CC BY
163
СОВРЕМЕННЫЕ СПОСОБЫ ИЗГОТОВЛЕНИЯ, СТЕРИЛИЗАЦИИ И КОНСЕРВАЦИИ ДЕМИНЕРАЛИЗОВАННЫХ КОСТНЫХ ТРАНСПЛАНТАТОВ (обзор литературы)
A.A. Булатов, A.B. Калинин, В.И. Савельев
ГУ Российский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Р. Р. Вредена МЗ и СР РФ, директор - д.м.н. профессор Р.М. Тихилов, Санкт-Петербург
Дальнейшее развитие проблемы трансплантации костной ткани связано с появлением особой разновидности пластического материала, обеспечивающего надежный остеогенез не только в костном ложе, но и вне его, например, при внутримышечной или подкожной пересадке. Речь идет о деминерализованной костной ткани (ДКТ) и получаемых из нее морфогенети-ческих белках с остеоиндуктивными свойствами, изучаемыми в нашей стране и за рубежом [3-6, 11, 12, 14, 17, 19, 24, 31, 33-34]. Известно, что обеспечение высоких трансплантационных качеств ДКТ во многом зависит от строгого соблюдения определенных правил их изготовления. Здесь, на наш взгляд, можно выделить пять таких способов, получивших наибольшее признание.
Первый способ предложил M. Urist с соавторами [35, 37]. Он заключался в следующем: костную ткань обезжиривают в смеси метанола с хлороформом (1:1) при 25°С в течение 1 часа, затем ополаскивают холодной водой и деминерализуют в 0,6Н растворе соляной кислоты при 2°С, затем помещают в 2М раствор СаС12 при 2°С на 4 часа, 0,5М ЭДТА (рН 7,4) при 2°С на 1 час, 8М хлористый литий при 2°С на 4 часа, в дистиллированную воду при 55°С на 1 час. В дальнейшем H. Iwata с соавторами [23] усовершенствовали этот способ. Деминерализованная кость подвергалась химическому аутолизу и антиген-экстрагированию. Они описали следующий порядок получения ДКТ: 1) человеческую длинную кость или крышу черепа нарезают на меленькие кусочки; 2) обезжиривают смесью хлороформа с метанолом (1:1) в течение 6 часов при комнатной температуре; 3) производят частичную или полную деминерализацию в 0,6Н растворе соляной кислоты при 4°С; 4) обрабатывают 8М хлористым литием (LiCl) 24 часа при 2°С; 5) отмывают водой 24 часа при 55°С; 6) помещают на 4 дня при 37°С в 0,1М фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий антибиотики, JAM (3мМоль), NaN3 (10мМоль); 7) лиофили-зируют; 8) стерилизуют окисью этилена; 9) упаковывают в стерильные контейнеры.
Второй способ принадлежит С. Huggins с соавторами [22] и А. Reddi с соавторами [29, 30]. Согласно их предложению полученные образцы костей освобождают от периоста и костного мозга, промывают деионизированной водой, обезжиривают в 95%-ном этаноле (15 минут), в эфире (15 минут), далее сушат 24 часа. Затем с помощью мельницы компактную кость превращают в порошок, который просеивают через сито до размеров 70-420 микрон. Размельченную массу порциями по 20 г деминерализируют в 375 мл 0,5Н раствора соляной кислоты (1 час), прополаскивают в 95%-ном этаноле (15 минут) с помощью магнитной мешалки и центрифугируют в холо-довой центрифуге при 5000 об / мин. Процесс этот повторяется трижды. Последняя манипуляция заключается в прополаскивании порошка в спирте (1 час) и в эфире (30 минут), затем его оставляют на окончательную просушку (24 часа).
