CC BY
64DOI: 10.24411/2071-5315-2018-12014
Современные возможности исследования клеточных и молекулярных механизмов болезни Паркинсона
В.В. Симонова
ФГБНУ "Научный центр неврологии"(Москва)
Болезнь Паркинсона (БП) является классическим нейродегенеративным заболеванием, которое по своему молекулярному патогенезу принято относить к группе конформаци-онных болезней мозга [1]. Известно, что эта патология сопровождается нарушением полимеризации и фолдинга (процесса спонтанного сворачивания полипептидной цепи в уникальную нативную пространственную структуру) белка а-синуклеина — основного компонента телец Леви. Между собственно гибелью нигральных дофаминергических нейронов и сроками манифестации БП проходит определенный период времени. Благодаря пластичности мозга клиническая картина становится явной только после гибели 50% клеток черной субстанции и снижения уровня дофамина в полосатом теле на 80—85%.
В основном БП носит спорадический характер. В то же время около 10% случаев заболевания определяются мутациями двух десятков "больших" генов паркинсонизма [2—5]. Из них от 4 до 16% выявляемых мутаций отвечают за формы БП с началом до 40—45 лет: подавляющее большинство таких ранних случаев связаны с изменениями в генах РЛЯК2 (М1М602544), РШК1 (М1М608309) и Б1-1 (М1М602533) [4]. Для наследственно-семейных форм БП характерны аутосомно-доми-нантный и аутосомно-рецессивный типы передачи болезни. По аутосомно-доминант-ному типу наследуются формы, обусловленные мутациями генов РЛЯК8/ЬЯЯК2 (обогащенная лейциновыми повторами киназа), РЛРКИ^ЫСЛ (а-синуклеин), РЛШ5/иСИЬ1, РЛШ11/010УР2, РЛВ£13/Ош1/тт2. Аутосом-но-рецессивные варианты первичного пар-
кинсонизма связаны с генами PЛRK2/паркин, PARK6/PINK1, PARK7/DJ-1, PARK9/A ТР13Л2 и др. Для указанных локусов характерны не только точковые мутации, но и изменения "дозы" — делеции, дупликации, трипликации и т.д.; описаны также более крупные хромосомные перестройки, ассоциированные с риском развития БП [6, 7].
Моделирование БП с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
Учитывая вышеизложенную гетерогенную основу БП и отсутствие радикальных способов лечения, необходимым является создание адекватных моделей для изучения молекулярных и клеточных механизмов заболевания, в том числе моделей in vitro. Долгое время такие исследования были невозможны из-за труд-нодоступности биоматериала. В настоящее время данный барьер преодолен благодаря технологии клеточного репрограммирования, при этом универсальным и доступным материалом для ученых стали фибробласты. Клетки, полученные от пациентов в виде биоптата кожи, культивируются в СО2-инку-баторе при 37°С. Дальнейшая работа с этим материалом включает превращение фибро-бластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), которые, подобно эмбриональным стволовым клеткам, обладают практически неограниченным пролифера-тивным потенциалом. Далее осуществляется направленная дифференцировка ИПСК до стадии нейронов. Соматические клетки паци-
Дофаминергические нейроны в культуре нейрональных клеток, полученных из ИПСК пациента с БП (синий цвет — окраска на тирозингидроксилазу).
ентов с различными формами БП могут быть репрограммированы в ИПСК с помощью лен-тивирусных векторов и вектора на основе РНК-содержащего вируса Сендай — эти рекомбинантные конструкции помогают ввести в клетку особые пептидные факторы репрограммирования (Ос4, 8ох2, КШ, с-Мус и др.). Таким путем в нашей лаборатории совместно с Институтом молекулярной генетики РАН (Москва) были получены ИПСК с мутациями генов РККК2, РАЯК2, ОВЛ, а также линии ИПСК от пациентов со спорадической формой БП. Проведенные эксперименты позволили создать уникальную "персонифицированную" клеточную платформу для изучения патогенеза конкретных форм БП [8]. Получение таким путем клеточных культур, обогащенных дофаминергическими нейронами, подтверждается экспрессией маркера этих нейронов — фермента тирозингидроксилазы и транспортера дофамина (рисунок).
