СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОЛЛЕКЦИИ ТЕТРАПЛОИДНЫХ ПШЕНИЧНО-РЖАНЫХ АМФИДИПЛОИДОВ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Текст научной статьи по специальности «Сельское хозяйство, лесное хозяйство, рыбное хозяйство»

УДК 575.222.73:576.354.4

Н.И. Дубовец1, Е.А. Сычева1, Л.А. Соловей1, Т.И. Штык1, Е.Б. Бондаревич1, Л.Ф. Кабашникова2, Г.Е. Савченко2

СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОЛЛЕКЦИИ ТЕТРАПЛОИДНЫХ ПШЕНИЧНО-РЖАНЫХ АМФИДИПЛОИДОВ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

1ГНУ «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27

2ГНУ «Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27

Введение

В последнее десятилетие в связи с интенсивным развитием биологических технологий наблюдается существенное расширение круга объектов, включаемых в понятие генетических ресурсов растений. Использование методов отдаленной гибридизации, генной и хромосомной инженерии для целенаправленного преобразования геномов вывело работу с генетическими коллекциями за рамки познания генетического разнообразия культурных растений и их дикорастущих сородичей. Особое место в системе генресурсов растений заняли коллекции специального генетического материала - серии изогенных, анеуплоид-ных, аллоплазматических, изоплазматических, хромосомно-замещенных, хромосомно-дополненных, транслоцированных линий, а также различные амфиплоидные геномные

комбинации [1]. Такого плана материал в большинстве случаев не может быть непосредственно включен в селекционный процесс, однако представляет значительный интерес в качестве экспериментальных модельных систем для генетических исследований.

В ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» в результате многолетних исследований по отдаленной гибридизации и хромосомной инженерии создана оригинальная генетическая коллекция линий тетрапло-идных пшенично-ржаных амфидиплоидов с различными вариантами рекомбинантного генома. В данном сообщении приводятся результаты работ по формированию генетической коллекции тетраформ и ее использованию в работах по изучению особенностей генного взаимодействия в гибридном геноме.

Материалы и методы

Исходным материалом для создания коллекции послужили гибридные популяции яровых тетраплоидных пшенично-ржаных амфиди-плоидов ПРАТ12, ПРАТ16, ПРАТ69 и ПРАТ72, полученные в результате скрещивания гекса-плоидных тритикале (ААБВЯК 2п=6х=42) с диплоидной аллоплазматической рожью

сегеа1е Ь. (2п=2х=14) [2]. Каждая из четырех популяций представляет собой потомство гибрида Б репродуцируемое в условиях свободного опыления.

Гибридный материал был маркирован с использованием молекулярно-цитогенетических маркеров (С-бэндов) [3].

Результаты и обсуждение

Несмотря на то, что каждая из созданных ставляет собой потомство одного гибридного нами тетраплоидных форм тритикале пред- растения, все они характеризуются неодно-

родным хромосомным составом. Это связано с особенностями геномной структуры гибридов Б которые наряду с диплоидным геномом ржи содержат гаплоидные наборы хромосом А- и В-геномов пшеницы. Взаимозамещения хромосом этих наборов в ходе стабилизации рекомбинантного генома при условии, что он будет сформирован исключительно парами гомологов, теоретически могут привести к возникновению в потомстве каждого гибрида 128 (27) вариантов кариотипа. Если же в отдельных гомеологичных группах пшеничного компонента кариотипа сохраняются гетерологичные пары хромосом, то количество вариантов кариотипа многократно возрастает. Между тем присутствие в пределах формы даже двух вариантов кариотипа делает ее непригодной для практического применения. Так, наличие линейного материала тетраплоидных пшенично-ржаных амфиди-плоидов является обязательным условием для проведения работ по направленному синтезу замещенных форм гексаплоидных тритикале. Кроме того многовариантность кариотипа тетраформ позволяет использовать их в исследованиях, направленных на изучение вклада индивидуальных хромосом пшеницы в регуляцию различных генетических процессов, что также предполагает наличие линейного материала. В связи с этим нами была проведена работа по созданию коллекции идентифицированных линий те-траплоидных тритикале, однородных по хромосомному составу в пределах линии и различающихся между собой по наборам хромосом субгеномов пшеницы.

