CC BY
18
УДК 543.51
Д.М. Автономов12, И.А. Агрон1,3, А.С Кононихин4,2, Е.Н. Николаев"4,2
1 Московский физико-технический институт (государственный университет)
2 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
3 Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН
4 Институт энергетических проблем химической физики РАН
Создание базы данных точных массово-временных меток для качественного и количественного подхода в исследовании протеома мочи человека с использованием изотопного мечения
Актуальной задачей современной биологии и медицины (их физических методов исследования) является разработка методик быстрого и точного анализа человеческих жидкостей, в том числе их белкового состава. Уже были исследованы такие жидкости, как кровь, моча, слеза, на предмет белкового состава. Основные сейчас методики довольно медленны и плохо реализуются в плане высокопроизводительного количественного анализа. Поэтому мы предлагаем метод для быстрого и высокопроизводительного анализа, основанный на идеологии точной массово-временной метки и изотопного мечения.
Ключевые слова: протеом, человеческие жидкости, белковый состав, пептиды, геномная база, масс-спектрометр ионно-циклотронного резонанса, массово-временная метка, изотопное мечение.
I. Современные методики идентификации белков и пептидов
Сейчас наиболее эффективным способом идентификации белков является поиск по геномной базе данных с использованием спектров фрагментации (тандемной масс-спектрометрии) (рис. 1).
Клетка
Рис. 1. Современные стандартные процедуры идентификации белков
Наиболее распространенными поисковыми движками являются Mascot (MatrixScience (Darryl Pappin)), Sequest
(Jimmy Eng и John Yates), X! Tandem (проект — The Global Proteome Machine) и OMSSA (Национальный Институт Здоровья, США).
Все поисковые машины в общем рассчитаны под стандартную процедуру эксперимента: гидролиз белковой фракции с помощью сайт-специфичного фермента, обычно трипсина, разделение на хроматографической колонке с обращенной фазой (смывание пептидов по их гидрофобности в зависимости от концентрации ацетонитрила), масс-спектрометрический анализ с селективным измерением спектров фрагментации ионов пептидов [1, 2].
II. Поисковая машина Mascot
Идеология идентификации в поисковой машине Mascot основана на алгоритме MOWSE (MOlecular Weight SEarch), разработанном Дэррилом Паппиным (1993) [3].
Изначально алгоритм был рассчитан на так называемый поиск по массовым «отпечаткам пальцев» пептидов.
Первым этапом поиска с использованием алгоритма Mowse является сравнение вычисленных масс пептидов для всех
записей последовательностей в базе данных с набором экспериментальных данных. Каждая вычисленная величина, которая совпадает с заданной погрешностью с экспериментальной величиной, считается как совпавшая. Молекулярная масса ин-тактного белка может быть использована как пре-фильтр.
Вместо простого счета числа совпавших пептидов Mowse-алгоритм использует эмпирически определённые факторы, чтобы приписывать статистический вес каждому совпавшему пептиду. Матрица весовых факторов рассчитывается в тот момент, когда происходит установка базы данных, следующим образом.
Матрица частотных факторов, Г, создаётся, чтобы каждая строка соответствовала интервалу в 100 Да для масс пептидов, а каждая колонка — интервал в 10 кДа для масс интактных белков. Поскольку каждая запись последовательности в базе данных обрабатывается, то соответствующий матричный элемент добавляется так, чтобы собрать статистику распределения масс пептидов как функцию масс белков. Элементы Г затем нормализуются посредством деления элементов каждого «10 кДа» — столбца на наибольшую величину в этом столбце, чтобы рассчитать Mowse-матрицу весов М в соответствии с формулой
т.
\fi,j I
j \ max incolumn(j)
После сравнения экспериментальных масс с рассчитанными массами по базе данных скор (будем так называть некую величину уровня достоверности, Score на англ. счет) для каждого элемента рассчитывается в соответствии с формулой
Score
50 000
Mprot * Пn m-
i,j
где Мргоі — молекулярная масса для каждого совпавшего белка, а П — произведение, которое рассчитывается из Mowse-матрицы весов М для каждого совпадения экспериментальных данных и масс пептидов, рассчитанных из записей в геномной базе данных.
В итоге скор есть абсолютная величина, которая соответствует тому, насколько
наблюдаемый пептид — случайная величина.
Реализован поиск по «Peptide Mass Fingerprint» был раньше, чем поиск с использованием результатов тандемной масс-спектрометрии (MS/MS-поиск), но схема для «Peptide Mass Fingerprint» была позже также отлично применена и для MS/MS-поиска: только теперь роль белка в формуле для Score выполняет пептид, а фрагмент — роль пептида. Сумма же ско-ров пептидов суммируется, откуда получается суммарный скор для белка.
III. Поисковая машина Sequest
В случае же с программой Sequest поиск осуществляется иным способом [4].
