CC BY
82
С.Н. Скопинская, С.П. Ярков, E.H. Храмов
Создание диагностических тест-систем на основе иммунохроматографии и наночастиц гексацианферрата (II) железа (III)
ФГУП Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения ФМБА России, г. Москва
S.N. Skopinskaya, S.P. Yarkov, E.N. Khramov
Development of the diagnostic test-systems based on immunochromatogra-phy and nanoparticles of iron (III) hexacyanoferrate (II)
FSUE State Scientific Research Institute of Biological Engineering FMBA of Russia
Ключевые слова•
Keywords'
Цель исследования'
Objective•
Материалы и методы•
•Ns-
Materials and methods•
Results•
Результаты•
Conclusions'
Выводы•
Введение
Иммунохроматография — высокотехнологичный метод, позволяющий в течение короткого времени (15—40 мин) провести диагностику широкого круга серьезных патологий, включающих инфекционные и соматические заболевания человека и животных, анализ объектов окружающей среды, контроль качества пищевых продуктов [6; 13]. Большинство иммунохроматографических тест-систем, применяемых в России, производят за рубежом, что определяет их высокую стоимость и относительно низкую доступность для потребителя. В качестве материала для конъюгирования с антителами (АТ) или антигенами (АГ) в иммунохроматографии применяют главным образом частицы коллоидного золота или окрашенные латексы [9]. В этом случае о срабатывании тест-системы судят визуально — по появлению окрашенных полос на иммунохроматографической мембране. В целях повышения чувствительности анализа для формирования иммунохроматографических конъюгатов используют также квантовые точки [5; 8], флуоресцирующие латексы [5], частицы углерода [16], фосфоры с двух-фотонным возбуждением [15], парамагнитные частицы [12], липосомы [5; 7]. Наряду с визуальным наблюдением результатов таких тестов используют приборы, регистрирующие интенсивность люминесценции, окраски либо
парамагнитные свойства частиц. Несмотря на разнообразие веществ и структур, используемых в качестве дисперсной фазы при имму-нохроматографии, актуальным является поиск новых соединений, применение которых позволит улучшить характеристики иммуно-хроматографического анализа (ИХА), например снизить предел обнаружения аналита и время анализа, а также уменьшить его стоимость.
Гидрозоли гексацианферрата (II) железа (III) (ГЦФЖ) способны к адсорбции АТ и АГ различной химической природы, ярко окрашены и стабильны при хранении. Для целей иммунодиагностики гидрозоли ГЦФЖ применили А.Г. Мешандин и соавт. [1]. Они использовали сенсибилизированные АТ- или АГ-гидрозольные препараты ГЦФЖ для постановки реакции агглютинации с последующей регистрацией результатов анализа на фильтровальной бумаге, стекле или в лунках полистирольного планшета. Описано также применение гидрозолей ГЦФЖ в качестве покрытия электродов биосенсоров, применяемых для обнаружения перекиси водорода, гемоглобина, глюкозы [14]. Работ, посвященных использованию гидрозолей ГЦФЖ для создания диагностических иммунохроматографических тест-систем, авторами настоящей статьи в доступной литературе обнаружено не было.
Ранее нами была показана возможность получения на основе гидрозолей ГЦФЖ им-мунохимически активныгх и устойчивыгх конь-югатов с АТ, а также с бактериальными АГ липополисахаридной и гликопротеиновой природы. Быша продемонстрирована пригодность полученныгх коньюгатов для конструирования иммунохроматографических тестов для выявления холерного экзотоксина, иммуноглобулинов человека, АТ к рекомбинантному гли-
копротеиновому комплексу из............. •
.......... H37 Rv, поверхностные АГ сальмонелл и АТ к ним [2]. Полученные коньюга-ты гидрозолей обладали ярким синим цветом, что важно в иммунохроматографии с визуальным наблюдением результатов анализа.
Целью данной работы стало создание диагностических тест-систем на основе гидрозолей ГЦФЖ для выявления противотуберкулезные АТ и поверхностного О-АГ сальмонелл серогрупп В и/или D и оценка возможности их применения для исследования клинических образцов.
