СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ ПОЛИРЕЗИСТЕНТНЫМИ БАКТЕРИЯМИ (ОБЗОР)

Багандова К. М.; Зулькарнеев Э. Р.; Киселева И. А.; Мизаева Т. Э.; Воробьев А. М.; Ефимова О. Г.; Медведовская М. П.; Пасивкина М. А.; Алешкин А. В.

УДК 578.81:615.015.8-08

https://doi.org/10.23946/2500-0764-2022-7-3-54-63

СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ ПОЛИРЕЗИСТЕНТНЫМИ БАКТЕРИЯМИ (ОБЗОР)

БАГАНДОВА К.М.*1, ЗУЛЬКАРНЕЕВ Э.Р.2, КИСЕЛЕВА И.А.1, МИЗАЕВА Т.Э.1, ВОРОБЬЕВ A.M.1, ЕФИМОВА О.Г.1, МЕДВЕДОВСКАЯ М.П.1, ПАСИВКИНА М.А.1, АЛЕШКИН А. В.1

1ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г. Н. Габричевского» Роспотребнадзора, г. Москва, Россия

2ФКУЗ «Противочумный центр» Роспотребнадзора, г. Москва, Россия

Резюме

Антибиотикорезистентность является актуальной проблемой современной медицины в связи с распространением штаммов микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью. До сих пор продолжается поиск альтернативных способов лечения инфекционных заболеваний, вызванных бактериями. Один из таких подходов, вызывающий значительный интерес, - фаготерапия, в которой бактериофаги используются в качестве действующего вещества. Фаги являются селективными агентами, проявляющими литиче-скую активность в отношении конкретных бактериальных штаммов, в отличие от антибиотиков, большинство из которых обладает широким спектром действия. Выделение природного фага - многоэтапный, кропотливый и трудоемкий процесс, при этом физиология полученных фагов часто плохо изучена, что может приводить к различным несоответствиям на протяжении производства и создания продукта несоответствующего качества. Разработка биотехнологических методов позволяет в настоящее время расширить возможности фаговой терапии за счёт создания биоинженерных бактериофагов. Проведенные исследования по использованию таких фагов в лечении инфекций, вызванных бактериями с множественной устойчивостью к лекарственным препаратам, показали, что фаговая терапия может быть эффективной и как альтернатива, и как дополнение при антибиотикотерапии.

Преимущество генномодифицированных фагов - это, в первую очередь, возможность получе-

ния бактериофагов с измененным, расширенным спектром литической активности. Примененные модификации позволят разработать фаги, нацеленные на гены антибиотикорезистентности, такие как эфлюксные насосы; для использования в сочетании с антибиотиками для усиления бактерицидной активности; а также фаги, обладающие низкой иммуногенностью (путем нахождения мутаций и модификаций, уменьшающих либо скорость элиминации фагов при участии ретикуло-эндотелиальной системы, либо объем бактериального лизиса).

Создание различных вариантов бактериофагов с уникальными характеристиками даст возможность преодолеть имеющиеся недостатки, которыми обладают природные бактериофаги, для активного внедрения их в профилактику и терапию бактериальных заболеваний. Приведены описания проводимых в мире исследований в области разработки и получения бактериофагов с модифицированными свойствами. Показана эффективность данного подхода для лечения инфекций, вызванных полирезистентными возбудителями, а также перспективность дальнейшей работы в этом направлении.

Ключевые слова: бактериофаги, генетическая инженерия, антибиотикорезистентность Конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. Источник финансирования Собственные средства

Для цитирования:

Багандова К.М., Зулькарнеев Э.Р., Киселева И.А., Мизаева Т.Э., Воробьев А.М., Ефимова О.Г., Медведовская М.П., Пасивкина М.А., Алешкин А.В. Создание генетически модифицированных бактериофагов для лечения инфекций, вызванных полирезистентными бактериями (Обзор). Фундаментальная и клиническая медицина. 2022;7(3): 54-63. https://doi. org/10.23946/2500-0764-2022-7-3-54-63

*Корреспонденцию адресовать:

Багандова Калимат Магомедовна, 125212, Россия, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, E-mail: [email protected] © Багандова К.М. и др.