Поисковая машина идентифицирует каждый тандемный масс-спектр отдельно.
Поисковой движок создаёт лист всех пептидов, которые могли бы получиться теоретически при гидролизе с помощью данного фермента. Далее происходит поиск с учётом заранее заданной точности измерения масс по этому листу совпадений с экспериментальными массами ин-тактных пептидов (они известны из масс-спектра), в результате которого мы получаем новый лист пептидов-кандидатов. Для каждого кандидата строится теоретический спектр фрагментации, который потом опять же сверяется с экспериментальными данными (с MS/MS-спектрами). Результатом является значение взаимно корреляционной функции.
Среди плюсов методов, использующих тандемную масс-спектрометрию (MS/MS), можно указать:
1) высокую достоверность идентификации пептидов,
2) возможность deNovo [1] сиквенирова-ния пептидов.
Среди недостатков таких подходов стоит указать:
1) из-за малого количества образца может быть недостаточно ионов для проведения MS/MS,
2) не всегда могут получаться хорошие спектры фрагментации,
3) дополнительное время, затрачиваемое на снятие спектров фрагментации,
4) увеличенное время хроматографии.
IV. Идеология точной массово-временной метки
В Pacific Nortwest Naional Laboratory (Richland, WA, US) группой Дика Смита была предложена методика точной массово-временной метки (AMT-tags) для идентификации белков и пептидов [5]. Преимущества данного метода заключаются в отказе от MS/MS, для проведения которого нужно больше образца, времени, а главное, что не всегда фрагментация в MS/MS хорошо получается и в использовании иного параметра, чем масса, не связанного с ней напрямую: времени удержания на хроматографической колонке с гидрофобно-обращенной фазой.
В обычном подходе при использовании тандемной масс-спектрометрии осуществляется поиск по геномной или протеомной базе данных, содержащей последовательности белков, с учётом гидролизующего фермента (то есть сайтов гидролиза) и способа фрагментации в масс-спектрометре; в случае же точных массово-временных меток предлагается использовать только точную массу пептида (продукта гидролиза) и времени его элюции с хроматографической колонки (точнее говоря, концентрации растворителя, обычно ацетонитрила). Во-первых, экономится образец и время, а во-вторых, этот метод с той же процедурой Bottom-Up становится более информативным, когда хроматограф перестает быть просто разделителем фракции пептидов.
В простейшем случае база данных состоит из таблицы, содержащей точную массу, аминокислотную последовательность пептида и время выхода (время начала и конца хроматографического пика). Хотя в реальной ситуации это несколько сложнее, поскольку этой информации мало, исследователю или пользователю БД нужно знать, к какому белку относится пептид и какая биологическая функция у белка, например. Конечно, все это могло быть в одной таблице, но управлять ею эффективно было бы невозможно при большом количестве пептидов в ней. Вследствие этого возникает проблема создания эффективной базы данных.
V. Количественный подход
В большинстве случаев сейчас масс-спектрометрия в протеомике является качественным методом анализа, особенно, когда речь идёт о такой высокопроизводительной системе, как сочетание жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Принципиальным расширением такой системы анализа будет внедрение количественных методик [6]. Сейчас существует несколько вариаций, все они основаны на изотопном мечении: либо изотопами C12/C13 уг-леродами, либо O16/О18, либо N14/N15. Основными являются ICAT (cICAT), iTRAQ, ICROS, гуанидирование и ферментативное C-концевое мечение.
1. ICAT (cICAT) — мечение происходит сайт-специфично либо протонирован-ными/дейтерированными метками, либо метками на основе C12/C13 углеродов.
2. ICROS — две пробы метятся по ци-стеину двумя реагентами: N-этилйодацета-мид и N-DS-этилйодацетамид.
3. iTRAQ — метка (4 разновидности, состоит из рапортирующей и балансировочной группировок, которые в сумме дают одинаковую массу) связывается с пептидом, и при MS-анализе все пики совпадают, но при MS/MS происходит отделение пиков на масс-спектрах друг от друга, поскольку рапортирующие группировки все разные. То есть этот метод применим только вкупе с использованием тандемной масс-спектрометрии.
4. Гуандирование — это такой метод ме-чения, когда один из двух образцов подвергается модификации, модифицируется лизин в гомоаргинин.
5. Ферментативное C-концевое мечение О16/О18 кислородами в составе воды — при трипсинолизе в силу двух реакций (энзиматической и кислородобменной в карбоксильной группе) присоединяется один или два кислорода, в одном случае изотоп О16, во втором — О18.
