CC BY
401
помощь практическому врачу
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.631-076.5
Т. В. Ходунова, Е. Л. Семикина, Е. А. Копыльцова
СОВРЕМЕННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИССЛЕДОВАНИй КЛЕТОчНОГО СОСТАВА МОчИ
ФГБУ Научный центр здоровья детей РАМН, 119991, Москва, Ломоносовский просп., 2/62
Представлены характеристики современного автоматического анализатора мочи, которые позволяют объективизировать процесс количественного подсчета элементов мочевого осадка. Анализатор способен просчитать до 65 000 частиц в мкл. Дополнительные опции прибора дают возможность определить количество дисморфных эритроцитов, дать предварительное заключение о соотношении лейкоцитарных популяций в моче и принадлежности бактерий к грампозитивной или грамнегативной флоре. Отдельной задачей является необходимость разработки референсных интервалов показателей клеточного состава мочи применительно к автоматическому анализатору.
Ключевые слова: автоматический анализатор мочи, подсчета элементов мочевого осадка, разработки референсных интервалов
T. V. Khodunova, E. L. Semikina, E. A. Kopyltsova.
MODERN POSSIBILITIES OF STUDIES OF CELLULAR COMPOSITION OF URINE
Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre of Child Healthcare» of the Russian Academy of Medical Sciences, 2/62, Lomonosov avenue, Moscow, 119991
The characteristics of the modern automatic urine analyzer, which allows to objectify the process of the quantitative calculation of elements of the urinary sediment are presented. The analyzer is able to count up to 65,000 particles per microliter. Additional options provide the possibility to determine the number of dismorphic red blood cells and to give preliminary report about the ratio of leukocyte populations in the urine and affiliations of bacteria to the gram-positive or gram-negative flora. A separate task is the need to develop reference ranges of indices of cellular composition of urine in respect to the automatic analyzer.
Keywords: automatic urine analyzer, counting elements of the urinary sediment, development of reference ranges
Общий анализ мочи является одним из наиболее востребованных анализов в клинике и у здоровых людей для скрининга на патологию мочевыделительной системы [1, 2]. Традиционное исследование мочи представляет собой двухступенчатую процедуру. На первом этапе мочу тестируют полуколичественно при помощи тест-полосок для изучения физических и химических параметров. На втором этапе осадок мочи исследуют под микроскопом [3]. Микроскопия мочи для исследования клеточных элементов является длительной по времени и требует участия эксперта. Множество факторов влияет на конечный результат. Эти факторы можно подразделить на преаналитические, такие как центрифугирование, и аналитические, например вариабельность интерпретации структур мочевого осадка разными врачами-цитологами. Эти ограничения приводят к неточностям и погрешностям [4]. По международным требованиям осадок мочи должен быть подсчитан либо с использованием стандартизованной процедуры под микроскопом в камере, либо на автоматическом анализаторе [5, 6]. Внедрение в лабораторную практику анализаторов мочи SYSMEX серии UF-1000i/UF-500i изменило методологию общего анализа мочи, в частности такого важного раздела, как изучение организованного и неорганизованного мочевого осадка.
Достаточно сложным представляется строгое выполнение требований к идеальному образцу мочи в условиях детского учреждения, особенно в отделениях для детей раннего
Для корреспонденции: Ходунова Татьяна Викторовна, канд. мед. наук, ст. науч. сотр. ЦКДЛ, НЦЗД РАМН
возраста, когда в лабораторию поступают образцы в количестве до 10 мл. Отсюда возникают разного рода ошибки этого этапа методики, которые включают:
• ошибки преаналитического этапа (ошибки сбора и хранения образца);
• аналитические ошибки (объективные и субъективные);
• объективные ошибки - погрешности метода;
• субъективные ошибки со стороны исследователя - недостаточное соблюдение требований, предъявляемых к идеальному образцу мочи.
Необходимо остановиться на объективных ошибках. одним из сложных этапов унифицированной методики подсчета мочевого осадка является центрифугирование (табл. 1). Как показано в табл. 1, лучше всего оседают эпителиальные клетки, диагностическая ценность которых невысока. Значительно хуже ситуация обстоит с лейкоцитами и цилиндрами. Эритроциты и бактерии оседают хуже всех остальных частиц. Увеличение ускорения и длительности центрифугирования несколько улучшает ситуацию, однако не изменяет ее кардинально.
Формула зависимости скорости оседания частиц в моче от ряда параметров: = (Рр-Р)д--
18ц ,
где Vt - скорость оседания частиц (в см/с), Рр - специфическая сила тяжести частицы, Р - специфическая сила тяжести мочи, х - радиус частицы, ц - вязкость мочи; g - ускорение.
