CC BY
21
DOI: 10.23868/201811039
создание и анализ цитотоксической активности in vitro nk-клеточной линии человека с экспрессией psma-специфичного химерного антигенного рецептора и противоопухолевого агента лактаптина
Т.Н. Беловежец1, 2, Д.А. Матвиенко1, 2, О.Ю. Волкова1, О.А. Коваль2, 3, А.В. Ткаченко3, Е.В. Кулигина3, А.В. Таранин1, 2, В.А. Рихтер3
1 Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Новосибирск, Россия
2 Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия
3 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия
analysis of in vitro cytotoxicity of human nk cell line co-expressing a psma-specific car and an antitumor agent lactaptin
T.N. Belovezhets1, 2, D.A. Matvienko1, 2, O.Y. Volkova1, O.A. Koval22 3, A.V. Tkachenko3, E.V. Kuligina3, A.V. Taranin1, 2, V.A. Richter3
11nstitute of Molecular and Cellular Biology, SB of the RAS, Novosibirsk, Russia
2 Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
3 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB of the RAS, Novosibirsk, Russia
e-mail: [email protected]
Создание эффективных противоопухолевых агентов является одной из наиболее приоритетных задач трансляционной медицины. Адоптивный перенос Т-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (CAR), направленные против опухоль-ассоциированных мишеней, уже показал свою эффективность при лечении гематоонкологических заболеваний. В связи с этим, разработка подходов, обеспечивающих эффективность данной технологии применительно к солидным видам рака и переход к универсальному алло-генному формату имеет высокую практическую значимость. Использование для этой цели NK-клеточных линий человека является крайне перспективным.
Методом лентивирусной доставки генетических кассет нами была модифицирована человеческая NK-клеточная линия YT таким образом, чтобы обеспечить экспрессию функционального CAR против маркера клеток рака простаты, белка PSMA, и продукцию противоопухолевого пептида лактаптина. Целью данной работы было выяснить, будет ли такая линия, CAR-YT-Lact, жизнеспособна, и если да, то будет ли она производить лактаптин и оказывать цитотоксическое воздействие на опухолевые клетки. Было показано, что клеточная линия CAR-YT-Lact обладает цитотоксической активностью в отношении PSMA-позитивных клеток аденокарциномы простаты. Клетки YT-Lact, в свою очередь, были умеренно активны и в отношении PSMA-негативных клеток-мишеней, что представляется важным преимуществом, поскольку может обеспечить более полный контроль над опухолевыми клетками, которые не воспринимаются иммунной системой как чужеродные.
ключевые слова: лактаптин, NK-клеточные линии, YT, химерный антигенный рецептор.
Development of efficient antitumor modalities remains a priority of modern translation medicine. Adoptive transfer of autologous T cells expressing chimeric antigen receptors (CARs) specific for tumor-associated surface targets of B cells has demonstrated encouraging results in recent clinical trials. It is tempting therefore to adapt this approach to solid cancers and move it to universal/al-logeneic formats. For this reason, it appears very attractive to use human NK cell lines as CAR carriers. Using lentiviral delivery, human NK cell line YT was modified to express a PSMA-specific CAR and to produce an anticancer peptide lactaptin. "Armored" CAR-YT-Lact cell line obtained shows cytotoxicity against PSMA-positive prostate adenocarcinoma cells. Accordingly, YT-Lact cells display a moderate and non-specific activity against PSMA-negative target cells, which may translate into a tighter control of tumor cell escape via antigen loss.
Keywords: lactaptin, NK cell lines, YT, CAR
Введение
Терапия злокачественных заболеваний, в особенности В-клеточной природы, при помощи Т- и NK-лимфоцитов с химерными антигенными рецепторами (CAR) с каждым годом становится все более эффективной и применяется все шире [1, 2]. Вместе с тем, результаты, полученные для солидных опухолей, пока значительно скромнее [3]. Основными факторами, ограничивающими эффективность CAR T-терапии для солидных опухолей являются, во-первых, иммуносупрессивное окружение опухоли, угнетающее активность эффектор-ных клеток, во-вторых, гипоксия, которая характерна для подлежащих слоев опухоли, и, наконец, высокая гетерогенность солидных опухолей [4-6]. Последняя особенность приводит к тому, что использование CAR к одному антигену быстро вызывает появление популяции клеток,
не несущих целевого антигена на своей поверхности [7]. Эти клетки становятся неуязвимыми для CAR Т-терапии, приводя к быстрому рецидиву и дальнейшему росту опухоли. Возможным подходом для решения описанной проблемы может быть использование комбинированной иммунотерапии при помощи CAR-лимфоцитов и других противоопухолевых агентов [8, 9].