REVIEW ARTICLES

GENETICALLY MODIFIED BACTERIOPHAGES CREATING FOR THE TREATMENT OF INFECTIONS CAUSED BY MULTIDRUG RESISTANT BACTERIA (REVIEW)

KALIMAT M. BAGANDOVA1 *, ELDAR R. ZULKARNEEV2, TOITA E. MIZAEVA1, ALEXEY M. VOROBYOV1, OLGA G. EFIMOVA1, MARIA P. MEDVEDOVSKAYA1, MARIA A. PASIVKINA1, ANDREY V. ALESHKIN1

1G. N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russian Federation 2Anti-Plague Center, Moscow, Russian Federation

Abstract

Antibiotic resistance represents an urgent and unresolved issue due to a rapid spread of multi-drug-resistance organisms (MDROs). An alternative approach is the medical use of bacteriophages which have selective and lytic activity against specific bacterial strains, in contrast to broad-spectrum antibiotics. Isolation of bacterio-phages is a multi-step, tedious, and labour-intensive technique, and physiology of various bacteriophages has been vaguely studied. These drawbacks hamper the flow production of bacteriophage preparations and require a stringent quality control. Here, we review the existing literature on genetically modified bacteriophages, in particular studies which examined efficacy of such bacteriophages for the treatment of multidrug-resistant infections. Genetically modified bacteriophag-es showed high efficiency in patients with multi-

drug-resistant infections applied either as a main treatment modality or as an adjuvant therapy added to the antibiotic treatment protocols. The key advantage of genetically modified bacteriophag-es is broader and higher lytic activity, as they can target antibiotic resistance genes such as efflux pumps, and low immunogenicity which delays their elimination by immune cells. We propose that genetically modified bacteriophages are able to overcome the shortcomings of natural bacterio-phages and can be implemented for the prevention and treatment of bacterial infections, in particular those caused by MDROs.

Keywords: bacteriophages, genetic engineering, antibiotic resistance Conflict of Interest None declared. Funding

There was no funding for this project.

< English

For citation:

Kalimat M. Bagandova, Eldar R. Zulkarneev, Irina A. Kiseleva, Toita E. Mizaeva, Alexey M. Vorobev, Olga G. Efimova, Maria P. Medvedovskaya, Maria A. Pasivkina, Andrei V. Aleshkin. Genetically modified bacteriophages creating for the treatment of infections caused by multidrug resistant bacteria (review). Fundamental and Clinical Medicine. (In Russ.).2022;7(3): 54-63. https://doi. org/10.23946/2500-0764-2022-7-3-54-63

*Corresponding author:

Kalimat M. Bagandova, 10, Admirala Makarova Street, Moscow, 121255, Russian Federation, E-mail: [email protected] © Kalimat M. Bagandova, et al.

Существующие методы генетической инженерии, используемые в создании синтетических бактериофагов, такие как гомологичная рекомбинация; рекомбинирование (рекомбинация) бактериофагов при помощи введения фаговой ДНК путем электропорации; CRISPR-Cas связанная геномная модификация; создание и пересборка фагового генома in Vitro; полногеномный синтез и сборка с помощью подобранных нуклеотидов; создание фаговых геномов с использованием дрожжей; бесклеточные системы транскрипции - трансляции [1, 2, 3, 4, 5] позволили получить положительные результаты в

создании генетически модифицированных бактериофагов, активных в отношении Streptococcus thermophiles [6], Escherichia coli [7], Listeria monocytogenes [8], Listeria ivanovii [9], Klebsiella pneumoniae, Yersinia pseudotuberculosis [10], Bacillus subtilis (Schilling et al), Streptococcus thermophiles [11], Lactococcus lactis [12], Mycobacterium abscessus [13]. Однако понимание механизма взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой-хозяином и различных механизмов защиты бактерий остается ключевой задачей в создании бактериофагов, способных преодолевать данный барьер.

Известными на данный момент механизмами защиты бактерий от инфицирования являются: система рестрикции-модификации, позволяющая модифицировать бактериальный геном и разрушать чужеродную ДНК; изменение рецепторов на поверхности оболочки клетки, предотвращающих адсорбцию фага; абортивная инфекция (Abi)- система, которая запускает гибель клетки или остановку метаболизма; CRISPR-Cas система, запоминающая генетический материал вируса, что предотвращает возможность инфекции в будущем; бактериофаго-вая элиминация, которая позволяет фагу адсорбироваться на клетке, но блокирует ДНК-репликацию.

Эволюция взаимодействия бактериофагов и бактерий развила и продолжает развивать у последних эффективные системы устойчивости, которые защищают бактерии от инфицирования фагами. Подробное изучение механизма адсорбции бактериофага, анализ имеющихся рецепторов на поверхности бактериальной клетки и создание технологий получения инженерных фагов позволит достичь эффективности в лечении пациентов с острым бактериальным инфицированием.

С помощью методов генной инженерии можно получить мутантные фаги с необходимыми характеристиками. Диапазон штаммов-хозяев у различных фагов значительно различается, и найти оптимальную комбинацию природных фагов является сложной задачей. Создание инженерных фагов для перепрограммирования спектра хозяев устраняют это ограничение [14].