В третьем способе, предложенном Е. Gendleг [21], выделяют следующие этапы: 1) механическую очистку трубчатых костей от мягких тканей и вымывание из них остатков крови и костного мозга струей воды под напором; 2) обработку костей 95%-ным этанолом и высушивание на воздухе; 3) нанесение высокоскоростным буром на их поверхность множественных перфораций диаметром 0,25 мм; 4) деминерализацию 0,6Н раствором соляной кислоты при 4°С; 5) промывку в дистиллированной воде и вырезание из костей прямоугольных пластинок размером 5х20 мм; 6) обработку 95%-ным этанолом и этиловым эфиром; 7) высушивание на воздухе с последующей лиофилизацией и одновременной стерилизацией газообразной окисью этилена; 8) хранение в стерильных пластиковых пакетах при 4°С до момента использования в клинике. Автор считает, что перфорация ДКТ значительно ускоряет процессы их замещения новообразованной костной тканью.
Четвертый способ был разработан В.И. Савельевым [7]. Полученные посмертно различные костные сегменты подвергаются механической обработке, в том числе выскабливанию губчатой ткани вместе с жировым костным мозгом.
На участки кости повышенной плотности дополнительно наносят поверхностные или сквозные пропилы, в зависимости от плотности кости. После промывания холодной проточной водой с щетками препараты помещают в 1,2-3,6НН раствор соляной кислоты. Соотношение объема костной ткани к объему кислоты составляет 1:5 или 1:7. Максимальные сроки деминерализации не превышают 4-5 суток при температуре 5-7°С, оптимальные составляют 2-3 дня. Рабочий раствор меняют ежедневно, желательно его перемешивание. Далее материал выдерживают 1-1,5 часа в дистиллированной воде, а затем 0,5-1 час в физиологическом растворе. Затем, без соблюдения асептики, материал помещают в тару и заливают 0,25%-ным раствором нейтрального формалина с канамицином из расчета 0,5 г на литр. Срок стерилизации при 5-7°С не менее 7 суток, оптимальное время хранения препаратов до операции - 3 месяца, максимальное - до 6.
Пятый способ описан в работах R. von Versen [40] и K. Denner, R. von Versen [20]. После механического удаления мягких тканей с костей их распиливают на сегменты 5-8 см. Сегменты многократно промывают и помещают в жидкий азот для замораживания. Замороженная кость становится хрупкой и легко поддается размельчению с помощью костной электрической мельницы. После обезжиривания и высушивания на воздухе костную ткань вновь размельчают и повторно обезжиривают смесью хлороформа и этанола (или метанола) при температуре 4°С и постоянном встряхивании со сменой экстрагирующей среды через 25 и 60 минут. Описанный процесс продолжается 2 часа. Затем материал просеивают через сито с величиной отверстий 315 мкм. Деминерализацию проводят в соляной кислоте при 4°С (0,6 моль/литр) в течение 4 часов при постоянном встряхивании. Соотношение объема костной стружки к объему соляной кислоты 1:50. После деминерализации материал многократно промывают в растворе Се-ренсена. Стерилизацию осуществляют двумя объемами 5%-ной надуксусной кислоты, одного объема этанола и одного - дистиллированной воды в закрытой системе при пониженном давлении и постоянном встряхивании в течение 4 часов. Отношение деминерализованного костного порошка к стерилизующему раствору составляет 1:4. После стерилизации порошок не менее 3-х раз промывают раствором Серенсена и изотоническим раствором хлорида натрия. Полученный материал раскладывают в стеклянные банки в асептических условиях. После лиофи-лизации банки опечатывают и хранят при комнатной температуре в течение нескольких лет.
