CC BY
6Н.И. Дубовец, Е.А. Сычева, Л.А. Соловей, Т.И. Штык, Е.Б. Бондаревич, А.Ю. Носова
СОЗДАНИЕ И ОЦЕНКА ВТОРИЧНОГО ГЕНОФОНДА ТРИТИКАЛЕ (х TRITICOSECALE WITTM.) ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИИ НА КОРОТКОСТЕБЕЛЬНОСТЬ И УСТОЙЧИВОСТЬ К ПРЕДУБОРОЧНОМУ ПРОРАСТАНИЮ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Наблюдаемый в последнее время в республике динамичный рост посевов тритикале обусловлен такими преимуществами культуры, как высокая урожайность и кормовая ценность зерна, устойчивость к ряду болезней и неблагоприятным почвенно-климатическим условиям. То обстоятельство, что в Беларуси преобладают почвы с невысоким уровнем плодородия, на которых получать хорошие и стабильные урожаи пшеницы удается далеко не всегда, в немалой степени способствовало внедрению и быстрому росту популярности тритикале. В настоящее время по занятым под этой культурой посевным площадям (около 500 тыс. га) республика занимает второе место в мире. В Госреестр РБ включено более 20 сортов как зарубежной, так и отечественной селекции.
В то же время тритикале свойственен ряд недостатков, которые в значительной мере снижают коммерческий интерес к этой культуре. К наиболее существенным из них относятся склонность к прорастанию на корню и отно-
сительно высокая соломина, обуславливающая предрасположенность к полеганию в условиях интенсивного земледелия.
Возможности традиционной селекции тритикале по этим признакам существенно ограничивает тот факт, что ряд значимых для их проявления генов локализован в хромосомах D-генома пшеницы, отсутствующего у обычных гексаплоидных пшенично-ржаных амфидиплоидов [1, 2]. Наиболее реальный выход из сложившейся ситуации видится в использовании хромосомно-инженерных технологий и создании с их помощью вторичных рекомбинантных форм тритикале, пшеничный компонент кариотипа которых составлен различными сочетаниями хромосом всех трех субгеномов пшеницы (А, В и D).
В статье изложены результаты создания вторичных рекомбинантных форм тритикале и их изучения на перспективность использования в селекции на короткостебельность и устойчивость к предуборочному прорастанию.
Материалы и методы
Для получения вторичных рекомбинантных форм тритикале были использованы современные сорта тритикале Лана, Карго, Мешко (2п=6х=42; ААВВЯЯ), отобранные по комплексу хозяйственно-полезных признаков, и D(А)- и D(В)-замещенные формы гексаплоидных тритикале, синтезированные в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси в 90-х годах прошлого столетия на основе популярных в то время образцов октоплоидных тритикале [3]: ПРАГЗ-2 с Ш(1А), 2D(2B)-замещениями; ПРАГЗ-3 с т(1А), 6D(6B) - замещениями; ПРАГЗ-4 с Ш(1А), 2D(2B), 6D(6B)-замещениями.
Анализ геномной структуры экспериментального материала проводился с помощью метода дифференциального окрашивания хромосом по Гимза (С-бэндинг) [4]. Идентификация индивидуальных хромосом А-, В-, D- и Я-геномов осуществлялась согласно обобщенной видовой идиограмме дифференциально окрашенных хромосом [5].
Для анализа устойчивости гибридов к предуборочному прорастанию использован метод проращивания свежеубранного зерна в чашках Петри в термостате при температуре 26 °С [6].
Выделение и очистку ДНК осуществляли с
помощью готовых наборов реактивов Genomic DNA Purification Kit К0512 (Fermentas, Литва). Для выявления аллельного состава генов короткостебельности Rht-B1 и Rht8 использовались праймеры в модификации Zhang X. et al. (2006) [7].