Естественная эволюция позволяет изменять спектр хозяев бактериофагов, но отсутствие контроля над тем, где именно происходят мутации, может помешать пониманию структурно-функционального анализа. Поиск и выделение бактериофагов с подходящей специфичностью к хозяину остается сложной задачей. Случайная мутация и рекомбинация между фагами или «протокол Аппельмана» (Appelmans) включает циклическую смену коктейля фагов с группой чувствительных и устойчивых бактерий до тех пор, пока не появится рекомбинант-ный фаг, лизирующий устойчивые штаммы. Данный подход позволил получить бактериофаг, активный в отношении десяти штаммов Pseudomonas aeruginosa, используя изначально два маточных фага, инфицирующих только один или два штамма бактерии. Данная методика включает в себя получение более 30 после-

довательных генерации, вследствие которых возникают не менее 48 случаев рекомбинации и одна точечная мутация между маточными фагами [15].

Таким образом, разработка целевых и высокопроизводительных методов для быстрого расширения определенного спектра и преодоления устоичивости бактерии может проложить путь к разработке фагов следующего поколения [16]. Несколько исследовании, посвященных разным фагам, подтвердили общепринятый в настоящее время принцип, согласно которому RBP является основным фактором, определяющим специфичность хозяйского штамма фага.

Duplessis и Moineau были одними из первых исследователей, которые применили гомологичную рекомбинацию для замены orf18 фага DT1 соответствующим участком orf18 сифови-руса MD4. В результате образовался химерный фаг с узким хозяйским спектром по отношению к Streptococcus thermophiles, соответствующий спектру фага MD4. Рекомбинантные сайты в пяти созданных химерных фагах были различными для каждого фага, но С-терминальный участок ORF18 был определен в качестве ре-цептор-связывающего и, как следствие, детерминантом хозяина [6].

В работе Kevin Yehl et al. проведен направленный мутагенез четко определенных участков в хвостовой фибрилле фага Т3, которые необходимы для распознавания хозяев, таким образом увеличивая пространство последовательностей, экранированных в этих ключевых локусах. Этот подход аналогичен строению антител, разнообразие которых определяется специфичностью эпитоп-связывающих областей антигена. Подобно волокнам фагового хвоста, антитела обладают высокой селективностью к своему целевому антигену [17, 18]. Область распознавания эпитопа расположена на поверхности антител и образована легкой и тяжелой цепями и, в частности, тремя гипервариабельными участками, определяющими ком-плементарность антитела к антигену (complementarity-determining regions CDR). Мутации в этих областях изменяют специфичность антител [19,20]. Хвостовые волокна фага Т7 также имеют CDR-подобные участки на кончике хвостового волокна, что позволяет манипулировать специфичностью фага к клеткам штамма-хозяина посредством изменений в этих небольших регионах. Был проведен направлен-

ный мутагенез участков хвостового волокна, которые определяют возможный диапазон хозяев (HRDR host-range-determining regions) фага Т3. HRDR участки образованы петлями BC, DE, FG и HI, длина которых варьируется от 4 до 9 аминокислотных остатков. Мутации в этих участках практически не сказываются на структуре белка, но существенно влияют на взаимодействие бактерий. В проводимом исследовании ген фибриллы клонировали в плазмиду и амплифицировали с применением вырожденных праймеров, чтобы создать мутантные версии гена. Была использована подготовленная библиотека плазмид для трансформации бактерий, которые затем инфицировали фагом T3. В результате данной работы были получены библиотеки фагов с рандомизированными мутациями в петлях за счет рекомбинации с плаз-мидой. Последующий скрининг библиотек фаговых тел на бактериальных мутантах AwaaG и AwaaC, которые обладают резистентностью к Т3, показал, что мутагенез отдельных петель расширяет спектр фагов-хозяев. Каждая библиотека, в которой была изменена петля HI, вырабатывала фаговые антитела против каждой мутантной культуры AwaaG и AwaaC. Тем не менее, фаговые тела для мутагенезированных петель DE и FG в редких случаях демонстрировали активность по отношению AwaaG и AwaaC. Примерно половина библиотек, нацеленных на всю или отдельные части BC петли, вырабатывали фаговые тела, активные в отношении AwaaG или AwaaC. Эффективность инженерных бактериофагов была подтверждена на мышиной модели раневой инфекции [16].

Matthew Dunne с соавторами провели работу по адаптации фага к листерии через вариации RBP. Структурно-направленная разработка химерного RBP позволяет получить фаг с предсказуемым диапазоном хозяев. Авторы данной работы идентифицировали RBP Gp15 фага PSA Listeria monocytogenes и сконструировали фаговую библиотеку, содержащую различные по последовательности RBP, из которых выделили мутанты и интегрировали в синтетический поливалентный фаг с расширенным диапазоном хозяев. Штаммы листерии избегают фагового инфицирования, модифицируя тейховые кислоты клеточной стенки гликозилировани-ем соответствующих участков вместо использования внутриклеточных механизмов [21]. Были получены гликозилированные мутанты, дефектные по глюкозе (WSLC1042 gltB),