Известно множество противоопухолевых агентов, обладающих широкой противоопухолевой активностью [10-13]. Однако большинство из них плохо проникают внутрь солидных опухолей и обладают системной токсичностью. Одним из возможных подходов к решению этой проблемы является использование эффекторных клеток для доставки противоопухолевых белков. В качестве одного из таких агентов в нашем исследовании был выбран лактаптин — небольшой белок, обладающий
противоопухолевой (усиливающей апоптоз и аутофагию) активностью в отношении широкого спектра раковых клеток [14, 15]. Мы провели генетическую модификацию человеческой NK-клеточной линии YT [16], чтобы в ней происходила экспрессия PSMA-специфического CAR и лактаптина. Целью данной работы было выяснить, будет ли такая линия, CAR-YT-Lact, жизнеспособна, и если да, то будет ли она производить лактаптин и оказывать цитотоксическое воздействие на опухолевые клетки.
Материал и методы
Дизайн исследования
Работа по созданию NK-клеточной линии человека с экспрессией PSMA-специфичного химерного антигенного рецептора и противоопухолевого агента лактаптина проводилась в несколько этапов.
На первом этапе была проведена проверка чувствительности NK-клеточной линии человека YT к противоопухолевому агенту — лактаптину, чтобы определить, можно ли получить жизнеспособные клеточные линии, экспрессирующие лактаптин.
На втором этапе NK-клеточную линию YT трансду-цировали рекомбинантными лентивирусными частицами K1, кодирующими секретируемую форму лактап-тина, и выделили клон (YT-Lact), вызывающий гибель клеток-мишеней.
На третьем этапе YT-Lact клетки трансдуцировали рекомбинантными лентивирусными частицами, кодирующими PSMA-специфичный CAR и ген устойчивости к антибиотику зеоцину для получения CAR-YT-Lact клеток, экспрессирующих одновременно CAR и лактаптин.
После получения клеточных линий CAR-YT-Lact и YT-Lact их тестировали на цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам аденокарциномы простаты PC3-PSMA+.
Клеточные линии
Клеточные линии HEK293T (эмбриональные эпителиальные клетки почки человека), PC3 (аденокарцино-ма простаты человека) и MDA-MB-231 (аденокарцино-ма молочной железы) были получены из Американской коллекции клеточных культур (ATCC). Клеточная линия YT (NK-клеточная лимфобластная лейкемия) была любезно предоставлена проф. А.В. Филатовым. Клетки культивировали в ростовой среде IMDM (Thermo Fisher Scientific, США) с добавлением 10 % фетальной телячьей сыворотки (HyClone, GE Healthcare, США), 100 ЕД/ мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific, США) в ^-инкубаторе (37°С, 5 % CO2).
Анализ цитотоксического воздействия
лактаптина на клетки YT
Клетки YT 7 пассажа инкубировали 18 ч. в ростовой среде с 0,2 мг/мл рекомбинантного лактаптина RL2, выделенного из E. coli, как описано ранее [14]. RL2 представляет собой фрагмент капа-казеина человека и обладает выраженным противоопухолевым действием [14, 15]. Процент мертвых клеток определяли при помощи набора Bd Annexin V/PI (BD Biosciences, США) по инструкции фирмы-изготовителя. В качестве положительного контроля использовали чувствительные к лактаптину клетки линии MDA-MB-231.