Таким образом, представленные выше способы изготовления ДКТ основаны на обязательном
использовании соляной кислоты. В своих работах M. Urist [35], K. van de Putte, M. Urist [38] указывали на нежелательность применения других кислот из-за снижения остеоиндуктивных возможностей ДКТ. Однако, в исследованиях В.И. Савельева, Н.В. Хлебовича [9], показана принципиальная возможность успешного применения бромистоводородной кислоты для деминерализации костной ткани. Проведенные эктопические пересадки на крысах и ортотопи-ческие пересадки на кроликах показали, что заготовленные с помощью данной кислоты костные аллотрансплантаты, не уступают по своим клиническим качествам трансплантатам, полученным с помощью соляной кислоты. Следовательно, проблема поиска наиболее совершенного способа деминерализованной костной ткани для трансплантации продолжает оставаться открытой. То же самое можно сказать и в отношении способов стерилизации ДКТ. В России с этой целью получили наибольшее распространение альдегиды и антибиотики. Значительно шире в мире для стерилизации ДКТ используют окись этилена. Однако вопрос о целесообразности ее применения не нашел однозначного ответа. По крайней мере E. Munting с соавторами [28], A. Zislis с соавторами [41] в своих исследованиях обнаружили, что окись этилена подавляет остеоиндук-цию, тогда как M. Urist [36], H. Iwata с соавторами [23], P. Kohler, A. Kreicbergs [25], T. Lovell с соавторами [26], T. Moore с соавторами [27] не наблюдали подобного эффекта. T. Moore с соавторами [27] считают, что авторы, наблюдавшие отрицательные результаты, не учитывали ряда особенностей окиси этилена как стерилизующего агента и не придавали принципиального значения процессу ее дегазации из трансплантатов. Кроме того, рабочая концентрация окиси этилена у них не всегда была однозначной. Не следует забывать и о высоких температурных различиях, поскольку морфогенетические белки-индукторы чувствительны к нагреванию. Авторы настоятельно рекомендуют перед стерилизацией тщательно обезжиривать и максимально обезвоживать пластический материал. Производственный стандарт США допускает максимум 5%-ной гравиметрической влаги. В тканевом банке Тихоокеанского побережья (США) применяется оригинальная методика обработки ДКТ окисью этилена, разработанная E.M. Gendler [21]. Перед стерилизацией в промышленно выпускаемых камерах ДКТ частично дегидратируют в этане. Стерилизация осуществляется 12%-ной окисью этилена при 25°С в течение 12 часов. Далее производят десятикратную откачку отработанного газа, чередуя откачивание с запуском воздуха через антимикробный фильтр. Затем материал замораживают и лиофилизируют. Сушка длит-
ся 5-7 суток. По данным автора, при такой обработке влажность в ДКТ не превышает 2% гравиметрических единиц, а содержание окиси этилена настолько мало, что не оказывает никакого вредоносного действия на остеоиндуктивные свойства деминерализованного костного трансплантата.
Возможность применения ионизирующей радиации как стерилизующего фактора, в свою очередь, вызывает споры из-за недостаточной обеспеченности учреждений лучевыми источниками, надежной защитой от них и слабой теоретической разработкой данной проблемы. Так, работы K. Buring, M. Urist [18], а затем A. Varlet с соавторами [39] показали, что лучи 60Со полностью уничтожают остеоиндуктивную активность материала как в бактерицидных, так и фунгицид-ных дозах. E. Munting с соавторами [28] считают возможным применение гамма-излучения радиоактивного кобальта для стерилизации ДКТ. По их данным остеоиндуктивная функция ДКТ снижается незначительно. Таким образом, и здесь необходимы дальнейшие исследования.
Что касается консервации ДКТ, то на сегодняшний день обозначились следующие направления. За рубежом отдается предпочтение лиофилизации, у нас - замораживанию и жидким средам. Оба способа имеют положительные и отрицательные стороны. В.С. Ягодовский [16], В.И. Говалло [2], С.С. Фейгельман [15], E. Munting с соавторами [28], L. Schweiberer с соавторами [32] категорически возражают против применения формалина как консерванта при заготовке костного материала. Однако, В.И. Савельев [10] указывает на длительное и успешное применение 0,25%-ного раствора формалина с антибиотиками. Автор считает, что чем ниже содержание формальдегида в деминерализованной кости, тем слабее воспалительная реакция на нее со стороны окружающих тканей, тем больше шансов на индукционный остеоге-нез в области пересадки.
Широкое применение альдегидов (формолово-го и глютарового) для консервации ДКТ встречается в работах сотрудников Гродненского государственного медицинского университета С.И. Болт-рукевича с соавторами [1], А. В. Калугина [3], который указывает на высокую эффективность применения деминерализованного костного мат-рикса, консервированного в смеси растворов альдегидов, в хирургическом лечении дефектов трубчатых костей, особенно в инфицированной ране. В работе П.А. Скрипнюка с соавторами [13] предложен метод обработки деминерализованной кости, сущность которого заключается в вакуу-мировании ДКТ, залитого изотоническим раство-
ром. Проводится трехкратное отмывание материала со сменой раствора. Авторы, используя метод вакуумирования, предлагают насыщать деминерализованный костный материал антибиотиками. Они считают, что обработка деминерализованных костных трансплантатов с использованием вакуумирования улучшает остеогенные свойства ДКТ, что имеет существенное значение для профилактики послеоперационных гнойных осложнений.