Материалы и методы
......... Использовали сахарозу,
хлорное железо (III) 6-водное, быгаий сывороточный альбумин (БСА), фракцию V «Sigma» (США), твин-20 «Fluka», поливинилпирро-лидон (молекулярный вес — 10 000) «ICN» (США). Остальные реактивы быши отечественного производства с чистотой «чда» или «хч».
.................... Использовали кроличью сыворотку, содержащую поликлональные АТ к сумме иммуноглобулинов (IgG+IgA+IgM) человека (КрАЧ),
липополисахарид (ЛПС) из ..........
.......... (оба препарата «Sigma», США).
Применяли козьи антикроличьи IgG (Коз-АКр) (ООО «ИМТЕК», Россия), препарат рекомбинантного гликопротеинового комплекса из........................ H37 Rv
(ТБ) производства ООО «Бионом», Россия. Использовали сыворотки диагностические сальмонеллезные неадсорбированные сухие к
.............. и............B для реакции
агглютинации и реакции пассивной гемагглю-тинации производства Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток.
Используемые для иммунохромато-графии материалы, получение гидрозолей
ГЦФЖ и их коньюгатов описаны в другой нашей работе [2]. Для сравнительной характеристики возможностей тест-системы «ТУБ - АТ - Иммунохром - Гидрозоль» использо -вали набор реагентов «Туб АТ-Иммунохром» на основе частиц коллоидного золота (№ ФСР 2011/09581) производства ФГУП «ГосНИИБП» ФМБА России.
Об аналитическом эффекте судили по появлению в аналитической зоне мембраны теста видимой глазом полосы сине-голубого цвета. Для получения количественных данных интенсивность окрашивания линий иммунохроматограмм в условных единицах измеряли с помощью анализатора им-мунохроматографического видеоцифрового АИВЦ-1 разработки ФГУП «ГосНИИБП» ФМБА России.
Образцы сывороток и плазмы крови больных туберкулезом, практически здоровых доноров и больных другими заболеваниями, полученные из Серпуховского и Кулаковского противотуберкулезных диспансеров, были предоставлены Н.Н. Кисличкиным и О.А. Ивановой (ООО «Бионом», Россия).
Для оценки тест-системы «САЛЬМО-НЕЛЛА-АГ-(В+Б)-Иммунохром-Гидрозоль» использовали сыворотки крови пациентов, полученные из Детской инфекционной клинической больницы № 5 г. Москвы от Л.Н. Милютиной.
Результаты исследования и их обсуждение
Основным аналитическим компонентом диагностической тест-системы является иммунохроматографический тест. Общая схема его построения представлена на рис. 1.
Каждый тест представляет собой пластиковое основание (подложку) прямоугольной формы с наклеенной на него нитроцел-люлозной мембраной с иммунными компонентами, нанесенными в аналитическую и контрольную зоны в виде узких полос. Состав иммунных компонентов тестов представлен в табл. 1. Нитроцеллюлозная мембрана соединена с подложкой, на которую нанесен конью-гат гидрозоля ГЦФЖ, и подложками для нанесения и впитывания образца. Полученный мультимембранный композит помещается в оправу из белого пластика с двумя отвер-
Рис. 1. Схема построения иммунохроматографического теста. 1 - подложка для нанесения образца; 2 - подложка с высушенным раствором конъюгата гидрозоля ГЦФЖ с иммунными компонентами; 3 - аналитическая нитроцеллюлозная мембрана; 4 - аналитическая зона; 5 - АТ в контрольной зоне; 6 - впитывающая подложка; 7 - пластиковая оправа. Стрелкой указано направление тока жидкости, в которой растворен анализируемый образец
стиями: для нанесения исследуемого образца (маркировка «Я») и визуального наблюдения результатов — аналитическая и контрольные зоны (с маркировками «Т» и «С», аббревиатуры английских слов • ••• и.......). Для лучшей сохранности теста во время хранения его помещают в газонепроницаемый пакет с основой из алюминиевой фольги с осушителем.
На основе полученных тестов были сформированы тест-системы, внешний вид которых представлен на рис. 2.