С этой целью первоначально в Б8 каждой из 4-х популяций яровых тетраплоидных тритикале была проведена изоляция 50 произвольно взятых колосьев. Завязавшиеся в колосе зерновки выращивались под индивидуальным номером в условиях принудительного самоопыления. Предполагалось, что частично автофертильные растения при отсутствии перекрестного опыления дадут

потомство с однородным хромосомным составом. Определенные надежды при этом возлагались на то, что растения с гетероге-номным составом гомеологичных групп, как менее жизнеспособные, будут подвержены элиминации в ходе смены поколений. Однако эти надежды не оправдались. Впоследствии оказалось, что растения с гетероло-гичными парами хромосом по фертильности колоса часто превосходят таковые с парами гомологов [4]. Вследствие этого в ходе ка-риотипирования растений после шести ин-цухтов удалось выделить лишь одну линию (16(10)) с однородным составом пшеничного компонента кариотипа: 1А2В3А4А5А6А7В. Скорее всего, исходное растение Б8, давшее начало этой линии, имело стабильный ка-риотип. У остальных инбредных форм было выявлено от двух до восьми вариантов сочетаний хромосом А- и В- геномов пшеницы.

В связи с этим мы вынуждены были воспользоваться иным более трудоемким методическим приемом, который заключался в следующем. Из популяций тетраформ были произвольно взяты 200 зерновок, которые перед высадкой в поле подвергались проращиванию. Один корешок проростка использовался для изготовления цитологического препарата, предназначенного для идентификации хромосомного состава растения, а сам проросток высаживался под индивидуальным номером. По данным хромосомного анализа отбирались линии со стабильным кариоти-пом, а у растений с гетерологичными парами хромосом пшеницы в следующем поколении анализировалось расщепляющееся потомство, и опять проводились отборы интересующего нас линейного материала.

В итоге была сформирована коллекция из 25 линий тетраплоидных тритикале, хромосомный состав которых представлен в таблице 1. Поскольку все линии имеют полный набор хромосом ржи, таблица содержит описание только пшеничного компонента кариотипа.

Таблица 1

Хромосомный состав пшеничного компонента кариотипов линий тетраплоидных тритикале

Линия Г о м е о л о г и ч н ы е г р у п п ы

1 2 3 4 5 6 7

ПРАТ 12(21) ВВ АТАТ ВВ АА АА АА ВВ

ПРАТ 16(10) АА ВВ АА АА АА АА ВВ

ПРАТ 69(2) ВТВТ АТАТ АТАТ АА АА АА АА

ПРАТ 72(2) 1 к. АТАТ АТАТ АА АА АА АА ВВ

ПРАТ 72(7) ВТВТ ВВ ВВ АА АА АА ВВ

ПРАТ 72(7/1) АА ВВ АА АА АА АА ВВ

ПРАТ 72(7/3) АА ВВ ВВ АА АА АА ВВ

ПРАТ 72(31) ВТВТ АТАТ ВВ АА АА АА ВВ

ПРАТ 72(40) ВТВТ АТАТ ВВ АА ВВ АА ВВ

ПРАТ 196(3) ВТВТ АА АА АА АА АА ВВ

ПРАТ 236(1) ВТВТ АТАТ ВВ АА АА АА АА

ПРАТ 236(2) ВТВТ АТАТ АТАТ АА АА АА АА

ПРАТ 237(2) АА АА ВВ АА АА АА ВВ

ПРАТ 245(1) АА АА АТАТ АА АА АА ВВ

ПРАТ 289 ВТВТ АТАТ АА АА АА АА ВВ

ПРАТ 381 АТАТ ВВ ВВ АА АА АА ВВ

ПРАТ 72(6/1) АТВ АА ВВ АА АА АА АВ

ПРАТ 72(6/2) АТВ АТАТ ВВ АА АА АА ВВ

ПРАТ 72(7/4) АА ВВ АВ АА АА АА ВВ

ПРАТ 72(7/5) ВТВТ ВВ АВ АА АА АА ВВ

ПРАТ 196(1) АА АВ АА АА АА АА ВВ

ПРАТ 196(2) АВТ АА АА АА АА АА ВВ

ПРАТ 237(1) АВТ АА ВВ АА АА АА ВВ

ПРАТ 242(1) ВТВТ АВ АВ АА АА АА ВВ

ПРАТ 242(2) ВТВТ АВ АА АА АА АА ВВ

Примечание: надстрочный знак Т обозначает транслоцированную хромосому.