Продукты ПЦР фракционировали методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле в 1*ТАЕ буфере в течение
Результаты и
Получение линейного материала вторичных рекомбинантных форм гексаплоидных тритикале
С целью создания вторичных хромосомно-замещенных форм гексаплоидных тритикале замещенные линии гексаплоидных тритикале ПРАГЗ-2, ПРАГЗ-3 и ПРАГЗ-4 были скрещены с сортами тритикале Лана, Карго, Мешко (рис. 1).
45 мин при напряжении в 100 В. Результат документировался в системе гель документации QUANTUM ST4-1100. Для точного определения размера амплифицированных фрагментов с SSR-маркерами был проведен фрагментный анализ продуктов ПЦР. Данные анализировались в программной среде, поставляемой с прибором AppliedBiosystems 3500 Genetic Analyzer.
обсуждение
Полученные гибриды Fj и F2 выращивались в условиях принудительного самоопыления. Для создания линейного материала сбор урожая в F3 был произведен индивидуально по каждому растению. Часть собранных с растения зерен была использована для идентификации хромосомного состава с помощью метода дифференциального окрашивания хромосом по Гимза (С-бэндинг).
Рис. 1. Схема интрогрессии хромосом D-генома пшеницы в сорта тритикале Теоретически ожидаемые типы межгеномных замещений: Ш(1А), 2D(2В), 6D(6В)
Анализ геномной структуры гибридных форм показал, что хромосомы Б-генома пшеницы включаются в кариотип сортов тритикале с высокой частотой (табл. 1). В общей сложности по всем комбинациям скрещиваний было проанализировано 96 индивидуаль-
ных растений, из которых 73 (76%) содержали хромосомы Б-генома пшеницы в моносоном и дисомном состоянии (рис. 2а), при этом процесс интрогрессии Б-хромосом зависел от ге-нотипической среды вновь синтезированного гибридного растения.
Таблица 1
Типы межгеномных замещений хромосом в гибридном материале F4
Комбинация скрещивания Количество проанализированных индивидуальных растений Р3, шт. Количество растений с интрогрессией хромосом D генома, % Количество пар хромосом D-генома Типы замещений
Мешко х ПРАГЗ-4 15 93,3 1 - 3 Ю(1А), 2D(2А), 2D(2В), 6D(6В), 6D(6А)
Лана х ПРАГЗ-4 17 41,2 1 1D(1A), 1D(1В), 2D(2B)
Мешко х ПРАГЗ-3 18 67,0 1 1D(1A), 6D(6В)
Карго х ПРАГЗ-3 17 71,4 1 - 2 Ш(1А), 6D(6A)
Лана х ПРАГЗ-3 10 100,0 1 - 2 1D(1A), 6D(6В)
Лана х ПРАГЗ-2 19 79,0 1 - 2 1D(1A), 2D(2В), 2D(2А)
Рис. 2. Кариотипы растений: а) форма из комбинации срещивания Мешко х ПРАГЗ-4 с Ш(1А)-, 2Б(2В)-, моно-6Б(6В)-замещениями; б) форма из комбинации скрещивания Лана х ПРАГЗ-4 с Ш(1В)-замещением хромосом и аберрантной 1DS.1DL-1AL-хромосомой; в) линии № 12 с Ш(1А)- и 2Б(2В)-замещениями хромосом;
г) линии № 7 с Ш(1А)- замещением хромосом
Самая низкая частота интрогрессии хромосом D-генома (41,2%) отмечена в комбинации скрещивания Лана х ПРАГЗ-4, тогда как в комбинации Лана х ПРАГЗ-3 этот показатель был равен 100%, из чего следует, что, расширяя генетическое разнообразие включенных в гибридизацию сортов и хромосомно-замещенных линий, можно существенно повысить частоту образования рекомбинантных А/В/DRR форм.
