CC BY
55
СОЗДАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ НА ОСНОВЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА И ИЗУЧЕНИЕ ИХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
В.В. Сайфетдинова \ Т.А. Байтукалов О.С. Пахомов A.C. Шеремет В.И. Иванова-Радкевич O.A. Богословская \ H.H. Глущенко !, И.П. Ольховская2, М.Н. Овсянникова2, В.П. Варламов3, С.А. Лопатин 3
1Кафедра фармацевтической и токсикологической химии, медицинский факультет, РУДН, ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198, Москва, Россия 2Институт энергетических проблем химической физики РАН, Ленинский просп., д. 38, корп. 2, 119334, Москва, Россия 2Центр «Биоинженерия» РАН, просп. 60-летия октября, д. 7, корп. 1,
117312, Москва, Россия
Проведено исследование состава олигомерных фракций низкомолекулярного хитоза-на (НМХ) методом ВЭЖХ и установлено, что олигомерная часть НМХ с М=10,7 кДа представляет собой смесь олигомеров с преимущественным содержанием мономеров (30,82%). Исследована антибактериальная активность НМХ на двух раневых штаммах Е. coli и St. albus. Показано, что наибольшим антибактериальным эффектом обладает хито-зан с М=72 кДа в концентрации 20 мг/мл. Разработана технология приготовления лекарственных форм (ЛФ) - гелей на метилцеллюлозе-ЮО (МЦ-100), содержащих НМХ в разных концентрациях. Изучены ранозаживляющие свойства созданных ЛФ. Установлено, что разработанные ЛФ стимулируют ранозаживление. Наиболее эффективными по показателю времени полузаживления оказались гель, содержащий НМХ (М=72 кДа) в концентрации 2%, и гель, содержащий НМХ (М=10,7 кДа) в концентрации 0,1%.
Создание высокоэффективных ранозаживляющих препаратов, обладающих пролонгированным и комплексным действием, является важной задачей фармацевтической науки. Наше внимание привлек низкомолекулярный хитозан (НМХ), который, обладая свойством растворяться при нейтральных pH, нашел широкое применение в косметике и в качестве биологически активных добавок [4]. Однако его влияние на течение регенерационных процессов еще не исследовалось. В связи с этим целью настоящей работы является изучение биологической активности НМХ и создание лекарственных форм (ЛФ) на его основе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали НМХ пищевой, М=72 и 10.7 кДа, изготовитель ЗАО Биопрогресс г. Щелково по ТУ 9283-002-11418234-99. Субстанция представляет собой тонкодисперсный порошок желтоватого цвета, высушенный на распылительной сушке и рыхлый, белый лиофильно высушенный порошок, соответственно. Для изготовления гелей использовали: метилцеллюлозу-100 (МЦ-100), которая представляет собой простой эфир целлюлозы и метилового спирта.
Исследование состава низкомолекулярного хитозана было проведено методом ВЭЖХ на колонке separon SGX NH2 (3x150 мм), скорость элю-ции 0.8 мл/мин., элюент ацетонитрил-вода 70:30 на хроматографе SYKAM (Германия). Содержание каждого олигомера выражали в % от общего количества выделенных олигомеров.
Исследование ранозаживляющих свойств ЛФ проводилось на взрослых мышах-самках линии СНК, массой 18-20 г. Мышей делили на группы по 7 животных в каждой. Под эфирным наркозом на спине у мышей выстригалась шерсть, по трафарету наносились контуры раны (круг площадью 60 мм2), и затем с помощью хирургических ножниц с закругленными концами вырезался слой кожи. Все раны оставались открытыми вплоть до окончания опыта. Мышам опытной группы сразу же после операции (а в дальнейшем ежедневно) на поверхность раны наносили исследуемую ЛФ массой 0,2 г. Контуры раны 1 раз в двое суток (или чаще) переносились на прозрачные пленки, которые затем сканировались на сканере Umax Astra 4500. Площадь раны рассчитывалась с помощью компьютерной программы ImageJ 1.30v.
Микробиологическая активность растворов НМХ М=:72 кДа и НМХ М=10.7 кДа в концентрациях 20 мг/мл, 2 мг/мл, 0,2 мг/мл определялась на чашках Петри одинакового диаметра с ровным плоским слоем среды для выращивания тест-микробов: E. coli 1157 (госпитальный штамм) и St. albus. Состав питательной среды: пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, хлорид натрия - 5 г, агар - 2% на 1 л дистиллированной воды. На каждой чашке в агар-агаре делали 4 лунки для закапывания 0,2 мл испытуемого раствора. Готовые чашки Петри на 24 часа помещали в термостат при температуре, оптимальной для роста тест-культур. По величине зоны задержки роста определялась интенсивность влияния испытуемого образца на тест-культуры. Параллельно проводили определение величины зоны задержки роста для субстанции сульфаниламидного препарата фталазола в концентрации 20 мг/мл, 2 мг/мл, 0,2 мг/мл и субстанции левомицетина в тех же концентрациях [3].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследуемый нами НМХ является полимером, который получают из хитина реакцией деацетилирования [2].
