт. показали, что IgG к Р2-ГП-! являются гетерогенными по авидности, высокоавидные ар2-ГПЛ ассоциируются с более высокой патогенностью по сравнению с низкоавидными антителами, с АФС и венозным тромбозом [26]. Сисшс S. et а1. в мультицентровом исследовании подтвердили более высокую патогенность высокоавидных антител по сравнению с низкоавидными, а также их ассоциацию с тромбозом, преимущественно венозным, и акушерскими осложнениями [27].
Результаты исследования распределения аКЛ, ар2-ГПЛ и аАнУ по подклассам IgG у пациенток с ППБ представлены на рисунке. Среди аКЛ преобладали IgG2 и выявлялись чаще, чем ДО1, ДО3 (р = 0,0385) и ДО4 (р = 0,0042). Среди ар2-ГПЛ IgG2 выявлялись также чаще, чем IgG3, IgG4 (р = 0,0261) и IgG1 (р = 0,0037). Среди аАнУ значительных различий между частотой выявления разных подклассов IgG не отмечалось. Однако наблюдались высокая частота выявления IgG4 (53,8%) и их высокий уровень (среднее значение ОП 1,48±1,06) по сравнению с IgG4 другой специфичности.
Полученные нами данные по распределению IgG по подклассам согласуются с данными Samarkos М. et а1. О
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
lgG2 1 lgG3 Подклассы IgG
аКЛ m ар2-ГП-1
lgG4
aAHV
Распределение антител к КЛ, Р2-ГП-1, Ан V по подклассам IgG у пациенток с привычной потерей беременности при определении в сыворотке крови методом ИФА.
преобладании у пациентов с АФС и СКВ подклассов IgG2 и IgG3 среди аКЛ, а IgG2 - среди ар2-ГП-1 [28]. Именно IgG2 к КЛ значительно ассоциировался с артериальным тромбозом и потерей плода. По мнению Sammaritano L.R. et а1, наличие IgG2 к КЛ может быть полезным клиническим предиктором повышенного тромботического риска [29]. IgG2 к Р2-ГП4 ассоциировались с венозным тромбозом, а IgG3 - с венозным тромбозом и потерей плода. Так как подклассы IgG, включая IgG2 и IgG3, различаются по их эффекторным функциям, предполагается, что в патогенез потери плода и тромбоза могут быть вовлечены разные механизмы [30].
Таким образом, у пациенток с привычным невынашиванием беременности неясного генеза с высокой частотой выявлялись не только антитела к КЛ и Р2-ГП-!, но также и аФЛ другой специфичности. Частота выявления и средний уровень антител (^М, к Р2-ГП-! и Ан V, ^ к КЛ, ФЭ и комплексу ФС-ПТ были значительно выше у пациенток с ППБ, чем у здоровых женщин. По результатам регрессионного анализа, IgG к Р2-ГП-! и АнУ являлись факторами риска развития ранней потери беременности. У пациенток, сероне-гативных на аКЛ и ар2-ГП-!, часто выявлялись аАнУ и аФЭ; аАнУ были найдены значительно чаще, чем аФС-ПТ, аПТ и аФС. У женщин с ППБ преобладали аКЛ, ар2-ГП-! и аАнУ со средним и высоким уровнем авидности IgG, которые были представлены всеми четырьмя подклассами с преобладанием среди аКЛ и ар2-ГП-! подкласса IgG2 и высокой частотой выявления IgG4 среди аАнУ У пациенток с тромботически-ми осложнениями в анамнезе отмечался наиболее высокий уровень и высокая авидность аКЛ и ар2-ГП-! по сравнению с пациентками только с акушерскими осложнениями.
Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что антитела (Т^М, IgG) к Р2-ГП-! и АнУ IgG к КЛ, ФЭ и комплексу ФС-ПТ в значительной степени ассоциируются с привычной потерей беременности неясного генеза; IgG к р2-ГП-! и АнУ могут рассматриваться как независимые факторы риска ранней потери беременности. По нашему мнению, антитела к АнУ представляют перспективный серологический маркер для диагностики акушерского АФС.
Исследование не имело спонсорской поддержки.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
5. Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. М.:
Триада-Х; 2005.
8. Макацария А.Д., Бицадзе В.О., Хизроева Д.Х., Макацария Н.А.,
Яшенина Е.В. Патогенетическое значение антифосфолипидных антител. Практическая медицина. 2012; 5 (60): 9-21.
30. Менжинская И.В. Распределение по подклассам IgG и патогенетическая активность аутоантител к хорионическому гонадо-тропину человека при нарушениях репродуктивной функции у женщин. Акушерство и гинекология. 2011; 3: 32-6.
REFERENCES
1. Pierangeli S.S., de Groot P.G., Dlott J., Favaloro E., Harris E.N., Lakos G. et al. 'Criteria/ aPL tests: report of a task force and preconference workshop at the 13th International congress on antiphospholipid antibodies, Galveston, TX, USA, April 2010. Lupus. 2011; 20: 182-90.