Если оценивать в целом частоту интрогрессии индивидуальных хромосом D-генома в кариотип 6х-тритикале, то более низкой частотой характеризовалась хромосома 6D (36,1%). Хромосома 2D в проанализированном материале встречалась с частотой 49%, причем у 88% индивидуальных растений присутствовала в дисомном состоянии. Самая
Морфометрический анализ рекомбинантных форм гексаплоидных тритикале
Для предварительной оценки и отбора наиболее перспективных для дальнейшей селекционной проработки образцов был проведен морфометрический анализ вторичных рекомбинантных форм гексаплоидных тритикале. Поскольку традиционная селекция тритикале на устойчивость к полеганию и предуборочному прорастанию зерна базируется на анализе ряда морфологических признаков, оказывающих влияние на степень проявления этой устойчивости, в ходе исследования, кроме признаков продуктивности, оценивались также высота растения, плотность колоса и остистость. Результаты оценки представлены в табл. 3.
Высота растения является основным лимитирующим фактором устойчивости к поле-
высокая частота интрогрессии была отмечена для хромосомы 1D - ее содержали 65,6% растений F4, в том числе в дисомном состоянии - 73%.
В потомстве F4 были отмечены случаи образования аберрантных хромосом: 1DS. 1DL-1AL (рис. 2б) у двух растений (Лана х ПРАГЗ-4) и 3DS-3AS.3AL у растения в комбинации Лана X ПРАГЗ-3.
По результатам геномного анализа из гибридных популяций F4 было выделено 8 стабильных рекомбинантных линий с различными типами D(A)- и D(B)-замещений хромосом в дисомном состоянии (табл. 2, рис. 2 в, г), которые были оценены на перспективность использования в селекции на короткостебельность и устойчивость к предуборочному прорастанию.
Таблица 2
ганию. Как видно из табл. 3, значение этого признака у проанализированных линий колеблется от 105,2 до 123,37 см. Согласно существующей классификации ВИР, все проанализированные линии (за исключением линии № 3) относятся к категории среднерослых.
По совокупности признаков продуктивности выделяется линия № 22. Близка к ней по значениям массы зерна с колоса и массы 1000 зерен линия 12, которая также характеризуется более высокой плотностью колоса, что делает ее более устойчивой к предуборочному прорастанию, поскольку, чем плотнее скомпонован колос, тем меньше вероятность попадания в него влаги при выпадении осадков [6]. Наиболее высокая плотность колоса (26,4 колоска на 10 см длины колоса) отмечена для линии № 6, наименьшая (22,5 колосков на 10 см длины колоса) - линии № 4 (рис. 3).
Типы межгеномных замещений хромосом у вторичных рекомбинантных
форм гексаплоидных тритикале
Комбинация скрещивания Номер линии Типы межгеномных замещений хромосом
Лана х ПРАГЗ-2 6 2D(2B)
12 1D(1A), 2D(2B)
Лана х ПРАГЗ-3 4 6D(6B)
11 1D(1A), 6D(6B)
Карго х ПРАГЗ-3 14 1D(1A)
22 1D(1A)
Мешко х ПРАГЗ-3 3 1D(1A)
7 1D(1A)
Продолжение табл. 3
Таблица 3
Морфометрический анализ вторичных хромосомно-замещенных форм
гексаплоидных тритикале
Линия, № Высота растения, см Длина колоса, см Количество колосков в колосе, шт. Плотность колоса
6 105,27±1,00 8,28±0,16 21,80±0,33 26,42±0,35
12 118,33±1,22 8,88±0,19 21,73±0,38 24,73±0,40
4 113,50±1,37 10,20±0,19 22,83±0,34 22,50±0,26
11 105,20±1,73 8,25±0,20 19,07±0,40 23,23±0,34
14 113,30±1,66 8,90±0,18 22,13±0,31 25,02±0,34
22 113,77±1,10 8,95±0,18 20,13±0,35 22,59±0,32