Каждый из методов имеет свои плюсы и недостатки, среди недостатков первых двух стоит особо отметить их специфичность по цистеину (или метионину) и проблемы ко-элюции изначально одинаковых пептидов (по-разному меченных), четвертый метод также специфичен, поскольку зависит от наличия лизина на C-кон-
це. Третий способ вообще может использоваться только в тандемной масс-спектро-метрии. У пятого способа недостаток заключается в вариабельности включения одного или двух «тяжёлых» кислородов и малой разности масс, которая может перекрываться изотопными распределениями.
В нашем случае наиболее применим пятый способ мечения, поскольку:
1) он не зависит от аминокислотного состава, как первый, второй и четвёртый способы;
2) никак не связан с MS/MS-анализом;
3) при использовании ИЦР масс-спек-трометрии с преобразованием Фурье мы вполне способны различить пики изотопного распределения самих пептидов (C12/С13 углероды) и разницы в изотопах воды, которая использовалась при трипси-нолизе.
Этот метод лишен проблемы неодновременной ко-элюции пептидов, что есть бич, например, двух первых способов.
VI. База точных массово-временных меток
За основу была взята система управления базами данных (СУБД) MySQL 5.0.45 с открытым кодом и свободно распространяемая под лицензией GNU GPL. Структура созданной базы (рис. 2) позволяет поддерживать одновременно несколько проектов, выявлять схожесть и различия экспериментов и, конечно же, производить поиск по точной массово-временной метке.
Í Результат,
( поиска в V Mascot
грузчик.
Проекты
Ж
Эксперименты
Результаты эксперимента Без MS/MS
/ \
Возможные идентификации Описания масс-спектров
Отбор пептидов по условиям Нормализация времён выхода
Идентифицированные
пептиды
Рис. 2. Блок-схема внутреннего устройства базы данных и стандартных процедур заполнения и поиска
Исходными данными являются файлы результатов поиска в Mascot. Загрузив их в базу при помощи специальной
программы-загрузчика, можно формировать отчёты об идентифицированных в экспериментах белках по разным критериям. Для использования в подходе точной массово-временной метки нам нужна база данных с высокой достоверностью идентифицированных пептидов — ведь любая ошибка приведёт к множественным неверным идентификациям в будущем. Поэтому лишь небольшая часть из всех идентифицированных пептидов попадает в итоговую базу, пептиды должны удовлетворять следующим двум критериям, чтобы пройти отбор: достоверность идентификации пептида больше 99,5% (пептидам присваивается рейтинг, который и определяет достоверность), в каждый идентифицированный белок должно входить минимум 2 пептида. На данный момент мы используем более строгий критерий: сначала каждому белку приписываются все из найденных пептидов, которые он мог содержать, но далее пептиды остаются только в белках, набравших наибольший суммарный пептидный рейтинг. Можно ещё дальше ужесточить критерии и потребовать уникальности пептидов, в этом случае допустима идентификация белка лишь по одному пептиду. Если более одного белка содержат одинаковый набор пептидов, то на данный момент в базу будут занесены все пептиды, но в ближайшем будущем будет добавлена проверка гомологичности идентифицированных белков. Если они не являются схожими, то подобные пептиды не могут считаться репрезентативными, следовательно, не должны заноситься в базу. Делаться это будет методом попарного выравнивания белковых последовательностей, например, с помощью пакетов clustalW, BLASTp, FASTA.
При заполнении базы записываются точно измеренное отношение массы к заряду, масса, полученная после деконволюции, нормализованные времена начала и конца выхода из колонки (рис. 2). Нормализация может производиться несколькими методами:
1) с использованием внешних калибран-тов (в каждый исследуемый образец вводятся стандартные пептиды, смывающиеся с колонки в начале, середине и конце эксперимента, например, пептиды цитохрома C);
2) с использованием внутренних ка-либрантов (например, пептиды гидролизующего фермента — в нашем случае трипсина);
3) нормализация по теоретически рассчитанному времени.
Важно не перегрузить колонку во время эксперимента — это может сильно уширить хроматографичесике пики, что в свою очередь приведёт к потере уникальности массово-временной метки.
После заполнения базы референсны-ми данными можно приступать к идентификации, используя массово-временные метки. Проведя эксперимент без использования тандемной масс-спектрометрии, полученные результаты обрабатываются программой Decon2LS (Pacific-Northwest National Laboratory) для проведения деконволюции и деизотопирования (может использоваться также и любая другая подобная программа). Далее нормализуются времена выхода обнаруженных ионов, и эти данные сравниваются с записями в базе данных массово-временных меток.
VII. Эксперименты, оборудование и пробоподготовка
Эксперименты проводились на масс-спектрометре ионно-циклотронного резонанса, совмещенного с линейной ионной ловушкой Thermo LTQ-FT и жидкостном хроматографе Agilent 1100. Для хроматографии использовались самодельные колонки внутренним диаметром 75 мкм, обращенная фаза Reprosil-Pur C18 3 мкм с порами 100 А.