Ключевой мишенью патологического процесса при БП являются митохондрии. Так, киназа LRRK2 (продукт одного из наиболее часто мутирующих при БП генов) представляет собой мультидоменный фермент, около 10% которого ассоциированы с внешней мембраной митохондрий. Мутации часто расположены в доменах, отвечающих за киназ-
ную (фосфорилирующую) и ГТФазную (гид-ролизующую) активность LRRK2 [9]. В норме киназный домен LRRK2 фосфорилирует цитоплазматический белок Drp1, активируя данный протеин. Последний, взаимодействуя с сайтами узнавания на внешней мембране митохондрии, способствует фрагментации органеллы и высвобождению при этом активных форм кислорода и факторов апоптоза [10, 11]. Фрагментирование поврежденной митохондрии предотвращает ее слияние с нормально функционирующей органеллой. Исследователи обнаружили в нейронах, несущих мутацию G2019S гена РККК2, наличие малых по размеру митохондрий, число которых превышает таковое в норме, что указывает на повышенную фрагментацию митохондрий [12]. Результатом повреждения митохондрий становится активация балка РШК1, что ведет к фосфорилированию белка паркина (продукта гена РАЯК2) и влияет на процессы аутофа-гии в нейронах. Мутации как в гене РШК1, так и в гене РАЯК2 ассоциированы с БП [13, 14]. Исследователи получили ИПСК от больных с мутацией в гене РШК1 и после диффе-ренцировки их в дофаминергические нейроны выявили нарушение рекрутирования белка к митохондриальной мембране; введение в эти клетки ретровируса с нормальным геном РШК1 восстановило взаимодействие паркина с митохондриями [15].
На другой клеточной модели БП были получены дофаминергические нейроны, дифференцированные из ИПСК от пациентов с LRRK2-ассоциированной формой БП, при этом были обнаружены увеличение сродства а-синуклеина с лизосомальной мембраной и склонность к избыточному формированию телец Леви [16].
В последнее время активно изучается связь мутаций гена Р-глюкоцереброзидазы (ОВЛ) с БП [17]. Повреждения данного гена в гомозиготном состоянии приводят к лизосомной болезни накопления — болезни Гоше (при которой риск развития паркинсонизма повышен в 20 раз), тогда как при носительстве гетерозиготных мутаций ОВЛ риск заболеть
БП увеличен в 5 раз. Глюкоцереброзиды — вещества липидной природы, встроенные в клеточную мембрану, с которой тесно ассоциирован а-синуклеин, поэтому предполагается, что изменение состава мембраны при мутациях ОБЛ может непосредственно влиять на метаболизм а-синуклеина [18]. С помощью технологии ИПСК были получены ОБЛ-му-тантные клеточные линии от больных БП и от пациентов с болезнью Гоше, а также клетки с генетически скорректированной мутацией. В мутантных нейронах от больных БП и болезнью Гоше наблюдали накопление глюкоцереб-розидов и а-синуклеина, а также повышенный уровень одного из маркеров аутофагии — LC3-II [18]. Эти и другие исследования ярко демонстрируют возможности клеточной технологии репрограммирования в установлении ключевых звеньев и триггеров патогенетического каскада при различных генетических формах БП [19].
Болезнь Паркинсона и методы редактирования генома
Методы редактирования генома, стремительно ворвавшиеся в фундаментальную биологию и медицину в начале 2010-х годов, стали важным исследовательским инструментом и одновременно новым потенциальным терапевтическим подходом при моногенных заболеваниях нервной системы, в том числе при генетических формах БП. Редактирование генома дает возможность внести целенаправленные изменения в таргетные участки генов интереса, корректируя мутант-ные нуклеотидные последовательности или, напротив, создавая нужные мутации на модельных объектах. Одним из наиболее привлекательных объектов для геномного редактирования являются ИПСК в силу возможности моделирования "пациентспецифичной" патологии и изучения функций конкретных генов [20].