3 123,37±1,49 8,50±0,20 22,00±0,45 26,02±0,34
7 111,13±1,93 8,70±0,09 21,73±0,22 25,02±0,25
Линия, № Количество цветков в колосе, шт. Количество зерен в колосе, шт. Завязывае-мость Масса зерна с колоса, г Масса 1000 зерен, г
6 58,40±1,69 36,83±1,74 62,61±1,88 1,36±0,08 37,00±1,17
12 58,13±1,71 34,30±1,72 58,67±2,31 1,41±0,08 40,97±1,22
4 66,07±2,04 32,80±1,18 49,78±1,09 1,01±0,04 30,71±0,59
11 48,50±1,54 27,83±1,71 57,07±2,77 1,05±0,07 37,54±1,12
14 66,37±2,08 36,03±2,05 53,95±2,27 0,77±0,05 21,64±1,16
22 57,77±1,57 35,40±1,26 61,11±1,21 1,47±0,07 41,51±1,28
3 58,27±1,57 34,10±1,42 58,62±1,89 1,17±0,06 34,64±1,27
7 61,93±1,27 38,07±1,86 61,12±2,54 1,10±0,07 28,96±1,07
На прорастание зерна в колосе, кроме плотности колоса, влияют такие морфологические особенности как наличие остей и степень открытия цветковых чешуй. Согласно литературным данным сорта, которые характеризуются сочетанием остистости, рыхлого колоса и открытых цветковых чешуй, имеют тенденцию к прорастанию на корню [6]. В плане остистости среди проанализированных вторичных реком-бинантных форм выделяется линия № 7 - растения этой линии имеют полуостистые колосья с короткими остями. Линии № 3, № 4 и № 11 также характеризуются наличием полуостистых колосьев, но с остями средней длины (рис. 3а). Для остальных линий отмечено наличие длинных остей, расположенных по всему колосу.
Таким образом, по совокупности морфологических и количественных признаков в проана-
лизированном материале для дальнейшей селекционной работы можно выделить линию № 12 из комбинации скрещивания Лана х ПРАГЗ-2.
Лабораторная оценка на устойчивость к предуборочному прорастанию рекомбинант-ных форм гексаплоидных тритикале
Для лабораторной оценки устойчивости гибридных форм к предуборочному прорастанию был использован метод проращивания свежеубранного зерна в чашках Петри. В ходе исследования анализировалось число проросших зерен (ППЗ) при проращивании в чашках Петри (по 100 зерен каждого образца в двух повторностях) в течение 24 и 48 ч. При этом число проросших зерен через 24 ч показывает стартовую способность прорастания самого зерна, а через 48 ч определяются межсортовые различия по прорастанию зерна тритикале.
Рис. 3. а) колосья рекомбинантных линий гексаплоидных тритикале; б) показатель плотности колоса у рекомбинантных линий гексаплоидных тритикале 1 - линия № 6; 2 - линия № 12; 3 - линия № 4; 4 - линия № 11;5 - линия № 14; 6 - линия № 22;
7 - линия №3; 8 - линия № 7
Как видно из табл. 4, среди рекомбинантных линий, полученных с участием сорта Мешко, одна по среднему значению показателя ППЗ была на уровне исходного сорта, а другая незначительно превосходила его. Среди двух линий на основе сорта Карго линия № 14 характеризовалась пониженной устойчивостью к предуборочному прорастанию зерна, в то время как у линии № 22 значение ППЗ было на 16% ниже, чем у исходного сорта (обе линии содержат Ш(1А)-замещение хромосом). В материале, полученном с участием сорта Лана, две рекомбинантные линии с одиночными межгеномными замещениями хромосом (линия №26 с 2Б(2В)-замещением и линия
№ 4 с 6Б(6В)-замещением хромосом) имели значение ППЗ на 2-4% выше, чем у сорта, в то время как линия № 12 с Ш(1А)- и 2Б(2В)-замещениями и линия № 11 с Ш(1А)- и 6Б(6В)-замещениями были более устойчивы к прорастанию на корню.