галактозе (WSLC1042 gttA), и мутант с недостатком обоих компонентов (WSLC1042_a511-BIM) (Sumrall, 2019). Было обнаружено, что RBP связывание строго зависит от наличия галактозы, таким образом, определили галактози-лированный участок GlcNAc, являющийся рецептором для RBP фага, а также способствующий адсорбции и образовании бляшек. Созданная таким образом синтетическая фаговая библиотека включала рандомизированные по последовательности RBP, которые были выделены из каждого мутанта культуры - хозяина и затем интегрированы в синтетический поливалентный фаг с расширенным диапазоном хозяев. Структурно-ориентированная модификация позволяет обмениваться гетерологичными доменами головки, шеи или плеч RBP с образованием химерных фагов с ожидаемым расширенным диапазоном хозяев. Данное исследование позволило создать методику, которая может способствовать развитию биопрепаратов на основе стандартизированных вирусных каркасов с настраиваемой специфичностью к клеткам хозяина [8].

Наиболее усовершенствованным подходом разработки RBP является высокопроизводительная платформа фагового генома, основанная на клонировании с заполнением бреши (gap-repair cloning) в дрожжах, представленной в своем исследовании Ando с соавторами [10]. Ампликоны ПЦР, покрывающие геном фага и имеющие перекрывающиеся концы, совместно электропорируют в клетки дрожжей с линеаризованным вектором YAC (yeast artificial chromosome). Высокоэффективная система гомологичной рекомбинации в дрожжах сшивает все фрагменты вместе путем клонирования с восстановлением бреши. ДНК изолированного YAC-фага, несущая интактный геном, впоследствии используется для трансформации высококомпетентных клеток E. Coli для перезагрузки в частицы инфекционного фага. Такой подход позволяет осуществлять точный обмен генетическими фрагментами на основе коллекции ампликонов, используемых для трансформации. Данная платформа с использованием клеток дрожжей позволяет достичь определенного диапазона хозяев путем замены участков и целых хвостовых волокон в вирусную матрицу (скаффолд). Таким образом, фаги могут быть получены для точного редактирования микробной популяции. Исследование проводили на Т7-подобных фагах (включающих E.coli

фаги T7, T3 и Klebsiella pneumoniae фаг K11), так как эти фаги в значительной степени независимы от метаболизма хозяина, что позволяет перезагрузить неколийные фаги с помощью клеточного аппарата E.coli. Разнообразные вариации синтетических фагов, имеющие T3 и Т7 матрицу с геном gp17 хвостового волокна, который был заменен на соответствующий ген другого фага, показал предполагаемый обмен хозяйским диапазоном. При изучении химерных хвостовых волокон, содержащих N-концевой якорный домен, для присоединения к капсиду и С-терминальный рецептор-связывающий участок Т3 и Т7, наблюдалась строгая зависимость диапазона хозяев от различных С-концевых доменов, в то время как высоко консервативный N-концевой участок Т3 и Т7 являлся взаимозаменяемым. Более того, синтетический фаг Т3, содержащий матрицу Т3 с хвостовым волокном фага R, штамм-хозяин которого Yersinia pseudotuberculosis, был сконструирован путем введения трех мутаций в гене gp17 фага. Полученный фаг обладал активностью по отношению к определенному спектру хозяев, сходным с таковым у фага R. Авторам также удалось создать модифицированные фаги путем обмена хвостовых волокон между более отдаленными фагами. Был получен функциональный синтетический фаг Т7 с волокном хвоста фага Т11, активный в отношении K.pneumoniae, но не на E.coli. Более того, был получен фаг K11 с Т7 хвостовым волокном путем замены всех трех хвостовых генов 11, 12 и 17 на соответствующие гены другого фага, нацеленного на E.coli, но не на K.рneumoniae. Таким образом, используя сборочную платформу, основанную на дрожжах, все генетические модификации, которые расположены в разных участках генома, выполняются в одной реакции. Тем не менее, стоит отметить, что обмен белками хвостового волокна, используя данную платформу, можно производить только между фагами с известным и хорошо охарактеризованным геномом [10].

Поскольку бактерии в природе обитают главным образом в мультивидовых сообществах [23], бактериофаги могут сталкиваться с гетерогенными популяциями, клетки которых как устойчивы (R), так и чувствительны (S) к фагам. В исследовании Elhanan Tzipilevich с соавторами демонстрируется, что клетки резистентной (R) Bacillus subtilis, лишенные рецептора к фагу SPP1, могут лизироваться при совместном культивировании с клетками, чувствительными

(S) к фагу. Частичный лизис был вызван фаговыми литическими ферментами, высвободившимися из соседних инфицированных клеток. Было обнаружено, что в R-клетки, лишенные SPP1 рецептора, могут проникать фаги при совместном культивировании с S-клетками. Данный процесс также наблюдался для литических фагов phi29 и SPO1. Инвазия фагов в R-клетки была опосредована, по крайней мере, частично, молекулами прикрепления фагов, доставленными из S в R-клетки, временно превращая R в "S''-клетки. Этот феномен был назван «приобретение чувствительности» (ASEN - acquisition of sensitivity). Обмен фаговыми рецепторами может происходить межвидовым образом, облегчая тем самым прикрепление фагов к клеткам бактерий, не являющимся их хозяевами [24].

