CC BY
132
Н. В. Савельева, И. Д. Курдюков, Е. Э. Дудник,
В. В. Емельянов, М. В. Падкина, Л. А. Лутова
СОЗДАНИЕ РАСТЕНИЙ-ПРОДУЦЕНТОВ БЫЧЬЕГО ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА И ЛЕЙКЕМИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА*
Введение
С момента публикации в 1983 г. первых работ по получению трансгенных растений табака, генная инженерия растений прошла стремительный путь развития и в настоящее время трансгенные растения оказывают заметное влияние на многие отрасли промышленности, в том числе и на фармацевтическую. В данное время количество фармакологических соединений, синтезируемых в растениях, составляет сотни, и с каждым годом к списку прибавляются новые.
Развитие биотехнологии растений-продуцентов фармакологических соединений проходило в несколько этапов. Первым этапом было создание растений с улучшенными лечебно-диетическими свойствами, например с повышенным содержанием витаминов, сбалансированным содержанием незаменимых аминокислот и т.п. [2, 7].
После успешных работ в этом направлении исследователи перешли к следующему этапу — созданию растений-продуцентов рекомбинантных белков. Попытки синтезировать животные белки в растительных системах увенчались успехом в 1986 г. и первым фармацевтически значимым белком, экспрессированным в растениях табака и подсолнечника, стал человеческий гормон роста [19]. После этой работы большое количество ценных белков было эффективно экпрессированно в растениях. Среди них были белки человеческой сыворотки, регуляторы роста, антитела, вакцины, промышленные ферменты, биополимеры и реагенты для молекулярной биологии. Таким образом, были получены доказательства возможности успешного использования растительных систем для производства рекомбинантных белков в промышленном масштабе
[1, 11, 15].
Успехи первых двух этапов не остановили исследователей на достигнутом и в 1989 г. Хиаттом и соавторами [31] была впервые получена экспрессия антител в растениях табака. Данная работа стала доказательством тому, что растения могут синтезировать не только простые гетерологичные пептиды, но и собирать сложные функциональные гликопротеины, состоящие из нескольких субъединиц. Однако доказательства, что антитела, синтезированные в растительных системах, способны правильно функционировать, были получены только в 1992 г. Именно тогда была впервые подтверждена структурная идентичность и иммуногенность поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), синтезированного в растениях табака [41]. В дальнейшем был показан иммунный ответ у мышей, вакцинированных антигеном, выделенным из листьев табака [58]. Успешные опыты на табаке побудили исследовате-
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №08-04-00537-а и 08-04-13629-офи_ц).
© Н. В. Савельева, И. Д. Курдюков, Е. Э. Дудник, В. В. Емельянов, М. В. Падкина, Л. А. Лутова, 2009
лей создать аналогичные трансгенные растения картофеля и сои, в которых антиген экспрессировался на уровне до 1700 мкг/г сухого веса [47, 50]. Показано, что НВв-антиген, синтезируемый растениями картофеля, вызывал у мышей более сильный иммунный ответ, чем продуцируемый дрожжами [34]. Были проведены испытания вакцины на основе трансгенного картофеля на добровольцах и показана ее иммуно-генность при оральном введении [57]. К настоящему времени имеются публикации по синтезу более 50 различных человеческих и животных антигенов в трансгенных растениях [11].
Необходимо отметить, что эволюция биотехнологии растений-продуцентов привела ученых к следующему этапу — созданию «съедобных вакцин». В случае успеха создания подобных растений-вакцин этап дорогостоящей очистки антигенов, который необходим при создании вакцин для перентерального введения, может быть исключен из производства этих веществ [66]. Идея создания «съедобных вакцин» была подкреплена тем фактом, что антигены, экспрессируемые в растениях, защищены растительными клеточными стенками от протеолиза при прохождении пищеварительного тракта и могут быть легко доставлены к клеткам слизистой оболочки кишечника, ответственным за мукозную систему иммунитета. Интенсивная разработка концепции «съедобных вакцин» на основе трансгенных растений, чьи плоды, листья и семена годятся в пищу, в последнее время позволила создать некоторые субъединичные вакцины. Например, две вакцины, синтезируемые в растениях картофеля, уже прошли стадию клинических испытаний — это субъединица В термолабильного токсина (КГ-В) энтеротоксигенного штамма Е. еоИ (ЕТЕС) и капсидный белок вируса Норфолк ^УСР) [55, 56]. Данные антигены, выделенные из двух важных кишечных патогенов, могут быть идеальными съедобными вакцинами, поскольку оба имеют мультимерную структуру и устойчивы к перевариванию в кишечнике человека. Каждый из этих белков накапливался в больших количествах в клубнях картофеля и правильно собирался в олигомеры. Клинические испытания рекомбинантной вакцины КГ-В показали, что поедание добровольцами сырых клубней картофеля, содержащих 0,3-10 мг КГ-В, приводило к образованию мукозных и системных антител с высокими титрами [55]. Значительный прогресс достигнут в использовании семян кукурузы для экспрессии съедобных вакцин [21, 22, 53]. Субъединица КГ-В экспрессировалась в семенах на уровне до 0,1% от сырого веса и обладала иммуногенными и защитными свойствами при поедании мышами. Ассоциация с крахмалом облегчает очистку антигена из зерен кукурузы и, кроме того, обеспечивает термостабильность антигена и его устойчивость к протеолитической деградации при попадании в желудочно-кишечный тракт. Последнее обстоятельство важно при оральном введении антигена. На основе семян кукурузы создана вакцина, защищающая свиней от вирусного гастроэнтерита [38, 39].
Создание растительных продуцентов
Несмотря на широкое использование трансгенных растений в качестве продуцентов в фармакологии и медицине, в настоящее время необходимо остановиться на некоторых проблемах, связанных с созданием продуцентов в целом, и особенностях создания растительных продуцентов. Наиболее важными проблемами при создании продуцентов являются стабильное наследование целевого гена, уровень экспрессии этого гена, а также проблемы функциональности и накопления гетерологичного белка.
Наследование трансгена
Проблема стабильного наследования гетерологичных генов в ряду поколений является одной из первостепенных задач при создании продуцентов, в том числе растительных.