Тест-система «ТУБ - АТ - Иммунохром -Гидрозоль», предназначенная для выявления специфических АТ к возбудителю туберкулеза (...............) в сыворотке (плазме) крови человека методом иммунохроматографического экспресс-анализа на основе ГЦФЖ с визуальной интерпретацией результатов, может быть применена для ранней диагностики туберкулеза и скрининго-вого обследования на туберкулез больших групп людей. В состав тест-системы входят: иммунохроматографические тесты — 20 шт., раствор для разбавления образцов сыворотки крови (ИХА-раствор), пластиковые одноразовые конические пробирки с крышкой для приготовления анализируемых образцов, инструкция по применению.
Принцип работы теста заключается в следующем. Исследуемый образец сыворотки (плазмы) крови человека смешивается с ИХА-раствором и вносится в отверстие для нанесения образца. При наличии в исследуемом образце сыворотки (плазмы) крови специфических противотуберкулезных АТ они реагируют с кроличьими поликло-нальными АТ к иммуноглобулинам человека (]$А+]$М+]£0), конъюгированными с нано-частицами ГЦФЖ, образуя окрашенный комплекс. Этот комплекс движется по мембране благодаря капиллярным силам и реагиру-
Рис. 2. Внешний вид иммунохроматографических тест-систем на основе гидрозолей ГЦФЖ
Состав иммунных компонентов тест-систем на основе гидрозолей ГЦФЖ
Название тест-системы Определяемый аналит Состав и конъюгата Состав иммунного компонента
Аналитическая зона Контрольная зона
«ТУБ-АТ-Иммунохром-Гидрозоль» Противотуберкулезные АТ КрАЧ ТБ Коз-АКр
«САЛЬМОНЕЛЛА-АГ-(В+Б)-Иммунохром-Гидрозоль» О-АГ сальмонелл серогрупп В и/или Б ЛПС из • ••••••»••а** ЛПС из • ••••••»••а** Сыворотка к • ••••••—••••• или
ет с иммобилизованным в аналитической зоне мембраны (на уровне маркировки «Т») ТБ-АГ из...............Н37 иу, образуя окрашенную линию сине-голубого цвета. В отсутствие в исследуемом образце сыворотки ( плазмы) крови специфических противотуберкулезных АТ окрашенная линия сине-голубого цвета в аналитической зоне мембраны не образуется.
Несвязавшийся в аналитической зоне избыток конъюгата ГЦФЖ и КрАЧ перемещается по мембране далее и взаимодействует с антивидовыми АТ (Коз-АКр), нанесенными в контрольную зону мембраны, с образованием окрашенной линии сине-голубого цвета (на уровне маркировки «С») вне зависимости от наличия в образце специфических противотуберкулезных АТ. Наличие окрашенной полосы в контрольной зоне свидетельствует о работоспособности конъюгата и внесении достаточного количества образца, что является внутренним контролем работы теста. Разработанный тест специфичен, он не взаимодействует с гетерологичными АТ.
Тест-система «САЛЬМОНЕЛЛА-АГ-(В+Б) -Иммунохром-Гидрозоль» предназначена для выявления соматических О-АГ сальмонелл серогрупп В и/или Б в сыворотке (плазме) крови человека методом имму-нохроматографического экспресс-анализа на основе ГЦФЖ с визуальной интерпретацией результатов. Экспресс-выявление в сыворотке (плазме) крови человека растворимых О-АГ сальмонелл может иметь значение для быстрой постановки диагноза, что важно для своевременного назначения адекватного обследования и терапии, правильного размещения больных в стационаре, исключающего возможность внутри-больничного инфицирования; подтверждения сальмонеллеза у пациентов, находя -щихся на излечении, в том числе при наличии смешанной инфекции; выявления бактерионосительства. В состав тест-системы входят 25 иммунохроматографических тестов, ИХА-раствор, одноразовые пластиковые конические пробирки с крышкой для анализируемых образцов, диагностическая сальмонеллезная сыворотка, инструкция по применению.