Для тестовых экспериментов были собраны образцы мочи 10 человек, из которых выделялась белковая фракция и трип-синолизовалась в растворе без предварительного разделения белков при помощи гель-электрофореза.
Полученная пептидная смесь анализировалась в хромато-масс-спектрометриче-ских экспериментах. Для хроматографии в качестве сольвентов использовались вода и ацетонитрил с линейным градиентом от 10% содержания ацетонитрила до 50% в электрораспылении. При масс-анализе измерялись масс-спектры высокой точности и разрешения в диапазоне 300-2000 m/z в ячейке ИЦР, по ним определялись массы
родительских ионов и их зарядовые состояния. Для тех ионов, у которых удалось определить зарядовое состояние, измерялись спектры столкновительной диссоциации (CID) в линейной ионной ловушке.
VIII. Результаты и обсуждение
В проведённом эксперименте была отработана новая для практики цепочка по быстрой идентификации пептидов с возможным количественным анализом.
Во-первых, удалось наполнить базу данных экспериментальных величин, которые соответствуют массам и временам выхода с колонки для пептидов из белков протеома мочи, которую уже можно использовать для скрининга пациента (присутствует или нет данный белок). В базе содержится порядка 500 пептидов из 100 белков (ранее в медицине считалось, что белок в моче — плохой показатель), наличие или отсутствие (возможно и концентрация) которых потенциально может быть маркером заболеваний. Во-вторых, данная база разработана с прицелом под количественный анализ, схема которого уже предложена нами:
1) сбор мочи (с возможным ингибированием протеаз), выделение белковой фракции,
2) трипсинолиз обоих образцов («пациента» и контроля) и смешивание,
3) хроматографическое разделение на колонке, MS-анализ (без MS/MS),
4) поиск по базе данных точных массово-временных меток и одновременное сравнение интенсивностей пиков (приписанных пептиду из БД), отличающихся на
2 (или 4) Да.
На четвертом этапе пептиды, трипсинолизованные в обычной воде и в воде H2O18, будут появляться одновременно на спектре хроматограммы (рис. 3): пики, которые будут отличаться на 2 Да, будут выделяться, как первый вариант, программным обеспечением от Finnigan (Quan Browser) или open source ПО от BioGrid Illinois, но в тот же момент все пики будут искаться по БД. В конечном счете нас будет интересовать относительные интенсивности двух пиков, когда «более лёгкий» совпал по массе и времени выхода со значением в БД, но и ему соответствует пик, смещённый «вправо» на разницу между двумя изотопами кислорода.
Рис. 3. Хроматограмма. В базу записываются времена начала и конца выхода
Как второй вариант, будут производиться два одновременных поиска по одной и той же БД, но со сдвигом примерно на 2 Да (разницу между кислородами O 6 и O 8) во втором поиске масс всех пептидов. Одновременное совпадение номера спектра, внутреннего номера пептида в обоих поисках будет гарантировать, что пептиды одинаковые, ко-элюировали одновременно.
В скором времени будут представлены результаты по количественному скринингу по нашей БД точных массово-временных меток с применением разработанной схемы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bogdanov B.C., Smith R.D. Proteomics by FTICR mass spectrometry: Top down and bottom up // Mass Spectrometry Reviews. — 2004. — V. 24, N. 2. — P. 168-200.
2. Kelleher N.L., Hong Y.L., Valaskovic G.A., Aaserud D.J., Fridriksson E.K., McLafferty F.W. Top Down versus Bottom Up Protein Characterization by Tandem High-
Resolution Mass Spectrometry // J. Am. Chem. Soc. — 1999. —
V. 10.1021/ja973655h, N. 121. —P. 806-812.
3. Pappin D.J., Hojrup P.N., Bleasby A.J. Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting // Curr Biol. — 1993. — N. 3(6). — 327-332.
4. Eng J.K., McCormack A.L., Yates J.R. An Approach to Correlate Tandem Mass Spectral Data of Peptides with Amino Acid Sequences in a Protein Database // J. Am. Soc. Mass. Spectrom. — 1994. — V. 5. — P. 976-989.
5. Pasa-Toliж L.F., Masselon C.E., Barry R.C., Shen Y.W., Smith R.D. Proteomic analyses using an accurate mass and time tag strategy // Biotechniques. -2004. — V. 37(4), N. 621-4. — P. 626-636.
6. Mirgorodskaya E.L., Wanker E.D.,
Otto A.E., Lehrach H.H., Gobom J.O. Method for Qualitative Comparisons of Protein Mixtures Based on Enzyme-Catalyzed Stable-Isotope Incorporation // J. Proteome Res. — 2005. —
V. 10.1021/pr050219i, N. 4 (6).
P. 2109-2116.
Поступила в редакцию 22.01.2008.