Наиболее доступным для промышленного освоения и масштабным источником получения хитина являются панцири промысловых ракообразных, преимущественно панцири дальневосточных промысловых крабов. Известно, что молекулярная масса хитозанов, получаемых из панцирей ракообразных химическими и ферментативными способами, очень высокая и составляет до 10000 кДа. Такие хитозаны нерастворимы в воде, что для медицинских целей неприемлемо. Вот почему исходный хитозан подвергают гидролизу с помощью химических реагентов или ферментов, что позволяет получать НМХ, растворимые в воде [1,2].
Результаты анализа состава олигомерных фракций в НМХ, проведенного методом ВЭЖХ, представлены в табл. 1.
Таблица 1
Состав олигомерных фракций в НМХ М=10,7 кДа___________________
Степень полимеризации Время удерживания, мин. S пика, мм2 Содержание фракции в НМХ, %
1 2.883 44612 30.82
2 3.883 26559.49 18.35
3 5.2 26542.24 18.33
4 7.133 24493.42 16.92
5 9.816 15826.26 10.94
6 13.733 6721.798 4.64
Из табл. 1 видно, что олигомерная часть образца содержит преимущественно мономеры (30.82%), примерно одинаковое количество ди- и три-меров (18.35%, 18.33% соответственно), меньшее количество тетра- и пентамеров (16.92%, 10.94% соответственно) и незначительное количество гексамеров (4.64%).
Известно, что хитозаны обладают антибактериальной активностью, которая зависит от молекулярной массы и степени деацетилирования [5]. Однако микробиологическая активность НМХ еще не исследовалась.
Результаты изучения влияния НМХ на рост тест-культур приведены в таблицах 2, 3 и на рис. 1.
Таблица 2
Изменение размера площади (мм2) зоны задержки роста культуры E. coli при дей-__________________ ствии НМХ с разной молекулярной массой______________________
Показатель Испытуемое вещество
левомицетин фталазол НМХ М=72 кДа НМХ М=10.7 кДа
Концентрация (мг/мл) 20 20 20 20
S зоны задержки роста (мм2) Вся поверхность чашки 0 153.9 94.9
Рис. 1. Зоны задержки роста культуры E. coli на чашках Петри
Как видно из приведенных данных, антимикробная активность лево-мицетина по отношению к культуре E. coli очень высока, фталазол не вызывает задержки роста культуры, исследуемые образцы НМХ образуют
зону задержки роста в концентрации 20 мг/мл. Причём НМХ с М=72 кДа проявляет большую антибактериальную активность по отношению к Е. coli по сравнению с НМХ с М=10.7 кДа.
Таблица 3
Изменение размера площади (мм2) зоны задержки роста культуры St. albus при ________________действии НМХ с разной молекулярной массой_____________________
Показатель Испытуемое вещество
левомицетин фталазол НМХ М=72 кДа НМХ М=10.7 кДа
Концентрация (мг/мл) 20 20 20 20
S зоны задержки роста (мм2) 1133.5 0 314.0 254.3
Результаты исследований антибактериальной активности по отношению к тест-культуре St. albus, показали, что у левомицетина зона задержки роста очень велика, у фталазола она отсутствует. Зоны задержки роста исследуемых образцов НМХ приблизительно равны между собой, но они меньше чем у левомецитина.
Полученные данные свидетельствуют о целесообразности создания ЛФ на основе НМХ. Поэтому нами были разработали ЛФ - гели с НМХ в концентрациях 0,1, 0,5 и 2%. В качестве основы мы выбрали МЦ-100.
ЛФ готовили следующим образом: нипагин растворяли в воде при нагревании, в полученный раствор добавляли известное количество МЦ-100. Полимер оставляли набухать на 3 часа. Точную навеску НМХ растворяли в воде и прибавляли к определённому количеству геля МЦ-100, перемешивали с помощью мешалки фирмы WLW, модель ER-10, следя за тем, чтобы в полученную массу не набирались пузырьки воздуха. Конечный продукт представляет собой желтоватый прозрачный гель, однородный по составу, без механический включений, с очень слабым специфическим запахом.
Для исследования ранозаживляющих свойств полученных гелей была использована модель экспериментальных полнослойных ран. На рис. 2 представлены кинетические кривые изменения площади ран нелеченных животных, а также животных, леченных гелем на МЦ-100, а также гелем, содержащим 2% НМХ с М=72кДа. Видно, что наибольшей регенерирующей активностью обладает гель с НМХ.