Из других консервирующих средств заслуживают упоминания этиловый спирт и инертные газы. Спирт довольно широко используется для сохранения ДКТ при проведении экспериментальных исследований или при получении небольших по объему фрагментов.
В зарубежной литературе появилось достаточное количество работ по сублимационной сушке из замороженного состояния (лиофилизации). Преимущество данного способа состоит в том, что лиофилизированные ДКТ можно хранить продолжительное время в вакуумной упаковке при комнатной температуре. В нашей стране лиофи-лизация практически не применяется из-за отсутствия специального оборудования. В.И. Савельев [8] предложил методику замещения воды из замороженного состояния химическим путем с целью дегидратации деминерализованной кости без утраты ее полезных качеств.
Большой интерес для консервации ДКТ представляет применение низких температур. Этот метод получил широкое распространение в биологии и медицине, однако при заготовке ДКТ их возможности изучены слабо, особенно, если иметь ввиду способы дефростации.
Возможность консервации в инертных газах можно рассматривать пока только теоретически. Известно, что гелий, ксенон, аргон и другие инертные газы легко проникают в ткани, вытесняют из них кислород и стабилизируют морфологические структуры. Это может иметь принципиальное значение при заготовке ДКТ.
Таким образом, можно заключить, что деминерализованные костные трансплантаты и способы их заготовки продолжают быть в центре внимания специалистов, заинтересованных в получении костно-пластического материала с максимально сохраненными в нем лечебными качествами. Сейчас трудно сказать, какой из приведенных выше способов изготовления ДКТ является наиболее оптимальным с клинической точки зрения, поскольку отсутствуют данные их сравнительной оценки. Однако очевидно, что поиски, направленные на совершенствование известных и разработку новых способов изготовления, стерилизации и консервации ДКТ должны быть продолжены.
Литература
1. Болтрукевич С.И. Современная концепция заготовки, стерилизации и консервации биологических тканей для трансплантации / С.И. Болтрукевич,
A.B. Калугин, И.П. Богданович // Актуальные вопросы имплантологии в травматологии и ортопедии: Матер. Междунар. науч.-практ. конф. — Гродно, 2000. - С. 6-16.
2. Говалло В.И. Трансплантация тканей в клинике /
B.И. Говалло - Л.: Медицина, 1979. - 287 с.
3. Калугин A.B. Применение консервированного в альдегидах костного матрикса в хирургическом лечении дефектов трубчатых костей / A.B. Калугин // Актуальные вопросы имплантологии в травматологии и ортопедии: Матер. междунар. научно-практич. конфер. — Гродно, 2000. — С. 48-50.
4. Кирилова И.А. Вариант стимулированного остеоге-неза в эксперименте / И.А. Кирилова, Н.Г. Фоми-чев, Ю.В. Этитейн, В.Т. Подорожная // Биоимплантология на пороге XXI века: Симпозиум по проблемам тканевых банков с междунар. участием. -М., 2001. - С. 44-45.
5. Осепян А.И. Применение костного матрикса с целью стимуляции остеогенеза в условиях раневой инфекции / А.И. Осепян, В.П. Айвазян // Ортопедия, травматология. - 1985, № 1. - С. 45-46.
6. Осепян А.И. Стимуляция репаративного остеоге-неза в условиях хронической гнойной инфекции имплантацией костного матрикса / А.И. Осепян, В.П. Айвазян, В.В. Козлова // Вестн. хирургии. -1986. - № 3. - С. 95-97.
7. Савельев В.И. Деминерализованная кость как особая разновидность костно-пластического материала / В.И. Савельев // Заготовка и пересадка деминерализованной костной ткани в эксперименте и клинике. - Л., 1983. - С. 3-12.