Принцип работы теста заключается в следующем. Исследуемый образец сы-
воротки (плазмы) крови смешивается с диагностической сальмонеллезной сывороткой. Используется такое разведение диагностической сыворотки, которое при ее титровании обеспечивает в аналитической зоне сигнал менее интенсивный, чем максимальный. Если в образце присутствует ЛПС-АГ сальмонелл серогрупп В и/или Б, он связывает часть АТ диагностической сыворотки. Проба вносится в отверстие для нанесения образца (на уровне маркировки «Б» оправки). В дальнейшем в им-мунохимической реакции участвует оставшаяся часть свободных АТ, количество которых тем больше, чем меньше ЛПС-АГ в образце.
Эти АТ реагируют с ЛПС из.....................,
конъюгированным с наночастицами гидрозоля ГЦФЖ, образуя окрашенный комплекс. Комплекс движется по мембране благодаря капиллярным силам и реагирует с иммобилизованным на мембране в аналитической зоне мембраны (на уровне маркировки «Т») ЛПС из....................., образуя окрашенную ли-
нию сине-голубого цвета. В отсутствие в исследуемом образце сыворотки (плазмы) крови ЛПС сальмонелл серогрупп В и/или Б в аналитической зоне мембраны на уровне маркировки «Т» образуется окрашенная линия сине-голубого цвета. Такая же окрашенная линия сине-голубого цвета образуется при анализе пробы ( контрольная проба) , не содержащей образец сыворотки (плазмы) крови пациента.
В образцах сывороток (плазм) крови, содержащих ЛПС-АГ сальмонелл серогрупп В и/или Б, в зависимости от его концентрации окрашенная линия сине-голубого цвета в аналитической зоне мембраны (на уровне маркировки «Т») не образуется или имеет существенно менее интенсивную окраску по сравнению с контрольной пробой, не содержащей образца сыворотки (плазмы) крови.
Несвязавшийся в аналитической зоне
избыток конъюгата ЛПС из..............
с наночастицами гидрозоля ГЦФЖ перемещается вверх по мембране и реагирует с нанесенными в область контрольной зоны (на уровне маркировки «С») АТ сальмонеллезной сыворотки (к............В
или.............. ) с образованием полосы
сине-голубого цвета вне зависимости от наличия в исследуемом образце ЛПС-АГ, что является внутренним контролем работоспо-
собности теста. Как было показано нами ранее [2], ЛПС из.............. (серогруп-
па В) и.............. (серогруппа D) выявляются с помощью разработанных нами тестов в концентрации > 200 нг/мл. Полное торможение иммунной реакции наблюдалось при концентрациях в анализируемой про-
бе ЛПС из.............. или..............
> 1,0 мкг/мл. ЛПС клеток возбудителей других кишечных инфекций, например
........... серотипа INABA 569D,.......
0128:B12 или.........при концентрациях
до 20 мкг/мл не дают перекрестных реакций с тестами для обнаружения сальмонелл ЛПС-АГ серогрупп В и/или D. Полученные данные свидетельствуют о специфичности разработанных тестов.
Для оценки возможности применения разработанных тест-систем для анализа клинических образцов были проведены испытания с использованием сывороток крови (плазмы) больных сальмонеллезом или туберкулезом, а также практически здоровых доноров и больных заболеваниями иной этиологии. Результаты анализа оценивали как визуально, так и с применением анализатора иммунохро-матограмм видеоцифрового АИВЦ-1, позволяющего определять интенсивность окрашивания полосы в аналитической зоне теста.
С использованием тест-системы «ТУБ-АТ-Иммунохром-Гидрозоль» проведен анализ сывороток крови 65 пациентов Серпуховского и Кулаковского противотуберкулезных диспансеров. Для учета результатов были приняты следующие обозначения: «отрицательный результат» — в аналитической зоне ничего не видно, что соответствует показаниям прибора АИВЦ-1 < 0,9 усл. ед.; «неопреде -ленный результат», соответствующий «серой зоне», — видна слабая полоса, что соответствует показаниям АИВЦ-1, равным 1,0—1,1 усл. ед.; «положительный результат» — видна четкая полоса сине-голубого цвета, что соответствует показаниям АИВЦ-1 > 1,2 усл. ед. Графически полученные результаты отображены на рис. 3(А). Положительный результат был зарегистрирован для 30 образцов сывороток крови, что составляет 46,15% (чувствительность). Из 6 больных, у которых наличие туберкулезной инфекции было подтверждено с помощью идентификации культуры возбуди-
теля, с использованием ИХА положительные результаты были получены для 4 пациентов. Из 18 больных с клинической картиной ин-фильтративного туберкулеза наличие противотуберкулезных АТ с применением разработанной тест-системы было подтверждено для 6 пациентов. Для 4 пациентов с данным диагнозом результат анализа соответствовал значениям «серой зоны», что может указывать на наличие АТ к АГ микобактерий в невысоких титрах и необходимость более подробного обследования данных пациентов.