Ядерный геном. Первые попытки создания растительных продуцентов были основаны на трансформации ядерного генома растений. Таким образом, в настоящее время существует широкий спектр отлично разработанных методов ядерной трансформации, позволяющих внедрять гетерологичные гены в геном растений. Однако оказалось, что не все быстрые и эффективные методы трансформации подходят для этой цели. Например некоторые методы прямого переноса ДНК, имеющие высокий процент трансформации в поколении То, не могут быть использованы для получения стабильных трансформантов, так как трансген не встраивается в геномную ДНК растения и в последующих поколениях происходит практически полная потеря гетерологичного гена. Избежать подобной ситуации можно, используя методы непрямого переноса, например, метод агробактериальной трансформации. Не очень высокий процент (0,3—0,6% от растворимого белка клетки [11, 43, 45]) трансформантов в поколении То компенсируется природным механизмом встраивания чужеродной ДНК в геном растения, который приводит к сохранению гетерологичного гена в ряду поколений.
Геном органелл. Необходимо отметить также, что развитие современных методов прямого переноса чужеродной ДНК позволило создавать и внедрять векторные конструкции с гетерологичными генами не только в ядерный геном, но и в геномы растительных органелл. Известно, что многие растения являются полиплоидами, сложными для трансформации и последующего анализа. Простой геном хлоропластов и митохондрий позволяет обойти проблему полиплоидности и сайлесинга [6, 10] и получить соответствующие трансгенные растения. Кроме того, наследование органелл по линии одного из родителей предоставляет возможность контролировать попадание трансгена в окружающую среду с помощью перекрестного опыления. Это важный аспект прикладной биотехнологии, так как при создании растений-продуцентов часто используют гены устойчивости к антибиотикам для отбора трансгенных растений. Очевидно, что попадание в окружающую среду подобных генов нежелательно [2, 7].
Проблема экспрессии
После развития методов трансформации растений начались эксперименты по внедрению различных генов в растительный геном и изучению их работы. Выяснилось, что трансформированные идентичной конструкцией ДНК трансгенные клоны, полученные параллельно в одном и том же опыте, значительно различаются по уровню экспрессии введенного гена. Показано, что уровень экспрессии зависит от многих факторов, некоторые из которых мы попытаемся рассмотреть в этой статье.
Локализация и сохранение целостности гетерологичного гена. Показано, что уровень экспрессии в первую очередь зависит от того, в какую область ядерного хроматина попал введенный ген. Очевидно, что экспрессия трансгена будет высока при его попадании в область активного хроматина (эухроматина). Многочисленные работы по трансформации продемонстрировали, что частота встраивания трансгена в область эухроматина значительно выше по сравнению с частотой встраивания этого же трансгена в гетерохроматиновый участок генома [2, 7]. С другой стороны, необходимо упомянуть, что уровень экспрессии трансгена зависит также от сохранения его структурной
целостности. Поскольку многие методы трансформации (например, методы прямого переноса ДНК) не имеют «природных» механизмов встраивания чужеродной ДНК в геном, то существует большая вероятность нарушения структурной целостности гете-рологичного гена при внедрении его в растительный геном. Подобные события, при которых чужеродная ДНК претерпевает существенные изменения (перестройки, дупликации, инверсии и т. д.), возникают достаточно часто и приводят либо к полной инактивации гетерологичного гена, либо к снижению его экспрессии [2, 7].
Полиплоидия растительного генома и многокопийность ДНК-инсерции. Одной из особенностей организации растительного генома является полиплоидность многих растений [5]. Создание трансгенных растений-продуцентов на основе полиплоидных форм может быть малоэффективным. С одной стороны, инсерции одной копии гетерологичного гена может быть недостаточно для продуктивного синтеза чужеродного белка. С другой стороны, вероятность получения множественных инсерций гетероло-гичного гена может привести к замолканию трансгена в результате явления сайлесинга, вероятность которого существенно возрастает при увеличении количества копий [6, 10]. Таким образом, чем больше таких копий, и чем они протяженнее, тем больше вероятность замолкания гетерологичных генов. В связи с этим трансгенные культуры должны содержать не более одного встроенного гена на гаплоидный геном, а сигнальные части трансгена (промоторы, терминаторы и т.д.) не должны иметь длинных гомологий (более 100-300 н.п.) с участками хозяйского генома [7, 15].
Структура вектора. Промоторы. Эффективность экспрессии гетерологично-го гена, как правило, в значительной степени зависит от структуры, используемой конструкции для экспрессии рекомбинантного гена. Одной из важных структур, влияющих на экспрессию, является промотор, под контролем которого находится ген интереса. Наиболее часто для создания растительных продуцентов используют конститутивные промоторы, которые обеспечивают экспрессию соответствующего гена на стабильном уровне во всех типах тканей растения. Наиболее популярным среди конститутивных промоторов является 35S промотор вируса мозаики цветной капусты (35S CaMV), функционирующий во всех растительных тканях в течение всей жизни растения [2]. В настоящее время довольно часто применяется его усиленная версия — искусственно полученный МАС — промотор, который представляет собой удвоенную последовательность 35S CaMV [17, 59]. Кроме 35S CaMV, в генной инженерии растений успешно применяются и другие типы конститутивных промоторов, например, гибридный ( ocs)3mas промотор, сконструированный из последовательностей промоторов генов октопинсин-тазы (onc) и маннопинсинтазы (mas), а также промоторы генов убиквитина кукурузы и арабидопсиса [30].
Помимо конститутивных промоторов, для создания векторной конструкции, несущей изучаемый ген, могут быть использованы тканеспецифичные растительные промоторы, которые будут обеспечивать работу трансгена в определенных тканях. Таким образом, можно не только усилить экспрессию, но и контролировать работу трансгена. Так, вместо 35S CaMV, можно использовать промотор гена малой субъединицы фото-синтетического фермента рибулозобисфосфат-карбоксилазы, который работает только в фотосинтезирующих тканях, например в листьях [2]. Для получения большого количества гетерологичного белка также используют промоторы генов запасных белков. Например, гетерологичный ген, помещенный под пататиновый промотор, будет экспрессироваться в клубнях картофеля, так как пататин является запасным белком клубней картофеля. Для бобовых в тех же целях перспективно использовать промоторы генов легумина и вицилина — запасных белков семян бобовых [17].