Из 25 коллекционных линий тетраплоидных тритикале 16 характеризуются стабильным кариотипом, когда все гомеологичные группы пшеничного компонента представлены парами гомологов А- и В-геномов. В кариотипах остальных 9 линий (названных так условно, поскольку данные формы расщепляются и требуют постоянного хромосомного анализа с целью отбора растений с нужным вариантом кариотипа) одна или две гомеологичные группы пшеничного компонента содержат ге-терологичные пары хромосом. При этом наиболее несбалансированными по составу ре-комбинантного генома являются линия ПРАТ

72(6/1), содержащая пары гомеологов в 1-ой и 7-ой группах, и линия ПРАТ 242(1) с парами гомеологов во 2-ой и 3-ей группах. Данные линии включены в коллекцию для исследования дозовых эффектов хромосом.

Как видно из данных таблицы различия в хромосомном составе между отобранными линиями обусловлены разными сочетаниями хромосом в 1, 2, 3, и 7-ой гомеологичных группах пшеничного компонента, в то время как 4-ая и 6-ая группы содержат хромосомы только А-генома пшеницы. В 5-ой гомеоло-гичной группе хромосомы В-генома пшеницы обнаружены лишь у линии ПРАТ 72(40).

19 линий 4х-тритикале содержат рекомби-нантные хромосомы, образовавшиеся в результате кроссоверных обменов между гоме-

ологами А- и В-геномов пшеницы. Наличие транслоцированных хромосом отмечено в 1, 2 и 3-ей гомеологичных группах (рисунки 1, 2).

Рис. 1. Кариотип линии тетраплоидных тритикале ПРАТ 381 с парой транслоцированных

хромосом 1А8.1ЛЬ-1БЬ

(стрелками обозначены места локализации транслоцированных сегментов хромосом)

В первом случае перестройке подверглись дистальные участки длинных плеч хромосом 1А и 1В, в результате чего образовалась хромосома 1А с присутствием в длинном плече нетипичного для нее теломерного блока гете-рохроматина и хромосома 1В без характерного для нее теломерного блока (рисунки 1, 2).

Во втором случае произошла транслокация фрагмента короткого плеча хромосомы 2В на дистальную часть короткого плеча хромосомы 2А (рисунок 2г) и наоборот.

И, наконец, в 3-ей гомеологичной группе перестройка произошла между длинными плечами хромосом, в результате чего крупный фрагмент плеча хромосомы 3 В оказался транс-лоцированным на проксимальную часть плеча хромосомы 3 А (рисунок 2г).

Как видно из данных таблицы 1, максимальное количество транслоцированных хромосом характерно для линий ПРАТ 69(2) и ПРАТ 236(2).

Созданный линейный материал был использован нами в серии генетических экспериментов. При этом из основной коллекции тетраплоидных тритикале по принципу подбора пар линий, различающихся между собой по составу лишь одной из семи гомеологичных групп пшеничного компонента кариотипа, была сформирована рабочая коллекция, включающая 12 линий. Например, линии ПРАТ 196(3) и ПРАТ 69(2) различаются по составу 7-й гомеологичной группы - у первой линии эта группа содержит пару хромосом В- генома, у второй - пару хромосом А-генома, в то время как остальные шесть гомеологичных групп имеют идентичный хромосомный состав (рисунок 2). Всего в отобранном материале имеется 16 пар сравнения: по четыре пары по 1 и 2-й го-меологичным группам, пять пар по 3-й группе, две пары по 7-й и одна пара по 5-й группе. Попарное сравнение включенных в рабочую

1

О

(Л

V

X

V ^ г 3

Г'Л

\

. I

ь1 V.

I

I I

* ч

ас

^ И

а ' ,1

. V V.

/ *

/к -

к

1*'

л

а

№

л

я

К

иа

^ I

Ё

л

Й § йе

§ 3

е п

п гр

й о н

г о л о е

й

о п

н е н

р

с

а ара

п

сч сл ЧС

I

ЧС

I

й и н и

л

ы п и т о

и ар

£

гч о

коллекцию линий по степени проявления исследуемых параметров позволило оценить влияние индивидуальных хромосом А - и В-геномов пшеницы на экспрессию признаков продуктивности растения и их вклад в регуляцию мейотического спаривания [4, 5].

В дальнейшем было проведено изучение эффектов взаимозамещения хромосом А- и В-геномов на функционирование фотосинтетического аппарата тетраплоидных тритикале, в частности на биосинтез фотосинтетических пигментов и антоцианов.

Результаты измерения содержания фотосинтетических пигментов (хлорофиллов и каротинои-дов), а также антоцианов в подфлаговом листе

выращенных в полевых условиях линий тетра-плоидных тритикале представлены в таблице 2. Полученные данные свидетельствуют о высоком уровне изменчивости исследованных показателей в зависимости от хромосомного состава включенных в эксперимент линий. По содержанию хлорофиллов в расчете на единицу сухой биомассы листа выделялись линии ПРАТ 289, ПРАТ 72(40), ПРАТ 69(2) и ПРАТ 236(1), у которых значение показателя превысило 7 мг. У остальных линий содержание Хл (а+Ь) варьировало от 5,31 до 6,99 мг. Минимальное значение показателя отмечено для линии ПРАТ72 (31). Эта же линия характеризовалась самым низким содержанием каротиноидов.

Таблица 2

Содержание пигментов в подфлаговом листе тетраплоидных тритикале с различными

вариантами кариотипа

Линия Хромосомный состав пшеничного компонента кариотипа Пигменты, мг/г сухой массы

Хл. (а+Ь) Каротиноиды Антоцианы

ПРАТ 72(2) ПРАТ 289 ПРАТ 245(1) ПРАТ 289 АА АА АА АА АА АА ВВ ВВ АА АА АА АА АА ВВ АА АА АА АА АА АА ВВ ВВ АА АА АА АА АА ВВ 6,24±0,38 8,53±0,85 6,55±0,23 8,53±0,85 1,48±0,09 1,95±0,22 1,54±0,06 1,95±0,22 0,0790±0,0054 0,0473±0,0050 0,0773±0,0065 0,0473±0,0050

ПРАТ 245(1) ПРАТ 16(10) ПРАТ 245(1) ПРАТ 72(7/1) ПРАТ 237(2) ПРАТ 381 АА АА АА АА АА АА ВВ АА ВВ АА АА АА АА ВВ АА АА АА АА АА АА ВВ АА ВВ АА АА АА АА ВВ АА АА ВВ АА АА АА ВВ АА ВВ ВВ АА АА АА ВВ 6,55±0,23 6,41±1,46 6,55±0,23 5,68±0,44 5,81±0,95 6,30±1,09 1,54±0,06 1,58±0,37 1,54±0,06 1,35±0,09 1,35±0,22 1,48±0,27 0,0773±0,0065 0,1152±0,0062 0,0773±0,0065 0,1094±0,0030 0,0945±0,0038 0,1000±0,0079

ПРАТ 196(3) ПРАТ 72(31) ПРАТ 245(1) ПРАТ 237(2) ВВ АА АА АА АА АА ВВ ВВ АА ВВ АА АА АА ВВ АА АА АА АА АА АА ВВ АА АА ВВ АА АА АА ВВ 6,99±0,38 5,31±0,63 6,55±0,23 5,81±0,95 1,64±0,09 1,24±0,16 1,54±0,06 1,35±0,22 0,1141±0,0067 0,1271±0,0090 0,0773±0,0065 0,0945±0,0038

ПРАТ 72(31) ПРАТ 72(40) ВВ АА ВВ АА АА АА ВВ ВВ АА ВВ АА ВВ АА ВВ 5,31±0,63 7,75±0,43 1,24±0,16 1,78±0,10 0,1271±0,0090 0,1258±0,0086

ПРАТ 69(2) ПРАТ 289 ПРАТ 236(1) ПРАТ 72(31) ВВ АА АА АА АА АА АА ВВ АА АА АА АА АА ВВ ВВ АА ВВ АА АА АА АА ВВ АА ВВ АА АА АА ВВ 7,34±0,98 8,53±0,85 7,29±0,54 5,31±0,63 1,67±0,24 1,95±0,22 1,65±0,10 1,24±0,16 0,0422±0,0067 0,0473±0,0050 0,1302±0,0092 0,1271±0,0090

Примечание: жирным шрифтом выделены хромосомы, по которым проводилось сравнение

Как известно, каротиноиды в хлоропластах играют двойную роль. С одной стороны, они являются вспомогательными пигментами светособирающей антенны, улавливающими солнечный свет определенного спектрального состава, с другой - выполняют защитные функции: принимают на себя энергию от избыточного количества возбужденных молекул хлорофилла и безопасным для фотосинтетического аппарата способом рассеивают ее в виде тепловой энергии [6]. Таким образом, содержание каротиноидов является важным показателем стрессоустойчивости фотосинтетического аппарата. Интересно отметить, что в исследованном материале наиболее высокие значения этого показателя наблюдались у тех же самых линий, которые характеризовались высоким содержанием хлорофиллов и наоборот. Наличие положительной корреляции между содержанием хлорофиллов и каротиноидов указывает на сбалансированное формирование фотосинтетического аппарата 4х-тритикале.