Кроме того, скорость оседания частиц прямо пропорциональна размеру и специфической силе тяжести частицы, специфической силе тяжести мочи, ускорению центрифуги и обратно пропорциональна вязкости мочи (см. формулу). Чем меньше частица и чем она легче (например, дисморфный эритроцит), тем хуже она оседает. Чем выше вязкость мочи, тем медленнее идет процесс осаждения. Таким образом, чем более патологическая моча, тем хуже она седиментирует.
Среди других источников ошибок может быть назван подсчет форменных элементов в камере Горяева, а не в камере Фукса-Розенталя. Согласно требованиям унифицированной методики, подсчет осадка мочи производят в камере Фукса-Розенталя, объем которой составляет 3,2 мл. Однако в отечественной лабораторной практике большее распространение получила камера Горяева объемом 0,9 мл. Подобное уменьшение объема повышает вероятность ошибок при подсчете элементов организованного осадка мочи. ошибки субъективного характера могут зависеть от квалификации цитолога.
таким образом, подводя промежуточные итоги, можно отметить, что унифицированный метод исследования анализа мочи сложно поддается стандартизации; его результат напрямую зависит от объективных и субъективных факторов.
Автоматизация клинического анализа мочи коренным образом изменила алгоритм подхода к исследованию. На первом этапе все образцы нативной мочи проходят через анализатор ROCHE URISIS 2400, где в автоматическом режиме с помощью тест-полосок исследуются физико-химические свойства мочи. на втором этапе все образцы нативной мочи без предварительного выбора в автоматическом режиме изучаются на анализаторе SYSMEX серии UF 1000i для количественного подсчета мочевого осадка.
Анализаторы серии uF являются проточными цитофлюо-риметрами, основанными на передовой технологии полупроводникового лазера. Для выявления характеристик частиц используют специфические реагенты (дилюенты и флюорох-ромы). Частицы проходят строго по одной и с высокой скоростью через проточную камеру за счет гидродинамического фокусирования. Для каждой частицы регистрируют сигналы фронтального и бокового светорассеяния, а также интенсивность вызванной лазером флюоресценции. Фронтальное светорассеяние отражает диаметр частицы. Боковое светорассеяние пропорционально внутренней сложности частицы. каждая частица имеет свой индивидуальный пульс флюоресценции.
Преимущества автоматического анализа осадка мочи:
• высокая точность подсчета - прибор способен просчитать до 65 000 частиц в 1 мкл образца,
• высокая статистическая надежность,
• высокая скорость подсчета образцов,
• исключение процесса центрифугирования из цикла исследования,
• субъективный фактор участия в подсчете врача-цитолога сведен до минимума, он заключается в морфологическом контроле количественных флагов.
Дополнительными количественными методами подсчета мочи являются пробы по Нечипоренко (1961 г) и проба по Аддису-Каковскому (1910/1925 гг). Проба по Нечипо-ренко заключается в определении количества лейкоцитов, эритроцитов и цилиндров в 1 мл средней порции утренней мочи. Проба по Аддису-Каковскому рассчитана на определении тех же форменных элементов, но в суточной моче. Унифицированные методики обеих этих проб включают центрифугирование в процессе пробоподго-товки и подсчет элементов организованного осадка мочи в камере
Таблица
Среднее содержание (в %) частиц в супернатанте после центрифугирования
Частица Ценрифугирование
норма 400 q/5 мин 500 q/5 мин 500 q/15 мин
Эритроциты 19 38,7 28,9 17,4
Лейкоциты 20 22,1 18,9 4,1
Эпителиальные клетки 18 4,7 2,9 0,6
Цилиндры 16 20,7 16,4 4,5
Бактерии 19 46,1 43,3 27,0
Таблица 2
Кратность превышения показателей пробы Аддиса-Каковского, рассчитанной по данным прибора над унифицированной методикой
Показатель Median Minimum Maximum
WBC_Ratio 10,32 0,07 2394,4
RBC_Ratio 8,21 0,12 348,80
под микроскопом. Следовательно, ошибки, характерные для унифицированного анализа мочи, повторяются и в пробах по Нечипоренко и Аддису-Каковскому.