Система CRISPR/Cas9 - универсальный инструмент генной инженерии, использующийся биологами с определенной целью: для внесения одноцепочечных или двухцепочечных разрывов ДНК в интересующие участки генома. Clustered Regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas или «сгруппированные короткие палиндромные повторы, разделенные промежутками, и ассоциированная с ними система» [25] была открыта в конце прошлого века как система адаптивного приобретенного иммунитета бактерий и архей, направленная на уничтожение проникшей в клетку чужеродной ДНК, например, фагов или плазмид [26, 27].

CRISPR/Cas система впервые была применена для редактирования фагового генома в 2014 году для отбора мутанта T7 c делецией гена 1.7 [28]. В этой работе CRISPR/Cas система была использована в качестве скрининга для удаления фагов дикого типа (WT) из рекомбинантов. Разработанная плазмида, нацеленная на ген 1.7, разрывала геном WT и удаляла дикий тип фагов T7. В противоположность этому, мутантные фаги с отсутствующим геном 1.7 являлись резистентными к Cas9 комплексу и функционировали нормально [28]. Позднее была определена (идентифицирована) CRISPR/Cas система I типа бактерии Vibrio cholera и использована для конструирования литического фага культуры [28]. В этой системе как донорная ДНК, так и компоненты системы CRISPR-Cas были собраны в одну плазмиду. Данная плазмида приводила к разрыву генома фага CRISPR/Cas системой, который был восстановлен гомологичной рекомбинацией с помощью ДНК донора,

что позволило получить рекомбинантные фаги с делецией или вставкой (Box, 2016). Несмотря на то, что впервые CRISPR-Cas система II типа для перепрограммирования фага была описана для клеток Streptococcus thermophiles [30], CRISPR/Cas Streptococcus pyogenes используется намного чаще для конструирования генома фага [31, 32, 33, 34]). Нуклеаза SpCas9, в отличие от нуклеаз других CRISPR-семейств, не требует дополнительных белков-кофакторов для связывания и разрезания ДНК. В естественных условиях для активации Cas9-нуклеазы необходимы две РНК: CRISPR-ассоциированная РНК (crRNa), происходящая из геномного локу-са, хранящего фрагменты вирусных последовательностей; а также транс-активирующая РНК (tracrRNA), которая действует как каркас, связывающий crRNA с Cas9 и облегчает процес-синг зрелых сгРНК из пре-сгРНК. Однако для целей генной инженерии две РНК объединены в составе одной химерной молекулы sgRNA(s-ingle guide RNA). Плазмида для редактирования должна содержать рекомбинантный участок (матрицу) с желаемой мутацией, которая предотвращает влияние системы CRISPR-Cas, а также гомологичные участки конструируемого фагового генома [35, 36]. Martel и Moineau использовали эндогенную систему CRISPR/Cas II типа у Streptococcus thermophiles и получили точечные мутации, делеции и обмен генами в фаге 2972 S.thermophiles. С этой целью они использовали плазмиду с системой CRISPR с ну-клеазной активностью по отношению к геному фагов дикого типа [30].

Описан ряд исследований, в которых удалось успешно перенести систему CRISPR/Cas Streptococcus pyogenes в Lactococcus lactis [31], E.coli [32], Klebsiella pneumoniae [34], и Bacillus subtilis [33] и использовать их как гетерологич-ную систему для модификации фагов соответствующих штаммов-хозяев. Помимо использования ранее охарактеризованных систем II A типа, Hupfeld с соавторами была найдена новая CRISPR/Cas система Listeria ivanovii (подвид londoniensis WSLC 30167), которая затем была адаптирована и использована в генной инженерии крупных, неинтегрирующих фагов в L. Monocytogenes. Была создана (сконструирована) LivCRISPR-1 программированная, специфичная в последовательности нуклеазная система, которая может быть передана другим видам рода Listeria. LivCRISPR-1 генома L. Iva-novii подвида londoniensis относится ко II A

типу. Комплекс LivCRISPR-1 Cas9 и crRNA были встроены в Listeria monocytogenes. Полученные мутанты с делецией гена LivCRISPR-1 сas были восприимчивы к фагу B054, при этом они оставались нечувствительными к фагам B025, B035 и B056, которые связываются с клетками WSLC 30167 [9]. Таким образом, программи-руемость CRISP/Cas облегчает создание организмов с направленными генными мутациями, встройками генов и крупными хромосомными перестройками.

