CC BY
85
В. Н. Эллиниди,
Н. И. Давыдова,
Н. М. Калинина,
Е. А. Михнина,
О. А. Добротворцева
Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС России, Санкт-Петербург; Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург
■ Исследовали показатели местного иммунитета иммуногистохимическим методом в эндометрии от 151 женщин с морфологическими проявлениями хронического эндометрита. Для подтверждения воспалительного процесса и уточнения его характера были изучены параметры системного иммунитета. По изменениям параметров местного иммунитета были выделены три группы пациенток. Определение параметров системного иммунитета позволило подтвердить хронический эндометрит у всех женщин и выявить группу с аутоиммунным характером воспаления.
СОВРЕМЕННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА
Актуальность проблемы
Проблема изучения воспалительных заболеваний эндометрия у женщин репродуктивного возраста является актуальной, так как вызывает не только нарушение менструальной, но и репродуктивной функции. Частота встречаемости хронического эндометрита при бесплодии колеблется от 20 до 60% [5], при привычном невынашивании беременности — от 60,5 до 86,7% [1]. Клинические проявления хронического эндометрита неспецифичны, заболевание часто диагностируется случайно при скрининговом обследовании женщин.
Для диагностики хронического эндометрита используется, как правило, гистологический метод, учитывающий совокупность морфологических признаков хронического воспаления: наличие очаговой лимфолейкоцитарной инфильтрации, очагового или диффузного фиброза стромы; присутствие плазматических клеток и склеротические изменения стенок спиральных артерий [6, 3]. Наличие только одного или двух вышеописанных критериев воспаления вызывает сомнение у морфологов в постановке диагноза хронического эндометрита. Других способов верификации диагноза на сегодняшний день не существует.
Данные литературы, касающиеся изменений параметров иммунитета при хронических воспалительных процессах эндометрия (эндометритах) малочисленны [4, 8].
Цель исследования: определение маркеров иммунокомпетент-ных клеток, подтверждающих воспаление в эндометрии и уточнение характера воспалительного процесса при сопоставлении показателей местного и системного иммунитета.
Материалы и методы
Показатели системного и местного иммунитета были изучены в лаборатории морфологических исследований и НИЛ клеточного и гуморального иммунитета ВЦЭРМ МЧС России. Группу исследования составили 151 женщина (средний возраст 32 года) с нарушением репродуктивной функции (бесплодие первичное, вторичное, невынашивание беременности), с гистологическими критериями хронического эндометрита. Все женщины наблюдались в НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта, где перед выполнением инвазивных процедур (лапаро- и гистероскопий, гис-теросальпингографий, биопсий эндометрия) они были обследованы на наличие скрытых инфекций урогенитального тракта с использованием бактериологического, культурального, иммуно-флюорисцентного, иммуноферментного и серологического ме-
тодов исследования (в качестве биологического материала исследовались секрет влагалища и цервикального канала, а также образцы крови). Контрольную группу составили 10 женщин с нормальной морфологической структурой эндометрия, соответствующей пролиферативной (5) и секреторной (5) фазам менструального цикла без признаков воспаления.
Местный иммунитет.Показатели местного иммунитета — количество естественных киллер-ных клеток (С056+ и С016+), лимфоцитов экспрессирующих маркеры активации НЬА-ОЯ+, СШ5+, изучали в ткани эндометрия (соскобах) иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител (фирмы «Коуосав^а», Великобритания) по описанной методике [7]. Полученные результаты оценивали количественно (в трех полях зрения при увеличении микроскопа-объектива х40).
Системный иммунитет. С целью подтверждения воспалительного процесса и определения его характера были изучены параметры системного иммунитета у 50 женщин. Субпопуляци-онный состав лимфоцитов периферической крови определяли методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител (МедБиоСпектр, Москва). Спонтанную, индуцированную продукцию и содержание в сыворотке цитокинов определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя тест-системы «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург) для изучения фактора некроза опу-холей-а (ФНО-а), интерферона-ос (ИНФ-а), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-4 (ИЛ-4) и тест-системы «Цитокин» (Санкт-Петербург) для определения интерферон-у (ИНФ-у). Циркулирующие иммунные комплексы высоко-, средне-, низкомолекулярные (ЦИКв, ЦИКс, ЦИКн) определяли осаждением ПЭГ 6000. Уровни иммуноглобулинов классов А, М, О изучали тур-бодиметрическим методом. Секреторный иммуноглобулин А определяли иммуноферментным методом, используя тест-системы «Полигност», Санкт-Петербург.