Генетические конструкции
Лентивирусная плазмида К1 была сконструирована нами ранее на основе лентивирусного вектора pCDH (CD530, SystemBio, США) [17]. Плазмида К1 кодирует рекомбинантный лактаптин RL2, слитый с лидерным
пептидом люциферазы Gaussia с N-конца и гексагисти-диновым трактом с C-конца белка (EL1), а также содержит репортерный ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок копеподы Pontellina plumata (рис. 1). Конструкция, кодирующая CAR со специфичностью к PSMA, была нами получена в предыдущей работе [18].
Рис. 1. Схема полученной конструкции. EF1s — конститутивный гибридный промотор гена hEFIa и Т-лимфотропного вируса человека, IgkSP — лидерный пептид люциферазы Gaussia princeps, Lactaptin — ген, кодирующий рекомбинантный лактаптин RL2, 6xHis — гексагистидиновый эпитоп, IRES — внутренний сайт посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита, copGFP — репортерный ген (зеленый флуоресцентный белок копеподы Pontellina plumata)
Трансдукция клеточной линии YT и клонирование
Сборку вирусных частиц, псевдотипированных поверхностным белком G вируса везикулярного стоматита (VSV), проводили в клетках линии HEK293T по стандартному протоколу кальций-фосфатной трансфекции [19] с использованием вспомогательных плазмид pMD.2G и psPAX2 (Addgene, США). Трансдукцию клеток линии YT лентивирусными частицами, кодирующими лактаптин, а также клеток линии YT и YT-Lact частицами, кодирующими CAR со специфичностью к PSMA, осуществляли методом спи-нокуляции [а0] с различными MOI в присутствии B мкг/ мл полибрена (Sigma, США). Трансдуцированные клетки YT клонировали на сортере Sony SHBOo (Sony, Япония) для получения клонов, стабильно экспрессирующих лактаптин.
Цитометрический анализ
Уровень экспрессии copGFP — маркера, сцепленного с CAR, оценивали на проточном цитофлуориметре (Canto II, BD Biosciences, США) в канале FItC; контролем выступали немодифицированные клетки линии YT. Для верификации экспрессии CAR использовали биотинили-рованный белок-L (GenScript, США), который затем визуализировали инкубацией с конъюгатом стрептавидин-PE (Thermo Fisher Scientific, США) [21].
Анализ пролиферации и RTCA (Real-Time Cell Analysis)
Уровень пролиферации клонов YT-Lact и CAR-YT-Lact оценивали по концентрации живых клеток на автоматизированном счетчике клеток (Luna II, Logos Biosystems, Корея). Измерения проводили три раза в двух повторах с интервалом 24 ч.
Цитотоксическую активность определяли методом RTCA [22] на приборе iCELLigence (ACEA, США). Клетки-мишени PC3-PSMA+ или PC3 высаживали в лунки 16-лу-ночных планшетов iCELLigence в количестве 50х 103 клеток на лунку и культивировали в течение 22-24 ч. (время удвоения), затем добавляли 100х103 клеток-эффекторов (YT, CAR-YT, YT-Lact или CAR-YT-Lact) и инкубировали 12 ч., считывая показания импеданса 1 раз в 15 мин.
Статистический анализ
Все эксперименты по RTCA-анализу цитотоксической активности проводили в двух независимых повторениях, на графиках приведено среднее значение и стандартное отклонение. Достоверность отличий средних значений оценивали t-критерием Стьюдента, за достоверные принимали отличия при p<0,05.