Противотуберкулезные АТ выявлены в сыворотке крови 3 из 6 пациентов с диагнозом «диссеминированный туберкулез».
Кроме того, проведен анализ 29 образцов сывороток или плазмы крови доноров и 5 образцов сывороток крови пациентов Детской инфекционной клинической больницы № 5 г. Москвы (взрослые пациенты — родители или сотрудники медучреждения) . Отрицательные результаты получены для 23 из 34 образцов, что соответствует 67,65% (специфичность). Полученные данные представлены на рис. 3(Б).
Для сравнения возможностей обнаружения АТ к возбудителю туберкулеза с помощью двух разных иммунохроматографических тест-систем нами был проведен анализ сывороток крови пациентов противотуберкулезного диспансера (22 образца) и сывороток (плазмы) крови доноров (15 образцов) с использованием тест-системы «ТУБ-АТ-Иммунохром-Гидрозоль» на основе гидрозоля ГЦФЖ и набора реагентов «ТубАТ-Иммунохром» на основе золя золота. Полученные результаты представлены в табл. 2.
Было установлено, что для данной выборки образцов сывороток (плазм) крови тест-система «ТУБ -АТ-Иммунохром-Гидрозоль» характеризуется более высокой чувствительностью (15/22, 68,2%) и специфичностью (6/15, 40,0%) по сравнению с набором реагентов «ТубАТ-Иммунохром» (чувствительность — 8/22, 36,4%, специфичность — 3/15, 20,0%). Для анализа образцов с помощью тест-системы «ТУБ-АТ-Иммунохром-Гидрозоль» требуется меньший объем образца, результат получается быстрее. Визуально видно, что конъюгаты частиц ГЦФЖ перемещаются с током жидкости по нитроцеллюлозной
Рис. 3. Результаты определения противотуберкулезных АТ в сыворотке (плазме) крови человека с помощью тест-системы «ТУБ-АТ-Иммунохром-Гидрозоль».
А - сыворотки крови, полученные из противотуберкулезного диспансера; Б - сыворотки и плазмы крови доноров и больных иными заболеваниями; 1 - пороговые значения интенсивности аналитической зоны, зарегистрированные с помощью АИВЦ-1, выше которых результат определения противотуберкулезных АТ принимается за положительный; 2 - значения интенсивности аналитической зоны, зарегистрированные с помощью АИВЦ-1, ниже которых результат определения противотуберкулезных АТ
принимается за отрицательный
мембране быстрее, чем конъюгаты золя золо- 59,71%, а специфичность — от 53,02 до та. Последний факт может быть связан с тем, 98,66% [11]. В цитируемой работе были ис-
что масса наночастиц гидрозоля ГЦФЖ при сравнимых средних размерах (20—25 нм) намного меньше массы частиц золота. Удобство наблюдения ярко окрашенных контрастных линий синего цвета на белой мембране для тестов на основе ГЦФЖ также является их преимуществом. Представленные данные свидетельствуют о том, что не имеющая аналогов иммунохроматографическая тест-система «ТУБ-АТ-Иммунохром-Гидрозоль» может быть использована для целей лабораторной диагностики как дополняющая другие методы диагностики туберкулезной инфекции.