Методика рекомбинирования бактериофагов при помощи введения фаговой ДНК путем электропорации используется для простого и эффективного конструирования целевых мутантов. Суть методики заключается в совместной электропорации рекомбинируемых субстратов, т. е. ДНК фага и двухцепочечной ДНК (дцДНК), в электрокомпетентные бактериальные клетки, несущие плазмиды с генами белков, обеспечивающих высокий уровень гомологичной рекомбинации, таких как RecE/ RecT-подобные белки [37]. Данная стратегия позволяет добиться немаркированных делеций как существенных (основных), так и несущественных генов, делеций внутри рамки считывания, точечных мутаций и нонсенс (бессмысленных) - мутаций, добавление меток и определенной (точной) вставки чужеродного гена [38]. Субстратная дцДНК несет фрагмент ДНК, который необходимо вставить, и гомологичные участки к локусам выше и ниже участка генома фага, который необходимо изменить [38, 39]. После электропорации бактериальные клетки выделяют, смешивают с клетками дикого типа и высевают на чашках Петри. Затем чашки просматриваются на наличие негативных колоний фага, определяемых по лизису бактерий. Образовавшиеся бляшки содержат смесь фагов как дикого, так и мутантного типа. Отдельные колонии анализируют на наличие искомой мутации фагового генома при помощи ПЦР. При использовании этой методики удается получить большую долю (10-15%) успешно модифицированных бактериофагов, что позволяет отбирать необходимые мутантные фаги небольшим числом ПЦР без проведения дальнейшего отбора [38]. Эта технология требует наличия высококомпетентных бактериальных клеток. Впервые этот метод был разработан для мико-бактериофагов и позднее был адаптирован для большинства различных фагов для внесения делеций, замен и вставок [38, 40].

Используя данную стратегию, Rebekah M.Ded-rick с соавторами разработали литическое производное фага ZoeJ с отсутствующим репрессором гена, который проявил эффективность в отношении штамма Mycobacterium abscessus [41]. Пятнадцатилетний пациент с трансплантацией легкого, зараженный устойчивым к антибиотикам M. Äbscessus, получал коктейль фагов, включающий в себя бактериофаг с удаленным репрессором. Результатом терапии стало скорое восстановление состояния пациента. Тем не менее, не исключается вероятность того, что пациент пошел бы на поправку и без терапии фаговым коктейлем. Однако было отмечено, что пациенты с подобной клинической картиной зачастую имеют высокую заболеваемость и смертность и улучшение состояния не связано с прекращением или началом приема других препаратов, тем самым подтверждая доказательство репликации фага in vivo [13].

Заключение

В настоящее время активное использование различных методик генетической инженерии,

позволяющих получить модифицированные бактериофаги с измененным, расширенным спектром литической активности позволило создать фаги к таким бактериальным штаммам, как Streptococcus thermophiles, Esherichia coli, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Klebsi-ella pneumoniae, Yersinia pseudotuberculosis, Bacillus subtilis, Streptococcus thermophiles, Lacto-coccus lactis, Mycobacterium abscessus.

Тем не менее, нет отработанных методик получения рекомбинантных бактериофагов, активных в отношении Acinetobacter и Pseudomonas, которые являются главными нозокоми-альными (внутрибольничными) патогенами во всем мире и обладают резистентностью к ряду антибактериальных химиопрепаратов. Возможность создания фагов не только с измененным, но и с расширенным спектром позволит разработать бактериофаги, которые будут проявлять литическую активность в отношении бактерий одного вида и порядка, что может стать основной альтернативой в лечении бактериальных инфекций антибиотиками.

Литература:

1. Bikard D, Euler CW, Jiang W, Nussenzweig PM, Goldberg GW, Duportet X, Fischetti VA, Marraffini LA. Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials. Nat Biotechnol. 2014;32(11):1146-1150. http://doi.org/10.1038/nbt.3043

2. Kutateladze M, Adamia R. Bacteriophages as potential new therapeutics to replace or supplement antibiotics. Trends Biotechnol. 2010;28(12):591-595. http://doi.org/10.1016Zj.tibtech.2010.08.001

3. Kter EM, De Vos D, Gvasalia G, Alavidze Z, Gogokhia L, Kuhl S, Abedon ST. Phage therapy in clinical practice: treatment of human infections. Curr Pharm Biotechnol. 2010;11(1):69-86. http://doi. org/10.2174/138920110790725401

4. Kutter EM., Kuhl SJ, Abedon ST. Re-establishing a place for phage therapy in western medicine. Future Microbiol. 2015;10(5):685-688. http://doi.org/10.2217/fmb.15.28

5. Lu TK, Collins JJ. Engineered bacteriophage targeting gene networks as adjuvants for antibiotic therapy. Proc Natl Acad Sci US A. 2009;106(12):4629-4634. http://doi.org/10.1073/pnas.0800442106

6. Duplessis M, Moineau S. Identification of a genetic determinant responsible for host specificity in Streptococcus thermophilus bacteriophages. Mol Microbiol. 2001;41(2):325-336. http://doi. org/10.1046/j.1365-2958.2001.02521.x.