Редактирование генома является одним из видов генной инженерии с использованием специфически спроектированных эндонукле-аз ("молекулярных ножниц"). Эти нуклеазы
создают сайтспецифичные двухцепочечные разрывы ДНК в строго определенном участке генома. Иногда ученые используют особые варианты эндонуклеаз — никазы, "режущие" лишь одну цепь двухцепочечной ДНК в сайтах рестрикции. Индуцированные разрывы ДНК затем восстанавливаются при рекомбинации, а сам процесс репарации ДНК при этом сопровождается встраиванием нужных нуклеотидов (что и составляет сущность "редактирования" генома). Общая стратегия геномной инженерии с помощью сайтспеци-фических нуклеаз включает четыре основных этапа: выбор целевой нуклеотидной последовательности в геноме; создание нуклеазной конструкции, направленной на выбранную мишень; доставку этой конструкции в клеточное ядро; анализ полученных мутаций.
Известны три методики редактирования генома, различающиеся типом используемых нуклеаз: 1) нуклеазы с ДНК-связывающими мотивами типа "цинковых пальцев" (zinc fingers, ZFN); 3) нуклеазы TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease); 3) система CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 protein). Использование системы CRISPR/Cas9 имеет ряд преимуществ перед методами, основанными на ZFN и TALEN. Эту модель значительно проще создать, она имеет более высокую эффективность, подходит для высокопроизводительного редактирования генома в самых разных клеточных линиях. Она основана на использовании естественных бактериальных комплексов, состоящих из белков и РНК. Эти комплексы защищают бактериальные клетки от вторжения вирусов путем распознавания и разрезания вирусной РНК. Взяв за основу эти структуры, ученые создали ДНК-комплексы, представляющие собой нуклеазу Cas9, связанную с короткими цепочками РНК. Эти последовательности по принципу комплементарности взаимодействуют с последовательностями ДНК, а Cas9 разрезает их в указанном месте. Для переориентации на новую мишень нужно только поменять 20-нуклеотидную направляющую последова-
тельность РНК. Высокая эффективность, простота сборки отдельных компонентов в условиях современной лаборатории, устойчивость к эпигенетическим модификациям — все эти свойства системы CRISPR/Cas9 привели к тому, что в данный момент она является самой используемой разновидностью техно -логии геномного редактирования для создания моделей заболеваний человека in vitro и in vivo [21].
Геномное редактирование с использованием нуклеазной системы CRISPR/Cas9 активно применяется для моделирования патологии ИПСК. В многочисленных экспериментах, в том числе проведенных в нашей лаборатории, было показано, что коррекция мутаций в генах паркинсонизма с использованием CRISPR/Cas9 не только позволяет уточнить вклад генов интереса в тот или иной патогенетический путь, но и существенно улучшает результаты экспериментальной терапии БП, например нейротрансплантации у крыс с токсической моделью паркинсонизма [22].
Следует помнить, что редактирование генома ИПСК может быть сопряжено с появлением мутаций в результате нецелевой активности нуклеаз или других причин, что пока затрудняет применение таких культур в клинике. Проведенные молекулярные и цитогенети-ческие анализы кариотипов выявили вновь возникшие незапланированные точковые мутации, хромосомные аберрации, анеуплои-дии или полиплоидии, которые, однако, в большинстве случаев не являются значимыми [23, 24]. Предполагается, что геномные аберрации возникают независимо от того, применялись ли интеграционные или неинтеграционные методы доставки транскрипционных факторов репрограммирования [25]. Продукты мутантных генов сами по себе могут оказывать влияние на стабильность ядерного или мито-хондриального генома, что необходимо учитывать при геномном редактировании [26].
Таким образом, вышеописанные новые технологии позволяют эффективно работать с клеточными моделями БП, что повышает
информативность и общий уровень проводимых фундаментальных исследований. Данные, представленные в этом обзоре, показывают, что в настоящее время экспериментальное изучение двигательных расстройств является одной из горячих точек неврологии и нейробиологии.
Список литературы
1. Иллариошкин С.Н. Конформационные болезни мозга. М.: Янус-К; 2002.
2. Lesage S., Brice A. Parkinson's disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Hum. Mol. Genet. 2009;18(R1):R48-59.
3. Bekris L.M., Mata I.F., Zabetian C.P. The genetics of Parkinson disease. J. Geriatr. Psychiatry Neurol. 2010;23:228-42.