Помимо вышеперечисленных, необходимо также упомянуть и об индуцибельных промоторах, под контролем которых гены экспессируются на определенной стадии развития или при воздействии специфического индуктора [2]. В качестве индуктора могут выступать химические агенты или физические условия (температура, свет и т. п.). Так, в качестве подобных промоторов довольно часто используют промоторы, индуцируемые тетрациклином [28], спиртом [48], изменением температуры [49], металл-инду-цибельные промоторы, которые, в свою очередь, индуцируются в присутствии ионов металла [42] или, например, промотор а-амилазы риса RAmy3D, индуцируемый недостатком сахара [70].
Каждый из вышеописанных вариантов промоторов, используемых для создания векторных конструкций, имеет свои недостатки. Например, серьезным недостатком тканеспецифичных и индуцибельных промоторов является их слабая активность. С другой стороны, использование сильных конститутивных промоторов также может приводить к низкому уровню работы или к «замолканию» гетерологичных генов в результате сайлесинга [2, 7].
Проблема сайленсинга. При изучении наследования гетерологичных генов было обнаружено, что у многих трансгенных растений интродуцированный ген через некоторое время может терять свою активность, хотя физически продолжает присутствовать в геноме. Это явление было названо сайлесингом (silencing)—замолканием генов [6, 10]. Предполагается, что растение способно активно противостоять экспрессии чужеродной ДНК, используя данный способ в качестве защиты от патогенных бактерий и вирусов [6, 7, 10]. Очевидно, что данное явление может значительно затруднить получение растительных продуцентов, так как стабильность функционирования трансгенов является основой биотехнологического производства. Изучение механизмов сайлесинга помогло ученым отчасти решить возникшую проблему замолкания трансгенов, следуя определенным правилам при создании векторных конструкций и отборе трансгенных растений. Например, один из видов сайлесинга может быть связан с высокой степенью гомологии генов реципиента и гетерологичных генов. В этом случае инактивация рекомбинантных генов может происходить на транскрипционном и на посттран-скрипционном уровнях [14]. Считается, что в основе механизма транскрипционного сайлесинга лежит спаривание и последующее метилирование гомологичных участков ДНК в случае множественной дупликации одной и той же последовательности. При посттранскрипционном сайлесинге гомология наблюдается в транскрибируемой области генома и инактивация возникает за счет последовательно-специфичной деградации транскриптов (мРНК) чужеродного гена, когда ее уровень достигает порогового значения. Посредником в запуске механизма деградации служит абберантная двухцепочечная РНК, гомологичная последовательностям инактивированных трансгенов. Этот механизм, возможно, служит одним из способов защиты растения от РНК-содержащих вирусов [8, 37].
Структура вектора. Элементы, повышающие уровень и стабильность экспрессии. В настоящее время можно повысить уровень и стабильность экспрессии трансгенов в растении с помощью специального конструирования концов ДНК-фрагмента, вводимого в растение. Например, добавление терминаторов транскрипции предотвращает нежелательное прохождение РНК-полимеразы через трансген, если промотор хозяйского генома случайно оказывается поблизости от места встраивания ДНК-фрагмента. Кроме того, при добавлении сравнительно коротких (> 300 н. п.) участков связывания ядерного матрикса (МАР) по концам ДНК-фрагмента, трансген имеет больше шансов образовать независимую петлю хроматина или включиться в со-
став транскрибируемого эухроматина. В обоих случаях это приводит к повышению и стабилизации уровня экспрессии трансгена [7]. Также необходимо отметить, что в усилении транскрипции могут принимать участие интроны и некоторые ^ыс-элементы, обнаруженные в составе мРНК и определяющие ее стабильность в растительной клетке. Например, в ряде случаев, особенно у злаков, введение интрона в район 57-конца мРНК целевого гена резко усиливает его транскрипцию. Таким образом, дополняя вектор подобными элементами, можно достичь оптимального уровня экспрессии трансгена и накопления соответствующей мРНК в трансгенных растениях, предназначенных для биотехнологического применения [7].
Трансформация органелл. Как уже упоминалось ранее, решить проблемы экспрессии гетерологичных генов можно также с помощью трансформации органелл. Существуют две стратегии осуществить синтез чужеродного белка в органеллах. Первая стратегия заключается в слиянии гена интереса с сигнальным пептидом, направляющим продукт в органеллы. Подобная конструкция может быть встроена в хромосомную ДНК, а рекомбинантный белок будет импортироваться в соответствующую орга-неллу. Вторая стратегия предполагает встраивание гена интереса непосредственно в хлоропластную или митохондриальную ДНК [2]. Независимо от того, какую стратегию из вышеперечисленных исследователь выберет для работы, он может преодолеть ряд трудностей. Например, с помощью трансформации органелл можно повысить уровень мРНК, которые будут накапливаться не в цитоплазме, а в органеллах, где они в большей степени будут защищены от деградации. Кроме того, синтез гетерологич-ных веществ в органеллах также может защитить клетку от токсического эффекта, которым могут обладать некоторые чужеродные белки. Таким образом, трансформация органелл позволяет в значительной степени повысить экспрессию гетерологичных генов. Подтверждают это сведения о том, что многие белки, полученные с помощью трансформации ядерного генома табака и экстрагированные из листьев, в основном синтезировались на низком уровне, обычно менее 0,1% от растворимого белка клеток. Применение систем трансформации органелл позволило повысить уровень экспрессии. Так, трансформация хлоропластов геном человеческого гормона роста давала уровень экспрессии до 7%, а геном человеческого сывороточного альбумина — более 11% от растворимого белка клеток [52, 63].