Результаты исследования
По результатам бактериологического, культурального и серологического исследований в группе обследованных у 9 женщин диагностирован гепатит С, у 8 женщин выявлена хроническая герпетическая, у 14 микоплазменная, у 5 хламидийная, у 47 уреамикоплазменная инфекции. Всего инфицировано было 49% (71) женщин, выявление двух и более возбудителей отмечено у 66% из числа инфицированных. До
проведения иммунологического обследования все женщины были пролечены по поводу выявленных инфекций урогенитального тракта. При гистологическом исследовании соскобов эндометрия морфологическое подтверждение хронического эндометрита отмечено у 11,9% женщин, только лимфолейкоцитарная инфильтрация стромы эндометрия имела место у 54,6%, фиброз стромы выявлен у 34,5% обследованных.
При иммуногистохимическом исследовании эндометрия в контрольной группе количество клеток, экспрессирующих СБ56+, СБ16+ и НЬА-ОЛ+ было 0-5 в поле зрения.
Полученные результаты исследования местного иммунитета от 151 женщины позволили нам выделить 3 группы обследованных (таблица).
В первую группу были включены 64 женщины (42,7%), в эндометрии которых количество лимфоцитов, экспрессирующих С056+ и Н1А-ОЛ+, не отличались от контрольной группы (от 5 до 10 в поле зрения и 0-5 в поле зрения соответственно), но было повышено количество клеток, экспрессирующих СО 16+ — от 10 до 50 в поле зрения.
Вторую группу составили 40 (26,7%) женщин, в эндометрии которых количество лимфоцитов, экспрессирующих С056+ — было 10-25-30 в поле зрения, С016+ — от 30 в поле зрения, Н1А-ОЛ+ — 15-20 в поле зрения, что превышало эти показатели по сравнению с контрольной группой почти в три раза.
Третью группу составили 47 (31,3%) женщин, в эндометрии которых количество клеток, несущих антигены СЭ56+, СО 16+ и Н1А-011+ было выше 50 в поле зрения, что значительно превышало количество этих же показателей по сравнению с контрольной группой в 5 раз и выше.
При сопоставлении данных местного иммунитета с системным у женщин в различных группах было выявлено, что субпопуляционный состав лимфоцитов (рис. 1) в каждой из выделенных групп и у всех обследованных женщин достоверно не отличался от средних показателей нормы (р>0,05). У всех женщин и в каждой из
Таблица
Распределение женщин по группам в зависимости от количества лимфоцитов, экспрессирующих СБ56+ в эндометрии
Г руппы (кол-во женщин) Параметры местного иммунитета (в поле зрения)
CD56+ CD16+ HLA-DR CD25+
1(64) 0-5-10 20-50 0-10 0
2(40) 10-25 30-50 10-30 0
3 (47) От 30 От 50 От 30 0
Контроль( 10) 0-5-10 0-5-10 0-5-10 0
CD3+ CD4+ CD8+ CD4/8+ CD16+ CD20+
И контроль ■ вся группа □ 1 группа
□ 2 группа ■ 3 группа
Рис. 1. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у женщин в зависимости от количества в эндометрии лимфоцитов, экспрессирующих СВ56+
CD25+
■ контроль
■ вся группа □ 1 группа
CD95+
HLA
□ 2 группа ■ 3 группа
Рис. 2. Количество лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих маркеры активации (С025+, С095+, НЬА(П) у женщин в зависимости от количества в эндометрии лимфоцитов, экспрессирующих С 056+
выделенных групп отмечалась тенденция к снижению специфических цитотоксических лимфоцитов (С08+) в периферической крови с наиболее выраженными изменениями в 3 группе. За счет этого несколько был увеличен иммунорегу-ляторный индекс, достигающий максимальных показателей в 3 группе. Содержание естественных киллеров (СБ16+) в периферической крови приближалось к нижним границам нормы и в 3 группе этот показатель был самым низким.
Количество лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации С095+ и НЬА-ОЯ+ (табл. 3), свидетельствующие об активности процесса, не отличались от средних показателей в контрольной группе. Количество лимфоцитов, экспрессирующих СБ25+ (рис. 2) — маркер клеток-супрессоров пролиферации аутореактивных клеток, был снижен в 1 и во 2 группе [10]. Во всех группах отмечены высокие показатели спонтанной продукции ИЛ-2, при этом индуцированная продукция ростового фактора была в норме (рис. 3).