8. Савельев В.И. Опыт заготовки и применения деминерализованных костных трансплантатов / В.И. Савельев // Трансплантация деминерализованной костной ткани при патологии опорно-двигательной системы. - Л., 1990. - С. 4-22.
9. Савельев В. И. Первый опыт оценки индуктивных свойств костных трансплантатов, деминерализованных ортофосфорной кислотой / В.И. Савельев, Н.В. Хлебович // Деминерализованный костный трансплантат и его применение. - СПб., 1993.
- С. 125-129.
10. Савельев В.И. Получение и сохранение деминера-лизованиой костной ткани для клинического применения / В.И. Савельев // Деминерализованные костные трансплантаты и их использование в восстановительной хирургии: Сборник научных работ.
- СПб., 1996. - С. 3-12.
11. Савельев В.И. Опыт заготовки и применения деминерализованных костных аллотрансплантатов / В.И. Савельев, Д.Е. Иванкин, А.В. Калинин // Актуальные вопросы имплантологии в травматологии и ортопедии: Матер. междунар. научно-практ. кон-фер. - Гродно, 2000. - С. 32-36.
12. Савельев В.И. Технологии изготовления и экспериментально-клинического применения деминерализованных костных трансплантатов / В.И. Савельев, Н.В. Корнилов, Д.Е. Иванкин и др. // Биоимплантология на пороге XXI века: Симпозиум по проблемам тканевых банков с междунар. участием. - М., 2001. - С. 27-28.
13. Скрипнюк П. А. Использование вакуумирования в процессе приготовления и применения деминерализованных костных трансплантатов / П.А. Скрип-нюк, В.М. Кривенко, М.В. Дмитриенко // Деминерализованные костные трансплантаты и их использование в восстановительной хирургии: Сборник научных работ - СПб., 1996. - С. 106-109.
14. Ханин А.А. Эктопический остеогенез в формали-низированном матриксе / А.А. Ханин, А.В. Тево-
сянц, Д.В. Мелик-Танчян // Ортопедия, травматология. - 1978. —№ 8 - С. 41-45.
15. Фейгельман С.С. О видимости сохранения жизни в тканях, консервированных в слабых растворах формалина / С.С. Фейгельман // Ортопедия, травматология. - 1980. - №1 2. - С. 45-50.
16. Ягодовский В.С. К вопросу о действии слабых растворов формалина на биологические ткани / В.С. Ягодовский. - Волгоград, 1975. - С. 46-50.
17. Adkisson H. D. Rapid quantitative bioassay of osteoinduction / H.D. Adkisson, J. Strauss-Schoenberger, M. Gillis et al. // J. Orthop. Res. - 2000. - Vol.18, N 3.
- P. 503-511.
18. Buring K. Effects of ionizing radiation on the bone induction principle in the matrix of bone implants / K. Buring, M.R. Urist // Clin. Orthop. - 1967. - N 55. - P. 225.
19. Carnes D.L. Evaluation of 2 novel approaches for assessing the ability of demineralized freeze-dried bone allograft to induce new bone formation / D.L. Carnes, J. de la Fontaine, D.L. Cochrane et al. // J. Periodontal.
- 1999. - Vol. 70, N 4. - P. 353-363.
20. Denner K. Demineralizierten Knochenmatrix-tierexperimentelle Untersuchungen und erste klinische Erfahrungen / K. Denner, R.von Versen // Habilitationsschrift Medizinische Fakultat der Humboldt-Universitat, Berlin, 1991. - 318 s.
21. Gendler E. Perforated demineralized bone matrix: a new form of osteoinductive biomaterial / E. Gendler // J. Biomed.Mat.Res. - 1986. - Vol.20, N 6. - P. 687-696.
22. Huggins C. Transformation of fibroblasts by allogenic and xenogenic transplants of demineralized tooth and bone / C. Huggins // J. Exp.Med. - 1970. - Vol.132, N 8 - P. 1250-1258.
23. Iwata H. Chemosterilized autolysed antigen-extracted allogeneic (A. A. A.) bone matrix gelatin for repair of defects from excision of benign-bone tumors / H. Iwata, H. Hanamura, M. Kaneko et al. // Clin. Orthop. -1981. - N 154. - P. 150-155.