Физиология трангенных растений. В заключение этого раздела хотелось бы отметить, что изменение генетической информации при создании растительных продуцентов может негативно повлиять на физиологию самих растений. Были проведены физиологические исследования, направленные на изучение влияния гетерологичного белка на физиологию и биохимию растения в целом [2, 3]. Установлено, что применяемые процедуры трансформации могут в значительной степени повлиять на хозяйский геном. Так, встраивание трансгена может нарушить первичную структуру какого-либо хозяйского гена и тем самым вызвать его инактивацию. Подобные события, по-видимому, происходят не так редко, особенно если учесть, что трансгены преимущественно встраиваются в транскрибируемые области хроматина (эухроматин). В последующих поколениях инактивируемый ген может перейти в гомозиготное состояние и проявиться в фенотипической мутации (как правило, нежелательной). С другой стороны, при агробактериальном или физическом переносе генов в растительный геном в последнем нередко отмечаются разного рода перестройки, вплоть до транслокаций фрагментов хромосом. Подобные события также могут повлиять на нормальное функционирование генома растения [3, 7].
Проблема гликозилирования белков в трансгенных растениях
Как было отмечено ранее, трансгенные растения могут успешно продуцировать многие человеческие белки, используемые в медицине в качестве терапевтических агентов. Удобство растительных систем заключается в практичности и экономичности по сравнению с другими системами продуцентов. Тем не менее растения не являются идеальной системой экспрессии для продукции биофармацевтических белков, так как механизм ^гликозилирования белков в растительных клетках отличается от механизма ^гликозилирования, характерного для клеток млекопитающих. Как известно, большинство терапевтических белков представляют собой гликопротеины, защищенные ^гликанами, которые очень часто влияют на стабильность, укладку и биологическую активность соответвующего гликопротеина. Таким образом, неправильное ^гликози-лирование в некоторых случаях может приводить к нарушению функциональности целевых белков. Кроме того, при использовании протеинов в терапевтических целях, соединенных с чужеродными гликанами, может наблюдаться иммунный ответ у пациента [33].
Среди растительных гликопротеинов можно выделить два типа ^гликанов: олиго-маннозные и сложные биантеннарные. Олигоманнозные ^гликаны образуются в эн-доплазматической сети, при этом олигоманнозные ^гликаны растений не отличаются от таковых у животных [32]. Напротив, сложные биантеннарные ^гликаны, образующиеся в аппарате Гольджи, имеют принципиальные различия у животных и растений. В частности, у животных в состав биантеннарных ^гликанов входят остатки сиаловой кислоты, а у растений — ксилозы. Кроме того, механизм присоединения остатков фу-козы к остаткам ^ацетилглюкозамина в растительных клетках также отличается от механизма присоединения фукозных остатков в животных клетках, при этом сложные биантеннарные растительные гликаны обогащены дополнительными остатками фукозы
[40].
У растений тип гликозилирования того или иного белка зависит от многих факторов: от локализации белка в клетке, от органа растения, в котором происходит процесс экспрессии, а также от свойств самого белка. Например, растительные ^гликопротеины, локализованные в вакуоли, представлены пауциманнозидными гликопротеинами, в составе которых обнаруживаются усеченные варианты сложных би-антеннарных гликанов, с меньшим количеством остатков фукозы и ксилозы. В то же время ^гликаны в составе гликопротеинов плазматической мембраны являются в основном сложными биантеннарными [33]. Известно также, что соотношение пауциманно-зидных и сложных биантеннарных гликанов в растительных органах может существенно различаться. Так, на примере табака было показано, что состав гликанов в листьях верхней части цветущего побега существенно отличается от такового, выделенного из листьев нижней части побега, по соотношению олигоманнозных и пауциманнозидных гликанов. Такие различия могут быть связаны с различным размером вакуолей в молодых и зрелых листьях [25].
Как было отмечено выше, при использовании трансгенных терапевтических белков растительного происхождения может возникать проблема иммуногенности. Известно, что в ответ на введение в организм человека растительных ^гликанов биантеннарного типа, происходит продукция иммуноглобулинов Е и G, специфичных к а(1,3)-фукозе и ^(1,2)-ксилозе [29, 64]. Аналогичные результаты были получены для крыс, кроликов и коз [18, 26, 36]. С другой стороны, есть данные, что мышиные белки, вырабо-
танные трансгенными растениями и содержащие растительные гликаны, не вызывают иммунного ответа у мышей [20]. Таким образом, можно говорить о видоспецифичности иммунного ответа у животных на гликопротеины растительного типа.
В настоящее время предложено несколько стратегий растительной «гликоинженерии» для решения проблемы иммуногенности гликопротеинов, синтезируемых в растительных системах. Например, одной из стратегий является изменение клеточной локализации трансгенного белка и, следовательно, изменения типа его гликозилирования. Кроме того, можно осуществить инактивацию генов некоторых растительных глико-зилтрансфераз (например, а(1,3)-фукозилтрансферазы и ^(1,2)-ксилозилтрансферазы) [29, 35] и использовать человеческие гликозилтрансферазы (в том числе а(2,6)-сиалил-трансферазы) для посттрансляционной модификации трансгенного белка [69]. Другой альтернативой может стать модификация белковой последовательности с помощью удаления сайтов N-гликозилирования. В этом случае белок не будет гликозилирован. Как это повлияет на дальнейшую структуру и функции белка необходимо рассматривать в каждом конкретном случае.
Накопление целевого продукта
Накопление целевого продукта может происходить в различных компартментах растительной клетки или секретироваться в апопласт. Как правило, многие рекомбинантные белки, первоначально синтезируемые в растениях, секретируются в апопласт или находятся в цитоплазме, где могут подвергаться протеолитическому расщеплению. Не так давно была предложена стратегия, которая позволяет повысить стабильность ге-терологичных белков с помощью присоединения сигнальных пептидов, направляющих белки в различные компартменты клетки. Например, присоединение сигнального ли-дерного пептида и С-концевого сигнала KDEL (лизин-аспартат-глутамат-лейцин) позволяет удерживать гетерологичные белки в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) [23, 46, 67]. Направляя гетерологичные белки в эндоплазматический ретикулум, можно также избежать присоединения иммуногенных растительных N-гликанов к гетероло-гичным белкам, которые впоследствии могут быть причиной аллергических реакций. Белки растений, связанные с ЭПР, содержат N-гликаны маннозного типа [33, 43], являющиеся обычными и для животных, поэтому они не должны быть иммуногенны. Недавние исследования продемонстрировали, что химерные мышино-человеческие антитела, имеющие KDEL-сигнал на легкой и тяжелой цепи, собирались в функциональную форму H2L2 и содержали 6-9 остатков маннозы [51, 62].