2. Cervera R., Conti F., Doria A., Iaccarino L., Valesini G. Does seronegative antiphospholipid syndrome really exist? Autoimmunity Reviews. 2012; 11: 581-4.
3. Bertolaccini M.L., Amengual O., Atsumi T., Binder W.L., de Laat B., Forastiero R. et al. Non-criteria' aPL tests: report of a task force and preconference workshop at the 13th International congress on antiphospholipid antibodies, Galveston, TX, USA, April 2010. Lupus. 2011; 20: 191-205.
4. Kwak-Kim J., Agcaoili M.S.L., Aleta L., Liao A., Ota K., Dambaeva S. et al. Management of women with recurrent pregnancy losses and antiphospholipid antibody syndrome. Am. J. Reprod Immunol. 2013; 69: 596-607.
5. Sidel'nikova V.M. Recurrent pregnancy loss. [Privychnaya poterya beremennosti]. Moscow: Triada-X; 2005. (in Russian)
6. Galarza-Maldonado C., Kourilovitch M.R., Perez-Fernandez O.M., Gaybor M., Cordero C., Cabrera S. et al. Obstetric antiphospholipid syndrome. Autoimmunity Reviews. 2012; 11: 288-95.
7. D'Ippolito S., Meroni P.L., Koike T., Veglia M., Giovanni S., Di Simone N. Obstetric antiphospholipid syndrome: a recent classification for an old defined disorder. Autoimmunity Reviews. 2014; 13: 901-8.
8. Makatsariya A.D., Bitsadze V.O., Khizroeva D.Kh., Makatsariya N.A., Yashenina E.V. Pathogenetic significance of antiphospholipid antibodies. Prakticheskaya meditsina. 2012; 5 (60): 9-21. (in Russian)
9. Blank M., Shoenfeld Y. Antiphospholipid antibody-mediated reproductive failure in antiphospholipid syndrome. Clinic Rev. Allerg. Immunol. 2010; 38: 141-7.
10. De Carolis S, Botta A, Santucci S, Garofalo S, Martino C, Perrelli A. et al. Predictors of pregnancy outcome in antiphospholipid syndrome: a review. Clin. Rev. Allergy Immunol. 2010; 38 (2-3): 116-24.
11. Meroni P.L. Pathogenesis of the antiphospholipid syndrome: an additional example of the mosaic of autoimmunity. J. Autoimmunity. 2008; 30: 99-103.
12. De Jesus G.R., Agmon-Levin N., Andrade C.A., Andreoli L., Chigh-izola C.B., Porter T.F. et al. 14th International congress on antiphos-pholipid antibodies task force report on obstetric antiphospholipid syndrome. Autoimmunity Reviews. 2014; 13:795-813.
13. Cucnik S., Kveder T., Krizaj I., Rozman B., Bozic B. High avidity anti-ß2-glycoprotein I antibodies in patients with antiphospholipid syndrome. Ann. Rheum. Dis. 2004; 63: 1478-82.
14. Alijotas-Reig J., Ferrer-Oliveras R., Rodrigo-Anoro M.J., Farran-Co-dina I., Cabero-Roura L., Vilardell-Tarres M. Anti-ß2-glycoprotein-I and anti-phosphatidylserine antibodies in women with spontaneous pregnancy loss. Fertil. Steril. 2010; 93 (7): 2330-6.
15. Zigon P., Cucnik S., Ambrozic A., Kveder T., Semrl S.S., Rozman B. et al. Detection of antiphosphatidylserine/prothrombin antibodies and their potential diagnostic value. Clin. Dev. Immunol. 2013:724592. doi: 10.1155/2013/724592. Epub 2013 Sep 26.
16. Atsumi T., Koike T. Antiprothrombin antibody: why do we need more assays? Lupus. 2010; 19 (4): 436-9.
17. Gardiner C., Hills J., Machin S.J., Cohen H. Diagnosis of antiphospholipid syndrome in routine clinical practice. Lupus. 2013; 22: 18-25.
18. Bizzaro N., Tonutti E., Villalta D., Tampoia M., Tozzoli R. Prevalence and clinical correlation of anti-phospholipid-binding protein antibodies in anticardiolipin-negative patients with systemic lupus erythematosus and women with unexplained recurrent miscarriages. Arch. Pathol. Lab. Med. 20005; 129: 61-8.
19. Sater M.S., Finanb R.R., Mustafa F.E., Ghada M.A.K., Almawi M.Y. Anti-annexin V IgM and IgG autoantibodies and the risk of idio-pathic recurrent spontaneous miscarriage. J. Reprod. Immunol. 2011; 89: 78-83.
20. Matsubayashi H., Arai T., Izumi S., Sugi T., McIntyre J.A., Tsune-hisha M. Antiannexin V antibodies in patients with early pregnancy loss of implantation failure. Fertil. Steril. 2001; 26: 694-9.