Особого внимания при этом заслуживает линия № 11, у которой среднее по двум по-вторностям опыта значение ППЗ было почти в два раза ниже (на 44,6%), чем у сорта Лана. Данная линия может быть рекомендована для включения в селекционный процесс в качестве исходного материала при создании устойчивых к предуборочному прорастанию сортов тритикале.
Таблица 4
Оценка устойчивости рекомбинантных форм тритикале к предуборочному прорастанию зерна
Комбинация скрещивания, номер линии Количество проросших зерен (1-я повторность), % Количество проросших зерен (2-я повторность), %
24 ч 48 ч 24 ч 48 ч
Карго х ПРАГЗ-3 Линия № 14 74,75 85,86 75,76 85,86
Карго х ПРАГЗ-3 Линия № 22 49,45 67,73 28,57 50,08
Лана х ПРАГЗ-2 Линия № 6 77,55 82,65 72,73 83,73
Лана х ПРАГЗ-2 Линия № 12 45,45 70,71 53,19 65,96
Лана х ПРАГЗ-3 Линия № 4 80,61 88,69 64,00 74,00
Лана х ПРАГЗ-3 Линия № 11 18,48 31,81 23,71 36,84
Мешко х ПРАГЗ-3 Линия № 3 60,61 74,61 64,00 74,00
Мешко х ПРАГЗ-3 Линия № 7 65,66 81,82 65,00 79,00
Карго 57,00 72,00 67,00 78,00
Лана 80,81 84,85 69,00 73,00
Мешко 64,89 70,89 69,00 81,00
Анализ аллельного состава генов коротко-стебельности Rht-B1 и Rht8 у рекомбинантных форм гексаплоидных тритикале
Проведенный нами предварительный анализ геномной структуры вторичных линий тритикале с помощью дифференциального окрашивания хромосом по Гимза дает возможность целенаправленно использовать ПЦР-маркеры для идентификации аллелей генов короткосте-бельности.
Как известно, ген Rht-B1 локализован в коротком плече хромосомы 4В и, следовательно, будет присутствовать у всех отобранных рекомбинантных линий. Интерес для селекции на короткостебельность представляет мутантный аллель этого гена Rht-B1b, гомо-зиготность по которому по имеющимся данным обеспечивает снижение высоты растений пшеницы на 41-42%.
Анализ рабочей коллекции по аллельному составу гена Rht-B1 показал (табл. 5), что му-
тантный аллель Rht-B1b содержат все реком-бинантные линии за исключением № 3 и № 7 (рис. 4). Линия 3 характеризуется наличием дикого аллеля гена Rht-B1 (Rht-B1а) (рис. 4), а у линии № 7 ген Rht-B1 представлен как диким, так и мутантным аллелем.
Ген Rht8 локализован в коротком плече хромосомы 2D. Согласно данным кариотипиро-вания, хромосома 2D присутствует в геноме двух отобранных вторичных рекомбинантных линий - № 6 и № 12 (табл. 2). При использовании молекулярного маркера Xgwm261 к гену Rht8 амплифицируются фрагменты размером 165, 174, 180, 192, 200, 204 п.н., однако только фрагмент 192 п.н. специфичен для коммерческого аллеля данного гена Rht8с. В ходе фрагментного анализа полученных продуктов ПЦР было установлено, что у исследованных замещенных форм гексаплоидных тритикале присутствует аллель дикого типа Rht8а (165 п.н.).