Показатели иммуноглобулинов классов А, М, в (рис. 4) были в норме, однако уровень секреторного иммуноглобулина А (51вА) был повышен во всех исследуемых группах, что объясняется наличием воспалительного процесса в слизистой эндометрия и особенностями иммунитета слизистых. Отмечалось повышенное содержание ЦИКн во всех исследованных группах по сравнению с контрольной (рис. 5).
Спонтанная продукция и содержание в сыворотке ИФН-у в целом и в выделенных группах статистически достоверно превышали значения этого показателя в контрольной группе, при этом
ед/мл 16
14
12
10
6 -
ИЛ-2сп
■ контроль
■ вся группа □ 1 группа
ИЛ-2ин
□ 2 группа ■ 3 группа
Рис. 3. Продукция ростового фактора ИЛ-2 у женщин в зависимости от количества в эндометрии лимфоцитов, экспрессирующих СБ56+
максимальное содержание этого цитокина отмечалось у пациентов 3 группы (рис. 6) (тест Манна-Уитни, р< 0,05). Спонтанная продукция и содержание в сыворотке провоспалительного цитокина ФНО-а у всех обследованных женщин, особенно во 2 и 3 исследуемых группах, превышало контрольные значения с максимальным нарастанием показателей в 3 группе (рис. 6), отличия между группами были достоверными (тест Манна-Уитни, р< 0,05). Спонтанная продукция и содержание в сыворотке ИЛ-4 были повышены у всех женщин (рис. 6), достоверно отличались от показателей контрольной группы и характеризовались максимальным увеличением в 3 группе (тест Манна-Уитни, р< 0,05).
Обсуждение
На сегодняшний день большая роль в естественной иммунной защите эндометрия отводится большим гранулярным лимфоцитам, точнее натуральным киллерным клеткам с высокой экспрессией (СБ16+С056+++), способным лизиро-вать широкий спектр клеток-мишеней. Именно эти клетки считаются основными регуляторами физиологических процессов, связанных с пролиферацией, и рассматриваются как иммунокомпе-тентные клетки, отвечающие за репродуктивный иммунитет и поддержание беременности [9,12].
В связи с тем, что формирование групп сравнения основывалось на результатах иммуногис-тохимического определения в соскобах эндометрия количества лимфоцитов, экспрессирующих СБ56+, СБ16+ и НЬА-11 параметры системного иммунитета были выборочно изучены у женщин в каждой из этих групп. Выявленное увеличение в эндометрии количества лимфоцитов, экспрессирующих С056+ у пациентов второй и третьей групп, сочеталось с более низкими значениями в этих группах количества лимфоцитов периферической крови, осуществляющих ци-тотоксическую функцию, как специфическую (С08+),так и неспецифическую (СБ16+) и сопровождалось увеличением иммунорегуляторно-го индекса. Снижение этих субпопуляций лимфоцитов (СЭ8+, СБ16+) в периферической крови можно объяснить миграцией этих клеток в очаг воспаления — эндометрий. Все обследованные группы характеризовались высокой спонтанной продукцией ростового фактора — интерлейкина-2, необходимого не только для пролиферации Т-, В-лимфоцитов, но и естественных киллерных клеток, что наряду с высокой спонтанной продукцией провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИНФ-у и высоким уровнем этих цитокинов в сыворотке подтверждает
ед/мл
■ контроль
■ вся группа □ 1 группа
□ 2 группа ■ 3 группа
Рис. 4. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови (IgA, ^М, ^О, sIgA) и циркулирующих иммунных комплексов в крови у женщин в зависимости от количества в эндометрии лимфоцитов, экспрессирующих С056+
ЦИКв
■ контроль
■ вся группа □ 1 группа
ЦИКс
ЦИКн
□ 2 группа ■ 3 группа
Рис. 5. Изменения циркулирующих иммунных комплексов
наличие воспалительного процессах во всех исследуемых группах. ФНО-а и ИНФ-у влияют на цитотоксическую активность естественных киллерных клеток эндометрия, реализующих ее по Рав-зависимому или перфоринопосредованному
У-е
1400
1200
1000 ■
800
600
400 ■
200 ■
О
■ контроль □ 2 группа
■ вся группа ■ 3 группа □ 1 группа
Рис. 6. Продукция цитокинов Тх1(ФНО-а, ИНФ-у) и Тх2(ИЛ-4) у женщин в зависимости от количества в эндометрии лимфоцитов, экспрессирующих СЭ56+
пути. Увеличенная продукция исследованных цитокинов может явиться одной из причин нарушения развития эмбриона и прерывания беременности.