21. Bizzaro N., Antico A., Musso M., Platzgummer S., Camogliano L., Tozzoli R. et al. A prospective study of 1038 pregnancies on the predictive value of anti-annexin V antibodies for fetal loss. Ann. N.Y. Acad. 2005; 1050: 348-56.
22. Rand J.H., Wu X.X., Quinn A.S., Taatjes D.J. The annexin A5-medi-ated pathogenic mechanism in the antiphospholipid syndrome: role in pregnancy losses and thrombosis. Lupus. 2010; 19: 460-9.
23. Bertolaccini M.L., Atsumi T., Koike T., Hughes G.R., Khamashta M.A. Antiprothrombin antibodies detected in two different assay systems. Prevalence and clinical significance in systemic lupus erythematosus. Thromb. Haemost. 2005; 93: 289-97.
24. Conti F., Allessandri C., Sorice M., Capozzi A., Longo A., Garofalo T. et al. Thin-layer chromatography immunostaining in detecting anti-phospholipid antibodies in seronegative anti-phospholipid syndrome. Clin. Exp. Immunol. 2012; 167: 429-37.
25. Sugi T. Kininogen-dependent antiphosphatidylethanolamine antibodies and autoantibodies to factor xII in patients with recurrent pregnancy loss. J. Obstet. Gynaecol. Res. 2013; 39 (7): 1223-9.
ORIGINAL ARTICLE
26. Bozic B., Cucnik S., Kveder T., Rozman B. Avidity of anti-be-ta-2-glycoprotein I antibodies. Autoimmunity Reviews. 2005; 4: 303-8.
27. Cucnik S., Kveder T., Artenjak A., Ulkova-Gallova Z., Swadzba J., Musial J. et al. Avidity of anti-ß2-glycoprotein I antibodies in patients with antiphospholipid syndrome. Lupus. 2012; 21: 764-5.
28. Samarkos M., Davies K.A., Gordon C., Walport M.J., Loizou S. IgG subclass distribution of antibodies against ß2-GP1 and cardiolipin in patients with systemic lupus erythematosus and primary antiphos-pholipid syndrome, and their clinical associations. Reumatology. 2001; 40: 1026-32.
29. Sammaritano L.R., Ng S., Sobel R., Lo S.K., Simantov R., Furie R. et al. Anticardiolipin IgG subclasses: association of IgG2 with arterial and/or venous thrombosis. Arthritis Rheum. 1997; 40 (11): 1998-2006.
30. Menzhinskaya I.V. IgG subclasses distribution and pathogenic activity of autoantibodies to human chorionic gonadotropin in women with a history of reproductive failure. Akusherstvo i gynekologiya. 2011; 3: 32-6. (in Russian)
Поступила 04.03.15 Принята к печати 18.06.15
БИОТЕХНОЛОГИЯ И ВАКЦИНЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 612.124.017.1.06
Сергеева В.Е., Трофимов А.В., Жахов А.В., Родин С.В., Ищенко А.М.
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, 197110, г. Санкт-Петербург
Моноклональные антитела (МАТ), способные влиять на функциональную активность комплемента, представляют в настоящее время повышенный интерес фармакологов и биотехнологов, разрабатывающих новые лекарственные средства для коррекции активации системы комплемента. В данной статье представлены способы иммунизации с использованием смесей, содержащих как нативные белки комплемента, так и их производные, образовавшиеся в процессе активации, и методы отбора гибридом для получения обширной панели МАТ к белкам системы комплемента человека. В результате такого подхода было получено 45 гибридом, продуцирующих МАТ к 10 белкам системы комплемента и продуктам их активации. Среди них были выявлены 12 типов МАТ различной специфичности, которые модулировали активность отдельных звеньев каскадных реакций комплемента. Детальное исследование функций антител позволило определить МАТ, блокирующие активацию комплемента по классическому и альтернативному пути, а также 2 типа МАТ, которые потенцировали активацию. В числе МАТ, полученных после иммунизации мышей сывороткой человека, активированной зимозаном или эритроцитами барана, были выявлены несколько типов антител к ключевым компонентам, которые блокировали активацию системы комплемента с высокой эффективностью в концентрациях, значительно ниже эквимолярных по отношению к уровням специфичных им компонентам, циркулирующим в сыворотке крови.
Рекомбинантные аналоги полученных МАТ, обладающих высокой нейтрализующей активностью, могут быть использованы для получения терапевтических антител, предназначенных для лечения патологий, связанных с неконтролируемой активацией комплемента. МАТ из полученной панели антител были использованы для разработки тест-систем для определения содержания компонентов комплемента в сыворотке крови человека и оценки уровня ее активации.
Ключевые слова: активация комплемента; блокирование системы комплемента; гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела.
Для цитирования: Сергеева В.Е., Трофимов А.В., Жахов А.В., Родин С.В., Ищенко А.М. Моноклональные антитела для регуляции системы комплемента человека. Иммунология. 2016; 37 (1): 9-13. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-1-9-13.
Для корреспонденции: Сергеева Валерия Евгеньевна - мл. науч. сотр. лаборатории биохимии белка ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, E-mail: [email protected].