Кроме того, локализация гетерологичных белков в каком-либо компартменте клетки позволяет не только накапливать необходимый продукт, но и избежать токсичного влияния чужеродного белка на растительную клетку, которое вполне возможно при накоплении этого продукта.
Как правило, при создании растений-продуцентов требуется достаточно высокий уровень экспрессии белка. Достичь этого можно также, направляя или синтезируя ге-терологичный белок в митохондрии или хлоропласты. Так, например, при трансформации пластид можно повысить выход целевого белка до 25% от общего растворимого белка клетки [60, 61]. С другой стороны, пластиды и митохондрии являются удобным естественным резервуаром для накопления целевого продукта, что также является несомненным плюсом практического применения трансформации органелл.
Растения-продуценты y-интерферона быка
Интерфероны. Как уже было отмечено ранее, многие рекомбинантные белки, синтезируемые в растительных системах, являются продуктами крови. Одними из важных белков крови являются интерфероны. Это семейство эволюционно родственных белков, продуцируемых большинством эукариотических клеток в ответ на различные индукторы вирусной и невирусной природы. Они принадлежат к группе цитокинов, регулирующих пролиферацию и дифференцировку Т- и В-лимфоцитов и NK (natural killers) в периферических лимфоидных органах и тканях. Из представленных разнообразных клинических эффектов интерферона (ИФН) главными принято считать следующие:
• антивирусную активность, связанную с подавлением трансляции вирусных РНК в клетках. Механизм системы ИФН действует через существующую систему регуляции синтеза нуклеиновых кислот, активируя ферменты и ингибиторы, блокирующие трансляцию или приводящие к деградации мРНК вируса. Это определяет универсально широкий спектр антивирусного действия интерферонов.
• иммуномодулирующие (иммунокоррегирующие) эффекты — интерфероны выступают как медиаторы иммунитета и, выполняя множество функций, могут использоваться в терапии вторичных иммунодефицитов при инфекционных и неинфекционных заболеваниях.
• противоопухолевый эффект, связанный с подавлением интерферонами деления клеток, особенно быстро размножающихся (опухолевых) [4, 16].
Таким образом, все известные в настоящее время интерфероны обладают полифунк-циональной активностью в отношении клеток, на которые они оказывают свое действие. Кроме того, интерфероны используются в качестве адъювантов — стимуляторов иммунитета при вакцинации.
С помощью методов биотехнологии создан ряд запатентованных биопрепаратов для повышения неспецифического иммунитета животных, содержащих видоспецифичный интерферон. В частности, это препарат для профилактики вирусных болезней свиней, содержащий свиной лейкоцитарный ИФН-а, и препарат для профилактики вирусных респираторных заболеваний крупного рогатого скота, содержащий бычий ИФН-а. Наиболее перспективным представляется создание трансгенных продуцентов ИФН, которые возможно добавлять непосредственно в корм животным, минуя дорогостоящую очистку. Такие «съедобные адъюванты» и белки должны быть достаточно стабильными, чтобы пройти через пищеварительный тракт и все еще быть доступными для поглощения в их активной форме [54].
В лаборатории биохимической генетики СПбГУ, ООО «Биотех» создан штамм дрожжей Pichia pastoris, синтезирующий внутриклеточно ИФН-7 быка [13]. В нашей лаборатории генной и клеточной инженерии растений начата работа по созданию рас-тений-продуцентов с использованием предоставленного М. В. Падкиной и Е. В. Самбук вектора для получения «съедобного адъюванта» на основе кормовых культур.
Применение в животноводстве ИФН и ИФН-7 в частности, имеет существенные преимущества по сравнению с традиционными антибиотиками и химиотерапевтическими препаратами. Областью применения ИФН-7 является лечение вирусных, онкологических, а также ряда бактериальных заболеваний [9]. Показано, что Т-клетки играют важную роль в иммунном ответе на Mycobacteria tuberculosis bovis. Микобактерия и ее компоненты являются антигенами для Т-клеток [65]. Т-клетки быка in vitro увеличиваются в объеме и производят ИФН-7 в ответ на стимуляцию живыми микобактериями, элементами их клеточной стенки или фильтратом белков Mycobacteria tuberculosis bo-
vis. ИФН-7 — ключевой цитокин в защитном иммунном ответе на микобактерию [24, 27], который является доминирующим в экспрессии антигенов к туберкулезной инфекции крупного рогатого скота [68]. Кроме того, ИФН-7 является противоопухолевым агентом, активирующим антинеопластическую функцию макрофагов [4, 16]. Учитывая, что вирусный лейкоз является широко распространенным заболеванием крупного рогатого скота, необходимость подобного лекарственного средства для ветеринарии не вызывает сомнения.
Трансгенные растения табака, содержащие ген j-интерферона быка.
Исследования, проведенные нами, — это начальный этап работы по созданию растений-продуцентов бычьего 7-интерферона, которые можно будет использовать в качестве кормовых культур для крупного рогатого скота.
В настоящее время в нашей лаборатории с помощью метода агробактериальной трансформации были получены трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum L.), несущие ген 7-интерферона быка под конститутивным 35S промотором CaMV. Для этих растений показана экспрессия гетерологичного гена. От исходных растений (поколение То) путем самоопыления были заложены 6 семей. Чтобы отобрать наиболее оптимальную/ые семью/и трансгенных растений табака (в которых стабильно наследуется и экспрессируется ген ИФН-7), мы провели ПЦР- и ОТ-ПЦР-анализ растений поколения Fi всех 6 семей. Анализ растений поколения F1 показал, что 4 семьи оказались неперспективными в качестве растительных продуцентов ИФН-7 в результате потери или замолкания целевого гена. В дальнейшем растительный материал этих семей на анализ не брали. Наиболее перспективными оказались две семьи трансгенных растений табака — Inter 311 и Inter B, для которых и был продолжен анализ. Схема эксперимента представлена на рис. 1.