Проведенный под эгидой ВОЗ анализ выпускаемых в различных станах мира 19 коммерческих иммунохроматографиче-ских тест-систем для выявления противотуберкулезных АТ показал, что их чувствительность находится в диапазоне от 0,97 до
пользованы 355 образцов сывороток крови, полученных из 8 географических точек мира. Результаты, полученные с использованием разработанной нами тест-системы «ТУБ-АТ-Иммунохром-Гидрозоль», по чувствительно -сти и специфичности соответствуют данным других лабораторий, в которых применяли тест-системы на основе иммунохромато-графии. Традиционные тесты, используемые для серодиагностики туберкулеза и основанные на реакциях гемагглютинации, торможении гемагглютинации, фиксации комплемента, и некоторые другие достаточно просты в постановке, недороги, имеют относительно небольшое время проведения анализа (от 1 часа до 1 суток), нуждаются в минимуме оборудования. Однако они в настоящее время морально устарели, к тому же эффективная диагностика туберкулеза с их
Сравнительные характеристики иммунохроматографических тест-систем для выявления противотуберкулезных АТ, построенных на основе наночастиц золя золота или гидрозолей ГЦФЖ
Характеристика Название тест-системы
«ТУБ-АТ-Иммунохром-Гидрозоль» «ТубАТ-Иммунохром»
Химическая природа и средние размеры наночастиц, нм Гидрозоль ГЦФЖ, 20,0* Золь золота, 25,0
Чувствительность, % 68,2 36,4
Специфичность, % 40,0 20,0
Время анализа, мин 10 20
Объем пробы, мкл 5 20
Примечание: * размеры частиц определяли методом атомно-силовой микроскопии [2].
помощью возможна только при комбинированном совместном использовании сразу нескольких тестов. Методы иммуноферментно-го и радиоиммунного анализа трудоемки, их постановка занимает много времени. Тест-система «ТУБ - АТ - Иммунохром - Гидрозоль» содержит все необходимые для проведения анализа компоненты, включая встроенный в тест внутренний контроль, подтверждающий работоспособность теста и правильность проведения анализа. Дополнительно требуются только дозатор и исследуемый образец. Использование для оценки результатов анализа приборной регистрации повышает точность проведения анализа и выявления «серой зоны». Благодаря простоте использования и быстроте получения ответа ( 10 мин) разработанная тест-система пригодна для проведения массовых скрининговых обследований. Следует подчеркнуть, что определение АТ к возбудителю туберкулеза в сыворотке крови позволяет сформировать лишь должную медицинскую настороженность клинициста в отношении туберкулезной инфекции, оценки напряженности поствакцинального иммунитета, но не может использоваться в качестве единственного обоснования для подтверждения диагноза.
Для оценки диагностических возможностей тест-системы «САЛЬМОНЕЛЛА-АГ-(В+D) -Иммунохром-Гидрозоль» проведен анализ 176 образцов сывороток крови пациентов Детской инфекционной клинической больницы № 5 г. Москвы. Пациентами были дети в возрасте от 1,5 месяцев до 14 лет.
На рис. 4 показаны фотографии тестов после проведения анализа сывороток крови, содержащих ЛПС-АГ (№ 157, 158, 126, 143): в аналитической зоне полоса сине-голубого цвета отсутствует или имеет существенно более низкую по сравнению с контрольной пробой окраску.
В группе пациентов с установленным диагнозом «сальмонеллез» ( 10 образцов, включая пробы с установленной серогруппой возбудителя В, D, С и диагнозом «клеточно-серологический сальмонеллез») сальмонеллез-ный АГ выявлен у 2 (20%) больных с диагнозом «клинико-серологический сальмонел-лез». В 4 образцах сывороток крови пациентов этой группы выявлены АТ к сальмонеллам се-
рогрупп В или D, что может затруднять определение сальмонеллезных АГ за счет образования иммунных комплексов. В сыворотке крови пациентов (93 образца) из группы больных с клинической картиной, наблюдаемой при развитии различных кишечных заболеваний, в том числе сальмонеллезной инфекции (гастроэнтериты, энтероколиты, острый инфекционный гастроэнтероколит и т.д.), ЛПС-АГ сальмонелл серогрупп В и/или D выявлен в 12 (12,9%) пробах. Для всех этих образцов данные реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и посевов отсутствовали. Таким образом, с помощью разработанной тест-системы удалось повысить выявляемость сальмонеллеза у пациентов с подозрением на сальмонеллезную инфекцию. В группе больных со смешанной инфекцией (18 образцов) сальмонеллезный АГ обнаружен в 2 (11,1%) пробах. В сыворотках крови пациентов с отсутствием первичного диагно-
Рис. 4. Фотографии тестов после внесения образцов сывороток крови пациентов при анализе на наличие ЛПС-АГ сальмонелл серогрупп В и/или D.