Рис. 2. Анализ цитотоксичности и времени удвоения различных клонов клеток УТ-_ай при их совместной инкубации с клетками аденокарциномы простаты РС3-РБМД+ (клетки-мишени) в соотношении 1:1 в течение 12 ч. методом ЯТСД. Контроль — клетки РС3-РБМД+, инкубированные без добавления эффекторов; доля погибших клеток принята за нулевой уровень цитотоксичности
Рис. 3. Уровень поверхностной экспрессии CAR клетками линии CAR-YT-Lact. Негативный контроль — клетки YT-Lact без экспрессии CAR
Результаты
Определение влияния рекомбинантного
лактаптина на жизнеспособность клеток линии YT
Опубликованные ранее данные показали, что ре-комбинантный лактаптин, RL2, выделенный из суперпродуцента E. coli, обладает умеренной цитотоксично-стью по отношению к опухолевым клеткам, в том числе к клеткам аденокарциномы молочной железы (MCF-7, MDA-MB-231) и первичного эндометриального рака [14, 15, 23]. Уровень полумаксимального инги-бирования IC50 для лактаптина в отношении нормальных клеток превосходил таковой для опухолевых клеток примерно в 2 раза. Очевидно, что при таком уровне селективности RL2 среди опухолевых линий должны быть линии, в значительной степени резистентные к его эффектам. Вместе с тем, ранее также было обнаружено, что использование клеток HEK293T в качестве линии-продуцента обеспечивает образование высокоактивной формы лактаптина, EL1, IC50 которой по отношению к клеткам линии MDA-MB-231 в несколько тысяч раз ниже [17]. Таким образом, прежде чем приступать к созданию NK-клеточной линии-продуцента лактаптина, необходимо было проверить, насколько такая линия чувствительна к лактаптину. При инкубации клеток линии YT с лактаптином RL2 было выявлено, что уровень клеточной гибели сопоставим с фоновым значением (11 % мертвых клеток в отсутствие и 16 % в присутствии агента), в то время как для контрольных клеток аденокарциномы молочной железы MDA-MB-231 процент мертвых клеток возрастал более чем на 30 % (6 % мертвых клеток в отсутствие и 38 % в присутствии агента).
Таким образом, полученные данные позволяли рассчитывать, что при эндогенной экспрессии лактаптина в клетках линии YT могут быть получены жизнеспособные линии, нечувствительные к секретируемым уровням лактаптина в результате естественной элиминации из культуры чувствительных к лактаптину клеток.
Создание клеточной линии YT-Lact,
продуцирующей лактаптин
С использованием плазмиды К1 были получены лентивирусные частицы и проведена трансдукция
NK-клеточной линии YT. При помощи индексной сортировки трансдуцированные клетки с максимальной экспрессией флуоресцентного репортера клонировали, и была выделена панель из 4 клонов (рис. 2), стабильно экспрессирующих лактаптин (далее эти клетки будут обозначаться как YT-Lact).
Анализ цитотоксичности клеток линий
CAR-YT-Lact и YT-Lact по отношению
к опухолевых клеткам
Полученные клоны YT-Lact были охарактеризованы по уровню цитотоксичности в отношении клеток аденокарциномы простаты PC3-PSMA+ (клетки-мишени) и пролиферативной активности (рис. 2). Оценка пролиферации была необходима в связи с тем, что при множественных инсерциях целевого гена в модифицируемую линию возможна гиперэкспрессия целевого белка, сопровождаемая токсичностью и снижением скорости деления. Было обнаружено, что из полученных клонов только один, клон 2, вызывает достоверную гибель клеток-мишеней при совместной инкубации в соотношении 1:1 в течение 12 ч. (уровень гибели клеток-мишеней на 10 % выше фона). При этом зависимости между скоростью деления клеток и уровнем цитотоксичности обнаружено не было. Далее все работы проводили с YT-Lact клоном 2.
YT-Lact клетки (клон 2) были трансдуцированы лентивирусными частицами, кодирующими PSMA-специфичный CAR и ген устойчивости к антибиотику зеоцину. После селекции на антибиотике были получены CAR-YT-Lact клетки, экспрессирующие одновременно CAR и лактаптин (рис. 3). Аналогичным образом были получены контрольные клетки CAR-YT.
Чтобы оценить возможный вклад экспрессии лак-таптина в изменение цитотоксической активности клеток-эффекторов, было проведено сравнение клеток линий CAR-YT-Lact, CAR-YT, YT-Lact и клеток YT (контроль) по этому показателю. В качестве мишени были использованы клетки аденокарциномы простаты PC3-PSMA+, чувствительные как к RL2, так и EL1 формам лактаптина [17]. Было обнаружено, что максимальную цитотоксичность проявляют клетки CAR-YT-Lact и CAR-YT, однако клетки YT-Lact также обладали
повышенной цитотоксичностью по сравнению с клетками исходной линии (рис. 4А).
Одним из наиболее важных требований к терапевтическим клеточным продуктам нового поколения является способность контролировать рост клеток, потерявших эпитоп, распознаваемый CAR. Таким образом, ценным свойством YT-Lact клеток может быть их способность уничтожать клетки-мишени, не экспрессиру-ющие онко-ассоциированные маркеры. Чтобы оценить уровень лактаптин-опосредованной цитотоксичности, мы провели RTCA-анализ активности YT-Lact клеток в отношении клеток линии PC3, негативных по экспрессии PSMA. Было обнаружено, что цитотоксичность YT-Lact клеток достоверно, хотя и незначительно выше цитотоксичности клеток YT (рис. 4Б). Полученные результаты могут указывать на возможность использования YT-Lact клеток в качестве неспецифического противоопухолевого агента.
Обсуждение
Данные, полученные в ходе доклинических и клинических исследований CAR T-клеток, свидетельствуют о невероятной пластичности солидных опухолей. Так, например, после курса терапии EGFRvIII-специфичными CAR T-лимфоцитами EGFRvIII-позитивной глиобла-стомы, дальнейший рост опухоли обеспечивали EGFRvIII-негативные клетки. CAR T-клетки при этом продолжали обнаруживаться в зоне опухоли, однако специфически лизировать клетки-мишени они уже не могли [7]. Наиболее очевидным путем решения этой проблемы является использование би- и полиспецифичных CAR. Однако, это не всегда возможно ввиду ограниченного репертуара поверхностных маркеров, присутствующих на опухолевых клетках, но отсутствующих на клетках здоровых тканей. В связи с этим, рассматривается вариант экспрессии CAR T-клетками противоопухолевых агентов широкого спектра действия. Известно немало токсичных для раковых клеток белковых агентов, например, рибосома-инактиви-рующие белки [10], параспорины [11], аргининовые деиминазы [12], L-аспарагиназы [13] и др. Тем не менее, указанные агенты будут токсичны не только для раковых клеток, но и для CAR T/NK-лимфоцитов, что исключает их одновременную экспрессию вместе с CAR. Нами было обнаружено, что лактаптин не токсичен для NK-клеток линии YT при тех концентрациях, когда он вызывает гибель клеток аденокарциномы молочной железы и простаты. Благодаря этому возможна его экспрессия в клетках YT. Несмотря на то,
Рис. 4. Цитотоксическая активность: А — клеток CAR-YT, CAR-YT-Lact, YT-Lact и YT при их совместном инкубировании с клетками PC3-PSMA+ в течение 12 ч. методом RTCA; Б — клеток YT-Lact и YT при их совместном инкубировании с клетками PC3 в течение 12 ч. методом RTCA. Контроль — клетки-мишени PC3-PSMA+ (А) и PC3 (Б), инкубированные без добавления эффекторов, доля погибших клеток принята за нулевой уровень цитотоксичности
что продукция лактаптина не усилила цитотоксический потенциал PSMA-специфичных CAR-YT клеток в отношении PSMA-позитивных мишеней (рис. 4А), уничтожение YT-Lact клетками PSMA-негативных клеток (что соответствует ситуации потери иммунного контроля) происходило эффективнее, чем клетками исходной линии YT (рис. 4Б). Таким образом, введение в геном YT клеток гена, кодирующего секретируемый противоопухолевый белок (RL2), расширяет потенциал клеточной терапии и позволяет рассчитывать на возможность контроля роста как PSMA-позитивных, так и PSMA-негативных опухолевых клеток. В перспективе важно проверить результаты, полученные на этой модели, для других линий опухолевых клеток и образцов первичных опухолей от пациентов, а также изучить синергический эффект от комбинирования лактапти-на с CAR T/NK-клетками, обладающими различной специфичностью.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ, соглашение № 14.604.21.0169 (уникальный идентификатор проекта RFMEFI60417X0169).
ЛИТЕРАТУРА:
1. June C.H., Sadelain M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. N. Engl. J. Med. 2018; 379(1): 64-73.
2. Кулемзин С.В., Кузнецова В.В., Мамонкин М. и др. CAR T-клеточная терапия: баланс эффективности и безопасности. Молекулярная биология 2017; 51(2): 274-87.