24. Kale A.A. Effect of demineralized bone matrix on polymorphonuclear leukocyte degranulation / A.A. Kale, R. Clancy, M.P. Leslie, P.E. di Cesare // J. Orthop. Res.
- 1999. - Vol.17, N 4. - P. 598-606.
25. Kohler P. Incorporation of autoclaved autogencic bone supplemented with allogeneic demineralized bone matrix. An experimental study in the rabbit / P. Kohler, A. Kreicbergs // Clin. Orthop. - 1987. - N 218. -P. 247-258.
26. Lovell T.P. Augmintalion of spiral fusion with bone morohogenetic protein in ogs / T.P. Lovell, E.G. Dawson, O.S. Nilsson, M.R. Urist // Clin. Orthop. - 1989.
- N 243. - P. 266.
27. Moore T.M. Influence of post-mortem time and temperature on osteoinductive activity of deminerlized microperforated ethylene oxide-sterilized syngeneic bone implant in the rat / T.M. Moore, R. Artal, E. Gendler // Clin. Orthop. - 1990. -N 259. - P. 239.
28. Munting E. Effect of sterilization on osteoinduction / E. Munting, J. Wilmart, A.Wijne et al. // Acta Orthop. Scand. - 1988. - Vol. 59, N 1. - P. 34.
29. Reddi A.H. Biochemical sequences in the transformation of normal fibroblasts in adolescent rats / A.H. Reddi, C. Huggins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
- 1972. - Vol. 69. - P. 1601-1605.
30. Reddi A.H. Collagenous bone matrix-induced endochondral ossification and hemopoiesis / A.H. Reddi, W.A. Anderson // J. Cell. Biol. - 1976. - Vol. 69. -P. 557-572.
31. Reddi A.H. Morphogenesis and tissue engineering of bone and cartilage: inductive signals, stem cells, and biomimetic biomaterials / A.H. Reddi // J. Tissue Eng.
- 2000. - Vol.6, N 4. - P.351-359.
32. Schweiberer L. Historical review bone transplantation / L. Schweiberer, H. Stutzie, H.K. Mandelow // Arch. Orthop. Traum. - 1989. - Vol. 109. - P. 1-8.
33. Stevenson S. Enhancement of fracture healing with autogenous and allogeneic bone grafts / S. Stevenson // Clin. Orthop. - 1998. - N 355. - P. 239-246.
34. Stutzle H. Bone regeneration stimulated by bone substitute materials / H. Stutzle, K. Hallfeldt, H. Man-delkow et al. // Orthopade. - 1998. - Bd. 27, H. 2.
- S. 118-125.
35. Urist M.R. Bone: formation by autoinduction / M.R. Urist // Science - 1965. - Vol.150. - P. 893-899.
36. Urist M. R. Surface - decalcified allogeneic bone (SDAB) implants / M.R. Urist // Clin. Orthop. - 1968.
- N 56. - P. 37-50.
37. Urist M.R. Bone morphogenesis in implants of insoluble bone gelatin / M.R. Urist, H. Ywata, P. L. Ceccotti et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1973. - Vol. 70. -P. 3511-3515.
38. van de Putte K.A. Osteogenesis in the interior of implants of decalcified bone matrix / K.A. van de Putte, M.R.Urist // Clin. Orthop. - 1966. - Vol. 43.
- P. 257-270.
39. Varlet A. Osteogenese induite par l'addition de matirce osseuse demineralisee a des billes de peatre aus antibiotiques / A.Varlet, M.Hungrez, Ph.Danchy // Rev. Chir. Orthop. - 1985. - Vol. 71, N 2. - P. 73-78.
40. Von Versen R. Verfahren zur Preparation demi-neralisierter Knochenmatrix / R. von Versen, K. Den-ner, B. Freistedt et al. // Z. Med. Lab. Diagn. - 1989.
- Bd. 30. - S. 154-158.
41. Zislis A. A scanning electron microscopic study of in vitro toxicity of ethylene oxide sterilized bode repair materials / A. Zislis // J. Oral Implant. - 1989. -Vol. 15. - P. 41-46.