Вверху и внизу: слева направо - контроль (не содержит сыворотку крови), далее - в отверстие для нанесения образца наносили пробы, содержавшие сыворотку крови пациентов
за (39 образцов) сальмонеллезный АГ обнаружен в пробах 3 (7,69%) больные. Надо отметить, что наиболее четко удавалось обнаружить ЛПС-АГ сальмонелл серогрупп В и/или D в пробах, взятых на ранних стадиях заболевания, что согласуется с полученными нами ранее данными [4]. Например, анализ пробы, полученной от пациента с первичным диагнозом «энтероколит» в первый день после появления клинических признаков сальмонеллеза, четко выявил присутствие в сыворотке крови ЛПС-АГ сальмонелл серогрупп В и/или D. Эти данные подтвердили наличие у пациента саль-монеллезной инфекции.
Ни в одной пробе сывороток крови пациентов с установленным диагнозом инфекционного заболевания, отличного от сальмонеллеза (16 образцов — дизентерия, иерси-ниоз, парагрипп, грипп, ротавирусная инфекция, ОРЗ, ОРВИ и др. — контрольная группа), специфический АГ сальмонелл серогрупп В и/или D не обнаружен, что свидетельствует о высокой специфичности разработанной тест-системы.
Диагностика сальмонеллезов представляет определенные трудности вследствие разнообразия этиологии этих заболеваний и вариабельности клинических проявлений. Основным методом лабораторной диагностики сальмонеллеза остается бактериологический, проведение которого занимает несколько суток. Эффективность бактериологического анализа является низкой, так как зависит от качества диагностических сред, инфект-дозы возбудителя, сроков обследования, предшествующей антибактериальной терапии. Большое значение в ранней диагностике сальмонеллеза принадлежит выявлению растворимых АГ, поскольку их появление в крови наблюдается в первые часы заболевания, а специфические АТ появляются на второй неделе болезни.
Известны коммерческие иммунохро-матографические тесты (SMARТ-II, «New Horizons Diagnostic, Inc.», США и «Singlepath Salmonella Test», «Merck», Германия), используемые при анализе образцов внешней среды и продуктов питания для выявления целые клеток сальмонелл после предварительного обогащения образца. Аналогичными свой-
ствами обладает отечественный иммунохрома-тографический тест для обнаружения сальмонелл различные серогрупп, который позволяет выявлять от 1*105 до 1х107 м.к./мл сальмонелл в зависимости от типа серогруппы [3].
Широко используемых в практике быстрых методов обнаружения растворимых АГ сальмонелл в биологических пробах нет. Методы ИХА для выявления поверхностных О-АГ и АТ сальмонелл отсутствуют.
Представленные в работе результаты свидетельствуют о том, что с помощью тест-системы «САЛЬМОНЕЛЛА-АГ- (В+Б) -Иммунохром-Гидрозоль» можно за короткое время ( 5 мин) обнаруживать в сыворотке крови поверхностный О-АГ. Это повышает выявляемость сальмонеллеза в детском инфекционном стационаре. Для анализа требуется всего 3 мкл сыворотки или плазмы крови, что особенно важно при выявлении саль-монеллеза у детей младшего возраста.
Заключение
Впервые созданы иммунохроматогра-фические тест-системы с использованием в качестве дисперсной фазы наночастиц гидрозолей ГЦФЖ, позволяющие за короткий срок (5—10 мин) провести диагностику образцов сывороток ( плазм) крови пациентов на наличие противотуберкулезных АТ или соматического О-АГ сальмонелл серогрупп В и/или Б.