С учетом того, что автоматический анализатор определяет количество форменных элементов в 1 мкл мочи, целесообразно, на наш взгляд, показатели проб по нечипоренко и по Аддису-Каковскому исчислять исходя из этих цифр. Однако мы столкнулись с проблемой несоответствия получаемых результатов тем нормам, которые разработаны для унифицированных методик. Для поиска путей решения нормативных несоответствий мы провели следующее исследование. 135 образцов мочи, доставленных в лабораторию для подсчета пробы по Аддису-Каковскому, параллельно просчитали по унифицированной методике и на автоматическом анализаторе (табл. 2).
Данные совершенно предсказуемы, поскольку прибор считает показатели в нативной моче, а в унифицированной мето-
Таблица 3
Соотношение нормы и патологии в пробе по Аддису-Каковскому при автоматическом подсчете и при рутинной методике
Показатель Автоматизированный подсчет Рутинная методика
WBC_Ratio До 20 640 000 Более 20 640 000 До 2 000 000 Более 2 000 000
Число обследованных 109 24 104 31
RBC_Ratio До 8 210 000 Более 8 210 000 До 1 000 000 Более 1 000 000
Число обследованных 99 36 103 32
1
Рис. 1. Основное рабочее окно анализатора. Клинический пример больного ребенка с выраженной гематурией и лейкоцитурией, а также дисморфными эритроцитами. На эритроцитарной скатерограмме видны две основные фракции эритроцитов - крупные и мелкие, что подтверждается двумя пиками на гистограмме. Лейкоцитарная гистограмма в виде двугорбой кривой свидетельствует о присутствии лимфоцитов (мелкие клетки - 1 пик) и нейтрофилов (крупные клетки - 2 пик).
Рис. 2. Дополнительное исследовательское окно анализатора - детализация морфологии эритроцитов. Тот же больной. Абсолютное количество дисморфных эритроцитов указано в графе БтаИ-КВС. Относительное их содержание рассчитывается исходя из общего числа нелизированных эритроцитов (non-lysed ИБС). В данном примере дисморфные эритроциты составляют 95,6% из всех нелизированных эритроцитов.
дике предусмотрено центрифугирование при пробоподготов-ке. Счет на анализаторе был однозначно выше, чем показатели подсчета по унифицированной методике. Разница по эритроцитам составила в среднем 8,21 раза, по лейкоцитам - 10,32 раза. Цилиндры выявили лишь у 1 ребенка при подсчете пробы Аддиса-Каковского по унифицированной методике. Это свидетельствует о том, что цилиндры легче разрушаются при центрифугировании, чем эритроциты и лейкоциты, поскольку
они значительно крупнее и не являются клеточной структурой.
Таким образом, существующие нормы для унифицированной методики подсчета пробы по Нечипоренко и по Аддису-Каковскому неприемлемы при автоматическом подсчете осадка мочи. Назрела реальная необходимость пересмотра существующих нормативных показателей для этих проб.
Возможность временного (до момента разработки норм) введения некого поправочного коэффициента пересчета с целью адаптации результатов автоматизированного подсчета к нормам рутинной методики потверждается данными табл. 3.
Обсуждая дополнительные количественные методы исследования мочи, необходимо отметить, что особенно для пробы по Аддису-Каковскому очень важным является соблюдение правил сбора и хранения образца. По мнению авторов этой методики, суточная моча в обязательном порядке должна храниться в холодильнике. Рекомендовано даже добавление кристалла тимола для предотвращения защелачи-вания мочи в условиях бактериального загрязнения. в реальности такие несложные правила не всегда возможно соблюдать по тем или иным причинам. В результате нарушений в преаналитическом этапе при автоматическом подсчете выявляют высокий уровень бактериурии, который, естественно, снижает качество получаемых результатов.
Вывод может быть однозначным - либо строгое соблюдение условий правильного сбора и хранения суточной мочи, либо отказ от пробы по Аддису-каковскому в пользу пробы по Нечипоренко.
помимо всех вышеперечисленных функций, автоматический анализатор может рассчитать абсолютное и относительное количество дисморфных эритроцитов, которые обозначаются в приборе как Small-RBC, при этом прибор выдает флаг Dysmorphic (рис. 1, 2).
По скатерограмме и гистограмме лейкоцитов (WBC) можно предварительно судить о том, какие клетки присутствуют в осадке мочи - гранулоциты или мононуклеары. Чем правее по оси абсцисс и выше по оси ординат располагаются облака флюоресценции, тем крупнее размер клетки и выше сигнал ее флюоресценции, и тем вероятнее они относятся к грану-лоцитам. Аналогичное предварительное заключение можно сделать и по гистограмме. например, наличие двух пиков на гистограмме свидетельствует о наличии двух популяций лейкоцитов. Вывод не может быть окончательным - необходимо подтверждение уроцитограммой.
По расположению бактериальных облаков на скатерограмме можно предположить принадлежность флоры к грампозитивной или грамнегативной, что не заменяет посев мочи.
Таким образом, автоматический подсчет частиц мочевого осадка является предпочтительным как значительно более точный по сравнению с седиментационными методами [7-10]. При проведении исследований осадка мочи на автоматическом анализаторе SySMEX 1000i и микроскопии нецентрифугиро-ванной мочи выявили хорошую корреляцию для эритроцитов (RBC), лейкоцитов (WBC) и эпителиальных клеток (EC). Что касается цилиндров, то авторы рекомендуют проводить микроскопический контроль образов с флагом CASTS для дифференциальной диагностики гиалиновых и патологических цилиндров [11].
наш опыт автоматического подсчета мочи на анализаторе SySMEX 1000i однозначно подтверждает его преимущество по сравнению с подсчетом осадка мочи рутинной методикой. качество определяют в основном способностью
анализатора просчитывать до 65 000 частиц в 1 мкл. Кроме того, подсчет проводят в нативной моче - процесс центрифугирования исключен из периода пробоподготовки. Субъективный фактор участия врача-цитолога сведен до минимума, он заключается в периодическом контроле флагов. Вместе с тем введение в практику лабораторной службы автоматического подсчета мочи поставило перед нами ряд нормативных проблем. Прежние нормы, принятые для рутинных методик, которые основаны на исследовании центрифугированной мочи, неприемлемы для нативной мочи. наиболее насущной для нас представляется разработка ре-ференсных значений для пробы по нечипоренко. Автоматизация процесса подсчета осадка мочи значительно улучшила качество исследований, открыла новые диагностические горизонты, но при этом поставила ряд новых задач, требующих их скорейшего решения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Tsuoshi I., Takako H., Atsushi N., Hidelaki M. Examination of remaining cells by UF-100? Fully automated urine cell analyzer in supernatant after centrifugation. Sysmex J. Int. 2003; 13 (1).
2. Lamchiagdhase P., Preechaborisutku K., Lomsomboon P. et al. Urine sediment examination: a comparison between the manual method and the iQ200 automated analyzer. Clin. Chim. Acta. 2005; 358: 167-174.
3. Chien T., Kao J. T., Lin P. C. et al. Urine sediment examination: a comparison of automated urinalysis systems and manual microscopy. Clin. Chim. Acta. 2007; 384: 28-34.
4. De KeijzerM. H., Brandts R. W. Flow cytometry and the urine laboratory: field evaluation of the Sysmex UF-100. Sysmex J. Int. 1997; 7: 117-122.
5. RabinovichA., Arzoumanian L., CurcioK. et al. Urinalysis approved guidelines. 3rd ed. CLSI GP16-A3 2009; 29: 1-33.
6. Kouri T., Fogazzi V., Gam V. et al. European urinalysis guidelines. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2000: 60 (suppl. 2): l-96.
7. Wah D. T., Wises P. K., Butch A. W. Analytic performance of the iQ200 automated urine microscopic analyzer and comparison with manual counts using Fuchs-Rosenthal cell chambers. Am. J. Clin. Pathol. 2005; 123: 290-296.
8. Koun T. T., Kahkonen U., Malminiemi K. et al. Evaluation of Sysmex UF-100 urine flow cytometer vs chamber counting of supravitally stained specimens and conventional bacterial cultures. Am. J. Clin. Pathol. 1999; 112: 25-35.
9. SutheesophonK., WiwanitkitV., BoonchalermvichianC., CharuruksN. Evaluation of the Sysmex UF-100 automated urinalysis analyzer and comparative study with JCCLS method. J. Med. Assoc. Thai. 2002; 85 suppl. l) :S246-S252.
10. Delanghe J. R., Kouri T. T., Huber A. R. et al. The role of automated particle flow cytometry in clinical practice. Clin. Chim. Acta. 2000; 301: 1-18.
11. Regeniter A., Haenni V., Risen L. et al. Urine analysis performed by flow cytometry: reference range determination and comparison to morphological findings, dipstick, chemistry and bacterial results - a multi center study. Clin. Nephrol. 2001; 55: 384-392.
Поступила 17.07.12
сведения об авторах:
Семикина Елена Леонидовна, д-р мед. наук, зав. ЦКДЛ, НЦЗД РАМН
Копыльцова Елена Анатольевна, канд. мед. наук, ст. науч. сотр. ЦКДЛ, НЦЗД РАМН.