В результате тестирования растений этих семей на протяжении трех поколений нам удалось показать, что семья Inter 311 является гомозиготной по гену ИФН-7 быка и стабильно экспрессирует целевой ген (рис. 2). C другой стороны, для семьи Inter B было продемонстрировано расщепление по гену ИФН-7, которое может указывать на гетерозиготное состояние целевого гена. Однако все растения ИФН-7 + семьи Inter B также стабильно экспрессируют целевой ген. Таким образом, семью Inter B можно вывести в гомозиготное состояние по гену ИФН-7 в следующем или через поколение, и она также будет перспективной для продукции 7-интерферона.
Необходимо отметить, что с помощью метода обратной транскрипции нам удалось показать разный уровень экспрессии целевого гена среди трансгенных растений. Таким образом, для каждого из последующих анализов отбирались растения с наиболее высоким уровнем экспрессии ИФН-7 гена. В дальнейшем планируется осуществить количественную оценку ИФН-7, нарабатываемого в трансгенных растениях этих линий.
В заключение необходимо отметить, что данная работа по созданию растений-про-дуцентов продолжается. Параллельно с разработкой безопасной биотехнологической системы, легко применимой для получения фармакологических соединений в промышленности и сельском хозяйстве, каковой является данная система трансгенных растений табака, в которой происходит синтез бычьего ИФН-7, проводятся работы по созданию «съедобных адъювантов» с использованием гена ИФН-7 быка. Подобные «растения-адъюванты» можно будет использовать в качестве кормовой добавки, не выделяя целевой белок. В связи с этим в лаборатории был проведен отбор сортов моркови и гороха, характеризующихся высокой регенерационной способностью, также проведены работы по подбору и оптимизации методов агробактериальной трансформации для данных видов растений. Так, среди протестированных сортов морко-
Поколение Т0 Ходжайова Л. Т. Получение исходных растений методом аграбактериальной трансформации
Трансгенное растение Поколение Т,
Поколение Т, Савельева Н. В., Дудник Е. Э. Анализ наследования и экспрессии гена бычьего ^-интерферона
Поколение Т2 Анализ наследования и экспрессии гена бычьего ^-интерферона, сравнение белковых спектров
Поколение Т3 Анализ наследования и экспрессии гена бычьего ^-интерферона
Я
ю
ВЗ
X
О
Рн
О
&
я
!
о
Поколение Т,
Поколение Т,
ПЦР-анализ
Белковый электрофорез
К+ К- 1 2 3
ОТ-ПЦР-анализ
К+ К- 1
К-
1
^-интерферон (15 кДа)
Поколение Т,
ПЦР-анализ
К+ К- 1 2 3
ОТ-ПЦР-анализ
К+ К- 1 2 3
Рис. 1. Схема эксперимента.
МЖ''Ж'Ш'11 2 S ё § 1 2 3 4 5
Рис. 2. ПЦР, проведенная с кДНК растений линий Inter 311 и Inter B (поколения T3).
М — маркер, К- - — супернегативный контроль, К- — негативный контроль,
КН---положительный контроль, цифрами обозначены номера растений внут-
ри данного поколения (белым цветом — линии Inter B, черным — Inter 311).
ви и гороха наиболее оптимальными оказались сорт Нантская (морковь) и сорт Амброзия (горох), наиболее эффективными методами агробактериальной трансформации для моркови является метод трансформации апикальных меристем в условиях in vivo (70%), а для гороха — трансформация незрелых зародышей [12]. Таким образом, в данный момент в нашей лаборатории уже получены трансгенные растения гороха и моркови с геном 7-интерферона быка, наследование и экспрессия которого проверяется.
Заключение
Несомненно, что с каждым годом биотехнология все больше и больше внедряется в такие области, как сельское хозяйство, медицинская промышленность, а также другие сферы человеческой деятельности. В настоящее время получением и испытанием генетически модифицированных растений занимаются сотни коммерческих фирм во всем мире. Первый этап развития биотехнологии растений — получение устойчивых форм к болезням, гербицидам, вредителям, стрессам и так далее, уступил следующему этапу современной биотехнологии растений — «метаболической инженерии», который заключается в создании растений, способных синтезировать абсолютно новые вещества для медицины, химического производства и других областей. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, съедобные вакцины, антитела, интерфероны и другие «лекарственные» белки, новые полимеры, не засоряющие окружающую среду и многое, многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство этих веществ и тем самым сделать их более доступными для широкого потребления.
Литература
1. Гармашова Н. В., Казанский В. Е., Тышкевич О. Б., Доронин Б. М., Бунева В. Н., Невин-ский Г. А. Антитела к ДНК в крови больных клещевым энцефалитом // Молекуляр. биология. 2004. Т. 38, №4. C. 723-730.
2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология: принципы и применение. М.,
2002. 591 с.
3. Еникеева А. Г., Копытина Т. В., Семенова Л. А., Натяганова А. В., Гаманец Л. В., Волкова О. Д. Агробактериальная трансформация как комплексный биотический стрессирующий фактор // J. Stress Physiol. Biochem. 2008. Vol. 4, N1. P. 12-19.
4. Ершов Ф. И. Система интерферона в норме и при патологии. М., 1996. 240 с.
5. Зеленин А. В. Геном растений // Вестн. Рос. Акад. наук. 2003. Т. 73, №9. C. 51-64.
6. Катохин А. В., Кузнецова Т. Н., Омельянчук Н. А. миРНК — новые регуляторы активности генов у эукариот // Вестн. ВОГиС. 2006. Т. 10, №2. C. 241-272.
7. Кузмина Н.А. Основы биотехнологии. М., 1995. 205 с.
8. Лутова Л. А. Биотехнология высших растений. СПб., 2003. 228 с.
9. Мирошников П.Н., Лебедев Л. Р., Терещенко Т. А. Разработка способов получения ин-терферона-гамма и его мутантного аналога дельтаферона // Биотехнология: состояние и перспективы развития / Тез. докл. участн. II Московск. междунар. конгресса. М., 2003. C. 152.
10. Омельянчук Н. А., Кузнецова Т. Н., Катохин А. В. МикроРНК растений // Вестн. ВОГиС. 2005. Т. 9, №3. С. 440-450.
11. Рукавцова Е. Б., Бурьянов Я. И., Шульга Н. Я., Быков В. А. Трансгенные растения для фармакологии // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2006. № 2.