Простота постановки реакции, время анализа (5—10 мин), небольшой объем анализируемого образца сыворотки (плазмы) крови (3—5 мкл), специфичность свидетельствуют о перспективности тест-систем «ТУБ-АТ-Иммунохром-Гидрозоль» и «САЛЬМОНЕЛЛА-АГ-(В+Б)-Иммунохром-Гидрозоль» для клинического применения. По данным наших исследований, тест-системы сохраняют свои свойства в течение 1 года хранения при условиях, указанных в инструкции по применению.
Финансирование настоящей работы проводилось в рамках федеральной целевой научно-технической программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014)».
Литература
1. Орлова О.Ю., Мешандин А.Г. Сопоставление различных видов твердых фаз при синтезе гидрозольных иммунохимических диагностикумов // Вятский медицинский вестник. 2002. № 3(12). С. 61-65.
2. Скопинская С.Н., Ярков С.П., Зло-бин В.Н., Валиев Х.Х. Использование гидрозолей гексацианферрата железа для создания диагностических иммунохрома-тографических тест-систем // Вестник РАМН. 2012. № 3. С. 80-85.
3. Шиленко И.В., Ярков С.П., Кононен-ко А. Б. и др. Отечественный иммуно-хроматографический тест для выявления сальмонелл различных / Веткорм. 2011. № 2. С. 12-13.
4. Ярков С.П., Скопинская С.Н., Милютина Л.Н. Липосомальный иммуноанализ — новый метод диагностики сальмонелле -за // Иммунология. 1997. № 4. С. 59-62.
5. Ярков С.П., Скопинская С.Н., Шилен-ко И.В., Злобин В.Н. Люминесцентный иммунохроматографический анализ антигенов микроорганизмов // Вестник РАМН. 2009. № 3. С. 20-26.
6. Ярков С.П., Шиленко И.В. Применение иммунохроматографии для выявления патогенов и диагностики заболеваний // Современные методы индикации патогенов и токсинов в объектах окружающей среды и диагностики социально значимых инфекционных заболеваний для обеспечения химической и биологической безопасности / Под ред. В.Н. Злобина. М., 2010. С. 57-118.
7. Ahn-Yoon S., DeCory T.R., Baeumner A.J., Durst R.A. Ganglioside-liposome immunoassay for the ultresensitive detection of cholera toxin // Analytical Chemistry. 2003. Vol. 75. P. 2256-2261.
8. Chan W.C.W., Nie S. Quantum dots: a primer // Applied Spectroscopy. 2002. Vol. 56. P. 16A.
9. Chandler J., Gurmin T., Robinson N. The place of gold in rapid tests // IVD Technology. 2000. Vol. 6. P. 37-49.
10. Karyakin A.A., Puganova I.A. et al. Prussian Blue based nanoelectrode arrays for H2O2 detection // Analytical Chemistry. 2004. Vol. 76. P. 474-478.
11. Laboratory-based evaluation of 19 commercially available rapid diagnostic tests for tuberculosis. Copyright© World Healht Organization on behalf of Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases, 2008.
12. La Borde R.T., O'Farell B. Paramagnetic particles detection in lateral flow assays // IVD Technology. 2002. April issue: 36.
13. Lateral flow immunoassay / Ed. by R.C. Wong, H.Y. Tse. N.-Y.: Humana Press a part of Springer Science & Business Media, 2009.
14. Ling S. Study on immunosensor based on gold nanoparticles/chitosan and MnO2 nanoparticles composite membrane. Prussian blue modified gold electrode // Bioprocess and Biosystems Engineering. 2009. Vol. 32(3). P. 407-414.
15. Niedbala R., Feindt H., Kardos K. Detection of analytes by immunoassay using up-converting phosphors technology // Analytical Biochemistry. 2001. Vol. 29. P. 22-30.
16. Van Amerongen A., Wiechers J.H., Brend-sen L.B. Colloid carbon particles of a new label for rapid immunochemical test methods: quantative computer image analyses of results // Journal of Biotechnology. 1993. Vol. 30(2). P. 185-195.
Контакты:
Скопинская Светлана Николаевна,
ведущий научный сотрудник ФГУП «ГосНИИБП»,
кандидат биологических наук.
Тел. раб.: 8-495-491-86-83, 8-495-490-69-82;
тел. моб.: 8-903-552-19-77.
E-mail: [email protected]