По некоторым данным [11] на цитотоксичес-кую функцию эндометриальных лимфоцитов также оказывает влияние ИЛ-4, высокое содержание в сыворотке и повышенная спонтанная продукция которого наблюдались во всех исследуемых группах. Повышенная спонтанная продукция ИЛ-4 и его высокий уровень в сыворотке отражает также активность гуморального иммунного ответа, что подтверждается повышенным уровнем секреторного иммуноглобулина А. Высокое содержание ЦИКн, характеризующихся тропностью к эндотелию, свидетельствует о возможном вовлечении в воспалительный процесс мелких сосудов и капилляров и способствует выраженности остроты процесса. Выявленные нарушения показателей местного (повышенное количество лимфоцитов, экспрессирующих
CD56+++CD16++) и системного иммунитета (снижение CD8+, CD16+, повышение иммму-норегуляторного индекса, увеличенное содержание в сыворотке ЦИКн, высокая продукция ИЛ-2, ФНО-а и ИНФ-у) у пациенток 3 группы были расценены нами как аутоиммунное воспаление. Проведенное комплексное исследование параметров местного и системного иммунитета у женщин с нарушением репродуктивной функции позволило уточнить иммунопатогенез хронических эндометритов, подтвердить его при сомнительном гистологическом диагнозе (наличие только лимфолейкоцитарной инфильтрации или фиброзе строме) и выявить группу пациенток с аутоиммунным характером воспаления. Уточнение иммунопатогенеза хронических эндометритов позволяет обосновать и применять в дальнейшем иммунокоррегирующую терапию.
Литература
1. Демидова Е.М. Привычный выкидыш (Патогенез, акушерская тактика). Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. -
1993. - 42 с.
2. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. - СПб.: Гиппократ, 1998. - 156 с.
3. Кузнецова А.В. Хронический эндометрит//Архив патологии. - 2000. - № 3. - С. 48-52.
4. Кузнецова А.В., Пауков С.В., Волощук И.Н., Демидова Е.М., Казарян С.М. Морфологические особенности хронического эндометрита // Архив патологии. - 2001. -N5 5. - С. 8-13.
5. Сметник В.П., Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология. 2-е изд. - СПб., 1995. - Кн. 2. - С. 46-52.
6. Хмельницкий O.K. Патоморфологическая диагностика гинекологических заболеваний. - СПб.: Сотис,
1994. - С. 136-144.
7. Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А: Практическая иммуногистохимия (методические рекомендации). - СПб., 2002. - С. 1—36.
8. Эллиниди В.Н., Калинина Н.М. Иммуноморфология эндометрия. Лечение бесплодия: нерешенные проблемы. -Саратов, 2001. - С. 158-162.
9. Cooper М., Fehniger Т., Turner S., et а/. Human natural killer cells a unique innate immunoregulatory role for the CD56 bright subset. Blood. - 2001. - Vol. 97. -
N 10. - P. 3146-3151.
10. Itoh М., Takahashi Т., Sakaguchi N. el al. Thymus and Autoimmunity: Production of CD25+ CD4+ naturally anergic and suppressive Tcells as a key function of the thymus in maintaining immunologic self-tolerance 1. Jornal oflmmunol. - 1999. - Vol. 162. -P. 5317-5326.
11. Joyce S. Natural T cells Cranking up the immune system by prompt cytokine secretion. PNAS. - 2000. -
Vol. 97. - N 13. - P. 6933-6935.
12. Shau H, Kim A, Hedrick C. et al: Endogenous natural killer enhancing factor-B increases cellular resistance to oxidative stresses. Free Radical Biology Medicine. - 1997. -Vol. 22. - N 3. - P. 497-507.
MODERN OPPORTUNITIES FOR DIAGNOSTICS OF CHRONIC ENDOMETRITIS
Ellinidi V.N., Davydova N.I., Kalinina N.M., Mikhnina E.A., Dobrotvortseva O.A.