4. Bonifati V. Genetics of Parkinson's disease — state ofthe art, 2013. Parkinsonism Relat. Disord. 2014;20:S23-8.
5. Deng H.-X., Shi Y., Ahmeti K.B. et al. Indentification of TMEM230 mutatins in familial Parkinson's disease. Nat. Genet. 2016;48:733-9.
6. Ambroziak W., Koziorowski D., Duszyc K. et al. Genomic instability in the PARK locus is associated with Parkinson's. J. Appl. Genet. 2015;56:451-61.
7. Mok K.Y., Sheerin U., Simón-Sánchez J. et al. Deletions at 22q11.2 in idiopathic Parkinson's disease: a combined analysis of genome-wide association dat. Lancet. Neurol. 2016;15:585-96.
8. Novosadova E., Nekrasov E.D., Chestkov I.V. et al. A platform for studying molecular and cellular mechanisms of Parkinson's disease based on human induced pluripotent stem cells. Neurosci. Res. 2016;8:157-65.
9. Jungverdorben J., Till A., Brüstle O. Induced pluripotent stem cell-based modeling of neurodegenerative diseases: a focus on autophagy. J. Mol. Med. 2017;95:705-18.
10. Zhang Z., Liu L., Wu S., Xing D. Drp1, Mff, Fis1, and MiD51 are coordinated to mediate mitochondrial fission during UV irradiation-induced apoptosis. FASEB J. 2016;30:466-76.
11. Hagberg H., Mallard C., Rousset C.I., Thornton C. Mitochondria: hub of injury responses in the developing brain. Lancet. Neurol. 2014;13:217-32.
12. Su Y.-C., Qi X. Inhibition of excessive mito-chondrial fission reduced aberrant autophagy and neuronal damage caused by LRRK2 G2019S mutation. Hum. Mol. Genet. 2013;22:4545-61.
13. Nguyen T.N., Padman B.S., Lazarou M. Deciphering the molecular signals of PINKl/Parkin mitophagy. Trends Cell Biol. 2016;26:733-44.
14. Popovic D., Vucic D., Dikic I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nat. Med. 2014;20:1242-53.
15. Seibler P., Graziotto J., Jeong H. et al. Mito-chondrial parkin recruitment is impaired in neurons derived from mutant PINK1 induced pluripotent stem cells. J. Neurosci. 2011;31:5970-6.
16. Orenstein S.J., Kuo S.-H., Tasset I. et al. Interplay of LRRK2 with chaperone-mediated auto-phagy. Nat. Neurosci. 2013;16:394-406.
17. Dvir H., Harel M., McCarthy A.A. et al. X-ray structure of human acid-P-glucosidase, the defective enzyme in Gaucher disease. EMBO Rep. 2003;4:704-9.
18. Schondorf D.C., Aureli M., McAllister F.E. et al. iPSC-derived neurons from GBA1-associated Parkinson's disease patients show autophagic defects and impaired calcium homeostasis. Nat. Commun. 2014;5:4028.
19. Sánchez-Danés A., Richaud-Patin Y., Carballo-Carbajal I. et al. Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease. EMBO Mol. Med. 2012;4:380-95.
20. Закиян С.М., Медведев С.П., Дементьева Е.В., Власов В.В. Редактирование генов и
геномов. Новосибирск: Издательство СО РАН; 2016.
21. Choi P.S., Meyerson M. Targeted genomic rearrangements using CRISPR/Cas9 technology. Nat. Commun. 2014;5:3728.
22. Иллариошкин С.Н., Хаспеков Л.Г., Гривенников И.А. Моделирование болезни Пар-кинсона с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. М.: Соверо Пресс; 2016.
23. Ветчинова А.С., Симонова В.В., Новосадо-ва Е.В. и др. Цитогенетический анализ результатов геномного редактирования на клеточной модели болезни Паркинсона. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2018;3:355-9.
24. Dekel-Naftali M., Aviram-Goldring A., Litma-novich T. et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 2012;20:1248-55.
25. Gore A., Li Z., Fung H.-L. et al. Somatic coding mutation in human induced pluripotent stem cells. Nature. 2011;471(7336):63-7.
26. Lee S.Y., Chung S.-K. Integrating gene correction in the reprogramming and transdifferentiation processes: a one-step strategy to overcome stem cell-based gene therapy limitations. Stem Cells Int. 2016;2016:2416192.