C. 3-12.
12. Савельева Н. В., Дудник Е. Э., Лутова Л. А. Создание и анализ растений-продуцен-тов бычьего гамма-интерферона // Сб. статей. Международная школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего». М.; СПб., (5-9 июня, 2006) СПб., 2006. С. 122-128.
13. Смирнов М. Н., Падкина М. В. Производство рекомбинантных белков человека на основе дрожжевых систем // Биотехнология: состояние и перспективы развития. Тез. докл. участн. II Московск. междунар. конгресса. М., 2003. C. 59.
14. Турчинович А. А., Дейнеко Е. В., Филипенко М. П., Храпов Е. А., Загорская А. А., Филиппенко Е. А., Сенников С. В., Козлов В. А., Шумный В. К. Получение трансгенных растений табака — продуцентов интерлейкина 18 человека // Доклады АН. 2004. Т. 395, №5. C. 704-707.
15. Турчинович А. А., Дейнеко Е. В., Филипенко М. П., Храпов Е. А., Шумный В. К. Трансгенные растения как биопродуценты белков медицинского назначения // Вестн. ВОГиС. 2004. Т. 40, №28. C. 456-463.
16. Хаитов Р. М., Игнатьева Г. А., Сидорович И. Г. Иммунология. М., 2002. 536 с.
17. Шевелуха В. С. Сельскохозяйственная биотехнология. М., 2003. 469 с.
18. Bardor M., Loutelier-Bourhis C., Paccalet T., Cosette P., Fitchette A. C. Monoclonal C5-1 antibody produced in transgenic alfalfa plants exhibits a N-glycosylation that is homogenous and suitable for glycol-engineering into human-compatible structures // Plant Biotechnol. J.
2003. Vol. 1. P. 451-462.
19. Barta A., Sommergruber K., Thompson D. The expression of a nopaline synthase human growth hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue // Plant Mol. Biol. 1986. Vol. 6. P. 347-357.
20. Chargelegue D., Vine N. D., van Dolleweerd C. J., Drake P. M. W., Ma J. K. A murine monoclonal antibody produced in transgenic plants with plant-specific glycans is not immunogenic in mice // Transgenic Res. 2000. Vol. 9. P. 187-194.
21. Chikwamba R., Cunnick J., Hathaway D. A functional antigen in a practical crop: LT-B producing maize protects mice against Escherichia coli heat labile enterotoxin (LT) and cholera toxin (CT) // Transgenic Res. 2002. Vol. 11. P. 479-493.
22. Chikwamba R. K., Scott M. P., Mejia L. B. Localization of a bacterial protein in starch granules of transgenic maize kernels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100. P. 11127-11132.
23. Conrad U., Fiedler U. Compartment-specific accumulation of recombinant immunoglobulins in plant cells: an essential tool for antibody production and immunomodulation of physiological functions and pathogen activity // Plant Mol. Biol. 1998. Vol. 38. P. 101-109.
24. Cooper A.M., Dalton D.K., Stewart T.A., Griffin J.P., Russell D. G., Orme I.M. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene disrupted mice // J. Exp. Med. 1993. Vol. 178. P. 2243-2247.
25. Elbers I. J., Stoopen G. M., Bosch D., Lommen A. Influence of growth conditions and developmental stage on N-glycan heterogeneity of transgenic immunoglobulin G and endogenous proteins in tobacco leaves // Plant Physiol. 2001. Vol. 126. P. 1314-1322.
26. Faye L., Gomord V., Fitchette-Laine A. C., Chrispeels M. J. Affinity purification of antibodies specific for Asn-linked glycan containing alpha 1 ^ 3 fucose or 1 ^ 2 xylose // Anal. Biochem. 1993. Vol. 209. P. 104-108.
27. Flynn J. L., Chan J., Triebold K. J., Dalton D. K., Stewart T. A., Bloom B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection // J. Exp. Med. 1993. Vol. 178. P. 2249-2253.
28. Gatz C., Quai P.H. Tn 10-encoded tet repressor can regulate an operator-containing plant promoter // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. Vol. 85. P. 1394-1397.
29. Gomord V., Chamberlain P., Jefferis R., Faye L. Biopharmaceutical production in plants: problems, solutions and opportunities // Trends Biotechnol. 2005. Vol. 23. P. 559-565.
30. Hellwig S., Drossard J., Twyman R. M., Fischer R. Plant cell cultures for the production of recombinant proteins // Nat. Biotechnol. 2004. Vol. 22. P. 1415-1422.
31. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants // Nature. 1989. Vol. 342. P. 76-78.
32. Kim S. M., Lee J. S., Kim W. J., Do S. I., Choo Y. K., Park Y. I. Increased a(2,3)-sialyation and hyperglycosylation of N-glycans in embryonic rat cortical neurons during camptothecin-induced apoptosis // Mol. Cells. 2007. Vol. 24. P. 416-423.
33. Ko K., Ahn M.-H., Choo Y.-K., Kim H. S., Ko K., Joung H. Glyco-engineering of biother-apeutic proteins in plants // Mol. Cells. 2008. Vol. 25. P. 494-503.
34. Kong Q., Richter L., Yang Y. F. Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants // Mol. Cells. 2001. Vol. 98. P. 11539-11544.
35. Koprivova A., Stemmer C., Altmann F., Hoffmann A., Kopriva S., Gorr G., Reski R., Decker E. L. Targeted knockouts of Physcomitrella lacking plant specific immunogenic N-glycans // Plant Biotech. J. 2004. Vol. 2. P. 517-523.
36. Kurosаka A., Yano A., Itoh N., Kuroda Y., Nakagawa T., Kawasaki T. The structure of a neural specific carbohydrate epitope of horseradish peroxidase recognized by anti-horseradish peroxidase antiserum // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 4168-4172.
37. Kusnadi A. R., Nikolov Z. L., Howard J. A. Production of recombinant proteins in transgenic plants: practical considerations // Biotechnol. Bioeng. 1997. Vol. 56. P. 473-484.
38. Lamphear B. J., Jilka J. M., Kesl L. A corn-based delivery system for animal vaccines: an oral transmissible gastroenteritis virus vaccine boosts lactogenic immunity in swine // Vaccine.