7. Yehl K, Lemire S, Yang AC, Ando H, Mimee M, Torres MT, de la Fuente-Nunez C, Lu TK. Engineering Phage Host-Range and Suppressing Bacterial Resistance through Phage Tail Fiber Mutagenesis. Cell. 2019;179(2):459-469.e9. http://doi.org/10.1016/j.cell.2019.09.015

8. Dunne M, Rupf B, Tala M, Qabrati X, Ernst P, Shen Y, Sumrall E, Heeb L, Pluckthun A, Loessner MJ, Kilcher S. Reprogramming Bacteriophage Host Range through Structure-Guided Design of Chimeric Receptor Binding Proteins. Cell Rep. 2019;29(5):1336-1350. e4. http://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.09.062

9. Hupfeld M, Trasanidou D, Ramazzini L, Klumpp J, Loessner MJ, Kilcher S. A functional type II-A CRISPR-Cas system from Listeria enables efficient genome editing of large non-integrating bacteriophage. Nucleic Acids Res. 2018;46(13):6920-6933.http://doi. org/10.1093/nar/gky544

10. Ando H, Lemire S, Pires DP, Lu TK. Engineering Modular Viral Scaffolds for Targeted Bacterial Population Editing. Cell Syst.

2015;1(3):187-196. http://doi.Org/10.1016/j.cels.2015.08.013

11. Martel B, Moineau S. CRISPR-Cas: an efficient tool for genome engineering of virulent bacteriophages. Nucleic Acids Res. 2014;42(14):9504-9513. http://doi.org/10.1093/nar/gku628

12. Lemay ML, Tremblay DM, Moineau S. Genome Engineering of Virulent Lactococcal Phages Using CRISPR-Cas9. ACS Synth Biol. 2017;6(7):1351-1358. http://doi.org/10.1021/acssynbio.6b00388

13. Dedrick RM, Guerrero-Bustamante CA, Garlena RA, Russell DA, Ford K, Harris K, Gilmour KC, Soothill J, Jacobs-Sera D, Schooley RT, Hatfull GF, Spencer H. Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat Med. 2019;25(5):730-733. http://doi.org/10.1038/s41591-019-0437-z

14. Huss P, Raman S. Engineered bacteriophages as programmable biocontrol agents. Curr Opin Biotechnol. 2020;61:116-121. http://doi. org/10.1016/j.copbio.2019.11.013

15. Burrowes BH, Molineux IJ, Fralick JA. Directed in Vitro Evolution of Therapeutic Bacteriophages: The Appelmans Protocol. Viruses. 2019;11(3):241. http://doi.org/10.3390/v11030241

16. Yehl K, Lemire S, Yang AC, Ando H, Mimee M, Torres MT, de la Fuente-Nunez C, Lu TK. Engineering Phage Host-Range and Suppressing Bacterial Resistance through Phage Tail Fiber Mutagenesis. Cell. 2019;179(2):459-469.e9. http://doi.org/10.1016Zj.cell.2019.09.015

17. Beck A, Wurch T, Bailly C, Corvaia N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 2010;10(5):345-352. http://doi.org/10.1038/nri2747

18. Foltz IN, Karow M, Wasserman SM. Evolution and emergence of therapeutic monoclonal antibodies: what cardiologists need to know. Circulation. 2013;127(22):2222-2230. http://doi.org/10.1161/ CIRCULATI0NAHA.113.002033

19. Ducancel F, Muller BH. Molecular engineering of antibodies for therapeutic and diagnostic purposes. MAbs. 2012;4(4):445-457. http:// doi.org/10.4161/mabs.20776

20. Igawa T, Tsunoda H, Kuramochi T, Sampei Z, Ishii S, Hattori K. Engineering the variable region of therapeutic IgG antibodies. MAbs. 2011;3(3):243-252. http://doi.org/10.4161/mabs.3.3.15234

21. Eugster MR, Morax LS, Hüls VJ, Huwiler SG, Leclercq A, Lecuit M,

Loessner MJ. Bacteriophage predation promotes serovar diversification in Listeria monocytogenes. Mol Microbiol. 2015;97(1):33-46. http:// doi.org/10.1111/mmi.13009

22. Sumrall ET, Shen Y, Keller AP, Rismondo J, Pavlou M, Eugster MR, Boulos S, Disson O, Thouvenot P, Kilcher S, Wollscheid B, Cabanes D, Lecuit M, Gründling A, Loessner MJ. Phage resistance at the cost of virulence: Listeria monocytogenes serovar 4b requires galactosylated teichoic acids for InlB-mediated invasion. PLoS Pathog. 2019;15(10):e1008032. http://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008032