При изучении устойчивости растений к действию стрессоров разной природы необходима информация не только о состоянии фотосинтетического аппарата, но и о содержании пигментов внепластидной природы -антоцианов. Как видно из данных таблицы 2, для большинства линий свойственна отрицательная корреляция между содержанием

фотосинтетических пигментов и антоцианов. Самым низким содержанием антоцианов характеризовались имевшие максимальное содержание хлорофиллов и каротиноидов линии ПРАТ 69(2) и ПРАТ 289, и наоборот самое высокое значение показателя отмечено у линии ПРАТ 72(31), отличавшейся минимальным содержанием фотосинтетических пигментов. Исключение из правила составили линии ПРАТ 72(40) и ПРАТ 236(1), у которых (особенно у первой из них) все исследованные показатели были на уровне лучших значений.

При попарном сравнении линий установлена зависимость содержания каротиноидов от хромосомного состава 1 и 5-й гомеологичных групп. Линии с наличием в этих группах хромосом В-генома пшеницы содержали на 25-30% больше пигментов, чем линии с хромосомами 1А и 5 А. В то же время на содержание антоцианов напротив положительный эффект оказывало присутствие в 1-й гомео-логичной группе гомологов А-генома. Линии с хромосомой 1А по содержанию антоцианов превосходили линии с хромосомой 1В на 40%.

Полученную информацию следует учитывать в работах по интрогрессивной гибридизации с целью прогнозирования положительных и негативных последствий удаления из карио-типа определенных хромосом пшеницы при замещении их на соответствующие гомеологи культурных и дикорастущих видов.

Заключение

Представленные выше результаты исследований наглядно демонстрируют возможность использования созданного линейного материала тетраплоидных пшенично-ржаных амфиди-плоидов в работах по генетическому анализу, в частности, для изучения влияния отдельных хромосом пшеницы на проявление адаптивных и хозяйственно-ценных признаков. Использованный при этом принцип попарного сравнения линий, различающихся по хромосомному составу лишь одной гомеологичной

группы, позволяет избежать ряда недостатков, свойственных анеуплоидному анализу, а именно: отрицательных последствий, обусловленных состоянием анеуплоидии, и компенсаторного эффекта, вызванного присутствием гомеологов из других субгеномов пшеницы.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований (грант №Б09СО-004).

Список использованных источников

1. Хотылева, Л.В. Генетические коллек- А.В. Кильчевский, Л.В. Хотылева. - Минск: ции растений / Л.В. Хотылева [и др.] // Гене- Белорус. наука, 2008 - Т.1: Общая генетика тические основы селекции растений /под ред. растений. - Гл .11. - С. 488-518.

2. Тетраплоидные тритикале (создание, ци-тогенетическое изучение и использование в селекции) / В.Е. Бормотов [и др.] — Минск: Наука и техника, - 1990. - 136 с.

3. Идентификация хромосом А и Б геномов пшеницы с использованием замещений и перестроек между гомеологами у пшеницы и тритикале / Н.С. Бадаев [и др.] // Докл. Акад. Наук СССР. - 1983. - Т. 273, - № 4. -С. 994-996.

4. Сычева, Е. А. Тетраплоидные тритикале как объект для цитогенетических исследований. II. Изучение эффектов взаимозамещения хромосом пшеницы на экспрессию призна-

ков продуктивности / Е.А. Сычева, Н.И. Дубовец // Весщ НАН Беларусь Сер.б1ял.навук.

- 2003. - № 3. - С. 57-59.

5. Сычева, Е.А. Тетраплоидные тритикале как объект для цитогенетических исследований. I. Изучение роли индивидуальных хромосом пшеницы в регуляции мейотическо-го спаривания / Е.А.Сычева, Н.И.Дубовец // Весщ НАН Беларусь Сер.б1ял.навук. - 2003.

- № 2. - С. 52-55.

6. Demmig-Adams, В. In vivo functions of carotenoids in higher plants / B. Demmig-Adams, B.A.M. Gilmore, W.W. Adams // FASEB J. - 1996. - Vol. 10, № 4 - P. 403-412.

Дата поступления статьи 16 июля 2010 г.