На основании кинетических кривых ранозаживления было рассчитано время полузаживления ран (табл. 4). Сравнение значений времени полу-заживления контрольных и исследуемых групп проводили с помощью критерия Стьюдента.
Видно, что наибольшей активностью по показателю время полузаживления обладают гели, содержащие 2% НМХ с М=72 кДа и 0,1% НМХ с М=10,7 кДа. Они уменьшают время полузаживления на 58% и на 47%, соответственно, по сравнению с нелеченной группой, и на 43% и на 27% -по сравнению с гелем МЦ без НМХ.
Сут Контроль 'чачГель на МЦ-100 \Гель с НМХ (М=72 кДа)
Рис. 2. Кинетика изменения площади ран (в % от первоначальной площади раны) контрольных и леченных животных
Таблица 4
Г руппа Время полуза-живления Сравнение с контролем (уровень значимости) Сравнение с основой - гелем на МЦ-100 (уровень значимости)
Контроль 6,0 ± 1,6
Основа (гель на МЦ-100) 4,4 ± 0,7 р < 0,05
0,1% НМХ-1 в геле на МЦ-100 3,7 ± 0,7 р < 0,01 не знач.
0,5% НМХ-1 в геле на МЦ-100 3,7 ± 1,0 р < 0,01 не знач.
2% НМХ-1 в геле на МЦ-100 2,5 ± 1,1 р < 0,01 р < 0,01
0,1% НМХ-2 в геле на МЦ-100 3,2 ± 0,9 р < 0,01 р < 0,05
0,5% НМХ-2 в геле на МЦ-100 4,1 ± 1,6 р < 0,05 не знач.
2% НМХ-2 в геле на МЦ-100 3,8 ± 0,9 р < 0,05 не знач.
Примечание: во всех группах n=7. НМХ-1 - НМХ с М=72 кДа, НМХ-2 - НМХ с М=10.7 кДа.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные исследования свидетельствуют о перспективности использования водорастворимого НМХ в составе ЛФ, обладающих ранозаживляющей и антибактериальной активностью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Быкова В.М., Кривошеина Л.И., Глазунов О.И. и др. Модификации хитина и хитоза-на // Материалы 5 конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана»; М.: ВНИРО, 1999. С. 215-217.
2. Гамзазаде А.И., Скляр А.М., Рогожин С.В. II Высокомол. соед. 1985. T. А23. 3. С.594-597.
3. Крапивин Е.В. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.: Медицина, 1973. 478 с.
4. Хисматуппин М. Р. Разработка и изучение функциональных аспектов действия косметических препаратов с биологически активными составляющими природных компонентов пчеловодства. (2003). Дисс. канд. биол. наук, Москва: Центр «Биоинженерия» РАН. 145с.
5. Червинец В.М., Бондаренко В.М. Комаров Б.А. Антимикробная активность хитозана с различной молекулярной массой // Материалы 6 конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана»;. М.: ВНИРО, 2001.С.252-254
NEW MEDICINAL FORMS WTH LOW-MOLECULAR CHITOSAN AND STUDY OF THEIR BIOLOGICAL ACTIVITY
V.V. Sayfetdinova \ T.A. Baitukalov \ O.S. Pakhomov \ A.S. Sheremet \ V.I. Ivanova-Radkevich *, O.A. Bogoslovskaya \ N.N. Glushchenko \ I.P. Olkhovskaya 2, M.N. Ovsyannikova 2, V.P. Varlamov 3, S.A. Lopatin 3
department ofpharmaceutical and toxicological chemistry, medical faculty, RPFU, Miklukho-Maklaya,,8, 117198, Moscow, Russia 2Institute for Energy Problems of Chemical Physics RAS, Leninski prospekt 38,
Bid. 2, 117334, Moscow, Russia 3Center «Bioenzheneriya» RAS, prospect 60-letiya oktyabrya, 7, Bid. 1,
117312, Moscow, Russia
The composition of oligomer fraction of low-molecular chitosan (LMC) has been studied using HPLC method, and it was shown, that the oligomer part of LMC (M=10.7 kDa) is a mixture of oligomers with the large amount of monomers (30.82%). The antibacterial activity of LMC was studied on two wound cultures: E. coli and St. albus. The LMC (M=72 kDa) revealed the highest antibacterial effect in the concentration 20 mg/ml. We have developed the technology of the medicinal forms - metylcellulose-100 gel (MC gel), containing LMC in different concentrations. The wound healing effect of these gels was studied. It was shown, that the gels possess the wound healing properties. Using the time of wound half closure as the evaluation criteria the most effective forms are gel, containing LMC (M=72 kDa) in the concentration 2%, and gel, containing LMC (10,7 kDa) in the concentration 0,1%.