Таблица 5
Аллельный состав гена короткостебельности Кк^Б1 у рекомбинантных форм гексаплоидных тритикале
Комбинация скрещивания, линия Аллели гена ЯЫ-Б1
Мешко х ПРАГЗ-3, линия № 3 Ш-Б1а
Лана х ПРАГЗ-3, линия № 4 Ш-Б1Ь
Лана х ПРАГЗ-2, линия № 6 т-Б1Ь
Мешко х ПРАГЗ-3, линия № 7 т-Б1Ь, Ш-Б1а
Лана х ПРАГЗ-3, линия № 11 т-Б1Ь
Лана х ПРАГЗ-2, линия № 12 т-Б1Ь
Карго х ПРАГЗ-3, линия № 14 т-Б1Ь
Карго х ПРАГЗ-3, линия № 22 т-Б1Ь
Рис. 4. Электрофореграмма детекции аллелей КЫ-Б1а (верхняя) и КЫ-Б1Ь (нижняя) у рекомбинантных линий
тритикале № 14, № 22 и № 3. М - маркер молекулярного веса Праймтех™, М100 Ьр, 284 - DEO6232/O1 (положительный контроль на КЫ-Б1Ь), 295 - ПРАГЗ-5 - положительный контроль на КЫ-Б1а, с 861 по 867 - образцы линии № 14; с 871 по 875 - образцы линии № 22; с 801 по 804 - образцы линии № 3
Заключение
Представленные выше результаты исследований свидетельствуют об эффективности применения хромосомно-инженерных технологий для расширения генетического разнообразия гексаплоидных тритикале. В ходе экспериментов показана высокая частота включения хромосом Б-генома в кариотип сортов тритикале и довольно быстрая стабилизация хромосомного состава гибридного материала. Выявлена зависимость результативности процесса интрогрессии хромосом
Б-генома пшеницы в кариотип гексаплоид-ных тритикале от генотипической среды создаваемой гибридной формы, из чего следует что, расширяя генетическое разнообразие включенных в гибридизацию сортов тритикале, можно существенно повысить частоту образования рекомбинантных А/В/БКЛ форм. По совокупности проведенного анализа выделены рекомбинантные линии гексаплоидных тритикале № 11 и № 12, которые могут быть рекомендованы для включения в селекцион-
ный процесс в качестве исходного материала при создании сортов тритикале, устойчивых к полеганию и предуборочному прорастанию.
Работа выполнена при поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований (договор № Б12-042).
Список использованной литературы
1. Lafferty, J. Substitution of chromosome 1D into hexaploid triticale to improve bread-making guality / J. Lafferty, T. Lelley // Current topics in plant cytogenetics related to plant improvement. -Wien: WUV-Univ.-Verl. - 1998. - P. 376-380.
2. Идентификация генов короткостебель-ности Rht2 и Rht8 у образцов гексаплоидного тритикалеспомощьюДНКмаркеров/К.У. Кур-киев [и др.] // Информационный вестник ВОГиС. - 2008. - Т. 12, №3. - С. 372-376.
3. Реконструкция кариотипа гексаплоидных тритикале путем межгеномных замещений хромосом / Н.И. Дубовец [и др.] // Генетика. -1995. - Т. 31, № 10. - С. 1394-1399.
4. Бадаева, Е.Д. Изменение хромосом ржи в кариотипе тритикале: дис. ... канд. биол. наук:
03.00.15 / Е.Д. Бадаева. - М., 1984. - 181 л.
5. "Chromosomal passport" of Triticum aes-tivum L. em Thell. cv. Chinese Spring and stan-dartization of chromosomal analysis of cereals / E.D. Badaeva [et al.] // Cereal Res. Commun. -1990. - Vol. 18, № 4. - P. 273-281.
6. Нгуен, Т. Т. Л. Разработка системы оценок устойчивости к прорастанию на корню озимой тритикале: автореферат дис. . канд. с-х наук: 06.01.05 / Т.Т.Л. Нгуен. - М., 2011. - 22 с.
7. Distribution of the Rht-B1b, Rht-D1 and Rht8 reduced height genes in autumn-sown Chinese wheats detected by molecular markers / X. Zhang [et al.] // Euphytica. - 2006. - Vol. 152, № 1. - P. 109-116.
Дата поступления статьи 29 августа 2013 г.