2004. Vol. 22. P. 2420-2424.
39. Lamphear B. J., Streatfield S. J., Jilka J. A. Delivery of subunit vaccines in maize seed // J. Control Release. 2002. Vol. 85. P. 169-180.
40. Ma J. K., Drake P. M., Christou P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plant // Nat. Rev. Genet. 2003. Vol. 4. P. 794-805.
41. Mason H. S., Lam D. M. K., Arntzen C. J. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. Vol. 89. P. 11745-11749.
42. Mett V. L., Lochhead L. P., Reynolds P. H. S. Copper-controllable gene expression system for whole plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 90. P. 4567-4571.
43. Moloney M., Boothe J., Van Rooijen G. Oil bodies and associated proteins as affinity matrices // US Patent 6509453. 2003.
44. Pagny S., Cabanes-Macheteau M., Gillikin J. W. Protein recycling from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum in plants and its minor contribution to calreticulin retention // Plant Cell. 2000. Vol. 12. P. 739-756.
45. Parmenter D.L., Boothe J.G., van Rooijen G.J.H. Production of biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partitioning // Plant Mol. Biol. 1995. Vol. 29. P. 11671180.
46. Pueyo J. J., Chrispeels M. J., Herman E. M. Degradation of transport-competent destabilized phaseolin with a signal for retention in the endoplasmic reticulum occurs in the vacuole // Planta. 1995. Vol. 196. P. 586-596.
47. Richter L. J., Thanavala Y., Arntzen C. J., Mason H. S. Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization // Nat. Biotechnol. 2000. Vol. 18. P. 1167-1171.
48. Salter M. G., Paine J.A., Riddell K. V., Jepson I., Greenland A. J., Caddick M.X., Tom-sett A. B. Characterisation of the ethanol-inducible alc gene expression system for transgenic plants // Plant J. 1998. Vol. 16. P. 127-132.
49. Schoffl F., Baumann G. Thermo-induced transcripts of a soybean heat shock gene after transfer into sunflower using a Ti plasmid vector // EMBO J. 1985. Vol. 4. P. 1119-1124.
50. Smith M. L., Mason H. S., Shuler M. L. Hepatitis B surface antigen (HBsAg) expression in plant cell culture: Kinetics of antigen accumulation in batch culture and its intracellular form // Biotechnol. Bioeng. 2002. Vol. 80. P. 812-822.
51. Sriraman R., Bardor M., Sack M. Recombinant anti-hCG antibodies retained in the endoplasmic reticulum of transformed plants lack core-xylose and core-a(1,3)-fucose residues // Plant Biotechnol. J. 2004. Vol. 2. P. 279-288.
52. Staub J. M., Garcia B., Graves J. High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts // Nat. Biotechnol. 2000. Vol. 18. P. 333-338.
53. Streatfield S. J., Lane J. R., Brooks C. A. Corn as a production system for human and animal vaccines // Nat. Biotechnol. 2003. Vol. 21. P. 812-815.
54. Tacket C. O., Mason H. S. A review of oral vaccination with transgenic vegetables // Microbes and Infection. 1999. Vol. 1. P. 777-783.
55. Tacket C. O., Mason H. S., Losonsky G. Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato // Nat. Med. 1998. Vol. 4. P. 607-609.
56. Tacket C. O., Mason H. S., Losonsky G. Human immune responses to a novel norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes // J. Infect. Dis. 2000. Vol. 182. P. 302-305.
57. Thanavala Y., Mahoney M., Pal S. Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis B // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. Vol. 102. P. 3378-3382.
58. Thanavala Y., Yang Y. F., Lyons P. Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 3358-3361.
59. Thomas B. R., Deynze A. V., Bradford K. J. Production of therapeutic proteins in plants, agricultural biotechnology in California series // Publication 8078. 2002.
60. Tregoning J. S., Maliga P., Dougan G., Nixon P. New advances in the production of edible plant vaccines: chloroplast expression of a tetanus vaccine antigen, TetC // Phytochem. 2004. Vol. 65. P. 989-994.
61. Tregoning J. S., Nixon P., Kuroda H. Expression of tetanus toxin fragment C in tobacco chloroplasts // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31. P. 1174-1179.
62. TTiguero A., Cabrera G., Cremata J. A. Plant-derived mouse IgG monoclonal antibody fused to KDEL endoplasmic reticulum-retention signal is N-glycosylated homogeneously throughout the plant with mostly high-mannose-type N-glycans // Plant Biotechnol. J. 2005. Vol. 3. P. 449-457.
63. Tuboly T., Yu W., Bailey S. Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants // Vaccine. 2000. Vol. 18. P. 2023-2028.
64. van Ree R., Cabanes-Macheteau M., Akkerdaas J., Milazzo О. P., Loutelier-Bourhis C., Rayon C., Villalba M., Koppelman S., Aalberse R., Rodriguez R. Beta(1,2)-xylose and alpha(1,3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 11451-11458.
65. Vesosky B., Flaherty D., Turner J. Th1 cytokines facilitate CD8-T-cell-mediated early resistance to infection with Mycobacterium tuberculosis in old mice // Infect. Immun. 2006. Vol. 74. P. 3314-3324.
66. Walmsley A. M., Arntzen C. J. Plants for delivery of edible vaccines // Curr. Opin. Biotech-nol. 2000. Vol. 11. P. 126-129.
67. Wandelt C. I., Khan M. R., Craig S. Vicilin with carboxy-terminal KDEL is retained in the
endoplasmic reticulum and accumulates to high levels in the leaves of transgenic plants jj Plant J.
1992. Vol. 2. P. 181-192.
68. Waters W. R., Nonnecke B. J., Palmer M. V. Fusion Protein for Differentiation of Infections of Cattle by Mycobacterium bovis and by M. avium subsp. avium and M. avium subsp. Paratuber-culosis jj CDLI. 2004. Vol. 11. P. 729-735.
69. Wee E. G., Sherrier D. J., Prime T.A., Dupree P. Targeting of active sialyltransferase to
the plant Golgi apparatus jj Plant Cell. 1998. Vol. 10. P. 1759-1768.
70. Yuan L., Knauf V. C. Modification of plant components jj Curr. Opin. Biotechnol. 1997. Vol. 8. P. 227-233.
Статья поступила в редакцию ЗІ июля 2009 г.