3. D'Aloia M.M., Zizzari I.G., Sacchetti B. et al. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death Dis. 2018; 9(3): 282.
4. Al-Zoughbi W., Huang J., Paramasivan G.S. et al. Tumor macroenvironment and metabolism. Semin. Oncol. 2014; 41(2): 281-95.
5. Denko N.C. Hypoxia, HIF1 and glucose metabolism in the solid tumour. Nat. Rev. Cancer 2008; 8(9): 705-13.
6. Brown J.M., Giaccia A.J. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer Res. 1998; 58(7): 1408-16.
7. O'Rourke D.M., Nasrallah M.P., Desai A. et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Sci. Transl. Med. 2017; 9(399): pii: eaaa0984.
8. Yeku O.O., Purdon T.J., Koneru M. et al. Armored CAR T cells enhance antitumor efficacy and overcome the tumor microenvironment. Sci. Rep. 2017; 7(1): 10541.
9. Li S., Siriwon N., Zhang X. et al. Enhanced Cancer Immunotherapy by Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells Engineered to Secrete Checkpoint Inhibitors. Clin. Cancer Res. 2017; 23(22): 6982-92.
10. Pizzo E., Di Maro A. A new age for biomedical applications of Ribo-some Inactivating Proteins (RIPs): from bioconjugate to nanoconstructs. J. Biomed. Sci. 2016; 23(1): 54.
11. Ohba M., Mizuki E., Uemori A. Parasporin, a new anticancer protein group from Bacillus thuringiensis. Anticancer Res. 2009; 29(1): 427-33.
12. Ni Y., Schwaneberg U., Sun Z.H. Arginine deiminase, a potential antitumor drug. Cancer Lett. 2008; 261(1): 1-11.
13. Pritsa A.A., Papazisis K.T., Kortsaris A.H. et al. Antitumor activity of L-asparaginase from Thermus thermophilus. Anticancer Drugs 2001; 12(2): 137-42.
14. Koval O.A., Fomin A.S., Kaledin V.I. et al. A novel pro-apoptotic effector lactaptin inhibits tumor growth in mice models. Biochimie 2012, 94(12): 2467-74.
15. Koval O.A., Tkachenko A.V., Fomin A.S. et al. Lactaptin induces p53-independent cell death associated with features of apoptosis and autophagy and delays growth of breast cancer cells in mouse xenografts. PLoS One 2014; 9(4): e93921.
16. Yodoi J., Teshigawara K., Nikaido T. et al. TCGF (IL 2)-receptor Inducing factor(s). I. Regulation of IL 2 receptor on a natural killer-like cell line (YT cells). J. Immunol. 1985; 134(3): 1623-30.
17. Коваль О.А., Волкова О.Ю., Горчаков А.А. и др. Сравнительный анализ активности лактаптина, полученного в про- и эукариотических системах экспрессии. Вавиловский журнал генетики и селекции 2017; 21(7): 764-9.
18. Кулемзин С.В., Чикаев Н.А., Волкова О.Ю. и др. Модульная система лентивирусных векторов для работы с химерными антигенными рецепторами. Биоорганическая химия 2017; 43(2): 124-32.
19. Kingston R.E., Chen C.A., Rose J.K. Calcium phosphate transfection. Curr. Protoc. Mol. Biol. 2003; 9: 9.1.
20. O'Doherty U., Swiggard W.J., Malim M.H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J. Virol. 2000; 74(21): 10074-80.
21. Zheng Z., Chinnasamy N., Morgan R.A. Protein L: a novel reagent for the detection of chimeric antigen receptor (CAR) expression by flow cytometry. J. Transl. Med. 2012; 10: 29.
22. Golubovskaya V., Berahovich R., Zhou H. et al. CD47-CAR-T Cells Effectively Kill Target Cancer Cells and Block Pancreatic Tumor Growth. Cancers 2017; 9(10): pii: E139.
23. Koval O.A., Sakaeva G.R., Fomin A.S. et al. Sensitivity of endometrial cancer cells from primary human tumor samples to new potential anticancer peptide lactaptin. J. Cancer Res. Ther. 2015; 11(2): 345-51.
Поступила: 22.10.2018