23. Kolenbrander PE, Palmer RJ Jr, Periasamy S, Jakubovics NS. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nat Rev Microbiol. 2010;8(7):471-480. http://doi.org/10.1038/ nrmicro2381

24. Tzipilevich E, Habusha M, Ben-Yehuda S. Acquisition of Phage Sensitivity by Bacteria through Exchange of Phage Receptors. Cell. 2017;168(1-2):186-199.e12.http://doi.org/10.1016/j.cell.2016.12.003

25. Смирнов А.В., Юнусова А.М., Лукьянчикова В.А., Баттулин Н.Р. Система. CRISPR/Cas9 - универсальный инструмент геномной инженерии. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2016;20(4):493-510. http://doi.org/10.18699/VJ16.175

26. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007;315(5819):1709-1712. http://doi.org/10.1126/science.1138140

27. Shen J, Zhou J, Chen GQ, Xiu ZL. Efficient Genome Engineering of a Virulent Klebsiella Bacteriophage Using CRISPR-Cas9. J Virol. 2018;92(17):e00534-18. http://doi.org/10.1128/JVI.00534-18

28. Kiro R, Shitrit D, Qimron U. Efficient engineering of a bacteriophage genome using the type I-E CRISPR-Cas system. RNA Biol. 2014;11(1):42-44. http://doi.org/10.4161/rna.27766

29. Box AM, McGuffie MJ, O'Hara BJ, Seed KD. Functional Analysis of Bacteriophage Immunity through a Type I-E CRISPR-Cas System in Vibrio cholerae and Its Application in Bacteriophage Genome Engineering. JBacteriol. 2015;198(3):578-590. http://doi.org/10.1128/ JB.00747-15

30. Martel B, Moineau S. CRISPR-Cas: an efficient tool for genome engineering of virulent bacteriophages. Nucleic Acids Res. 2014;42(14):9504-9513. http://doi.org/10.1093/nar/gku628

31. Lemay ML, Tremblay DM, Moineau S. Genome Engineering of

Virulent Lactococcal Phages Using CRISPR-Cas9. ACS Synth Biol. 2017;6(7):1351-1358. http://doi.org/10.1021/acssynbio.6b00388

32. Tao P, Wu X, Tang WC, Zhu J, Rao V. Engineering of Bacteriophage T4 Genome Using CRISPR-Cas9. ACS Synth Biol. 2017;6(10):1952-1961. http://doi.org/10.1021/acssynbio.7b00179

33. Schilling T, Dietrich S, Hoppert M, Hertel R. A CRISPR-Cas9-Based Toolkit for Fast and Precise In Vivo Genetic Engineering of Bacillus subtilis Phages. Viruses. 2018;10(5):241. http://doi.org/10.3390/ v10050241

34. Shen J, Zhou J, Chen GQ, Xiu ZL. Efficient Genome Engineering of a Virulent Klebsiella Bacteriophage Using CRISPR-Cas9. J Virol. 2018;92(17):e00534-18. http://doi.org/10.1128/JVI.00534-18

35. Bikard D, Euler CW, Jiang W, Nussenzweig PM, Goldberg GW, Duportet X, Fischetti VA, Marraffini LA. Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials. Nat Biotechnol. 2014;32(11):1146-1150. http://doi.org/10.1038/nbt.3043

36. Kiro R, Shitrit D, Qimron U. Efficient engineering of a bacteriophage genome using the type I-E CRISPR-Cas system. RNA Biol. 2014;11(1):42-44. http://doi.org/10.4161/rna.2776

37. Marinelli LJ, Hatfull GF, Piuri M. Recombineering: A powerful tool for modification of bacteriophage genomes. Bacteriophage. 2012;2(1):5-14. http://doi.org/10.4161/bact.18778

38. Marinelli LJ, Piuri M, Swigonova Z, Balachandran A, Oldfield LM, van Kessel JC, Hatfull GF. BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes. PLoS One. 2008;3(12):e3957. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0003957

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

39. Sharan SK, Thomason LC, Kuznetsov SG, Court DL. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat Protoc. 2009;4(2):206-223. http://doi.org/10.1038/nprot.2008.227

40. Thomason LC, Oppenheim AB, Court DL. Modifying bacteriophage lambda with recombineering. Methods Mol Biol. 2009;501:239-251. http://doi.org/10.1007/978-1-60327-164-6_21

41. Dedrick RM, Guerrero-Bustamante CA, Garlena RA, Russell DA, Ford K, Harris K, Gilmour KC, Soothill J, Jacobs-Sera D, Schooley RT, Hatfull GF, Spencer H. Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat Med. 2019;25(5):730-733. http://doi.org/10.1038/s41591-019-0437-z

References: