CC BY
99
УДК 543.544.5.068.7/543.51/615.322/615.074
СОВРЕМЕННЫЕ СПОСОБЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИНСЕНОЗИДОВ
И.А. Родин, А.Н. Ставрианиди, А.В. Браун, О.А. Шпигун
(кафедра аналитической химии, e-mail: stavrianidi.andrey@gmail.com)
Гинсенозиды - основные действующие вещества растений рода Panax. Женьшень и его аналоги активно используют в производстве средств традиционной медицины в Китае, Корее, Японии, США и на Дальнем Востоке. Более 40 лет многие исследователи создавали методы идентификации и определения гинсенозидов в растительных материалах, экстрактах и коммерческих продуктах. Для выделения этих веществ из растительного сырья применяли разные виды экстракции. Разделение гинсенозидов проводили с помощью таких методов, как газовая хроматография, тонкослойная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Преимущественно использовали метод ВЭЖХ. Для определения гинсенозидов в сочетании с ВЭЖХ применяли спектрофотометрическое и флуоресцентное детектирование, а позднее детектирование по светорассеянию и масс-спектрометрическое. Наиболее поздние варианты этих методов приведены в данном обзоре с критической оценкой опубликованных результатов.
Ключевые слова: гинсенозиды, Panax ginseng, высокоэффективная жидкостная хроматография, биоактивные вещества.
Гинсенозиды относятся к классу тритерпеновых сапонинов и являются основными биоактивными компонентами наиболее распространенного растения, используемого в восточной традиционной медицине (ТМ) - женьшеня (род Panax). Наиболее часто такие лекарственные средства изготавливают на основе P. ginseng (Корея), P. Quinquefolius (США), P. notoginseng (Китай и Япония), P. vietnamensis (Вьетнам) и P. japonicas (Япония). На сегодняшний день наиболее изучен корейский женьшень, который использовали в Азии на протяжении 5 000 лет в качестве тоника и средства, продлевающего жизнь [1]. В настоящее время женьшень применяют в основном как общеукрепляющее средство и для увеличения сопротивляемости организма физическому, химическому и биологическому стрессу [2, 3]. Это свойство женьшеня, называемое «адаптогенностью», часто упоминают в литературе, посвященной альтернативной медицине [4, 5].
Обнаруженные в клинических и лабораторных испытаниях способность модулировать иммунную систему, а также антистрессовая и антигипергликеми-ческая активность - наиболее существенные черты препаратов на основе женьшеня. Более того, многие современные предклинические и клинические исследования указывают на существование противораковых свойств таких препаратов [6, 7].
Основными компонентами женьшеня, отвечающими за его лечебные свойства, являются гинсенозиды. На данный момент более 620 гинсенозидов было выделено из растений рода Panax [8]. Молекула любого гинсенозида состоит из основания (сапогенина) и сахаридных боковых цепей, которые, в свою очередь, также могут иметь заместители более простой структуры, например малонил [9] (рис. 1). Наиболее распространены гинсенозиды с протопанаксатриоль-ными (PPT), протопанаксадиольными (PPD) и ок-тиллольными (OT) сапогенинами [10]. Чуть меньше известно на данный момент гинсенозидов с олеано-ловым кислотным (OA) сапогенином или с сапогенинами с вариациями в боковой цепи в положении С17 и другими неизвестными сапогенинами [8].
Поскольку женьшень - одно из самых популярных во всем мире растений, используемых в фитомедици-не, огромное число работ было выполнено в последние 40 лет с целью разработать аналитические методы идентификации, количественной оценки содержания и контроля качества гинсенозидов в растительном сырье, экстрактах и коммерческих продуктах. Одной из основных задач таких исследований была дифференциация гинсенозидных паттернов для разных представителей рода Panax, чтобы избежать фальсификации и неверной идентификации. Кроме того, изучено влияние традиционных способов переработки корней
Сапогенины
к2о
оьи
РРТ: 476
РРБ: 460
ОА: 456
58 Ба \ ОН
А1: 444
ОБЦ
А2-а: К2 = Н, 458
А2-Ь: Я2 = ОН, 474
АЗ: 474
В1-а: Щ = Н, 458
НО. -Ю2 1)а
ОН3^Х он
он
-88 Ба/ ОН
В1-Ь: Я2 = ОН, 474 В2-а: Я2 = Н, 494 В2-Ь: Я2 = ОН, 510
-58 Ба
К3° , -100 Ба
ОН
ВЗ-а: Щ = Н, 476
ВЗ-Ь: Я2 = ОН, 492
В4-а: Щ = Н, 476
Рис. 1. Структуры составных частей молекул гинсенозидов
Рис. 1. (продолжение). Структуры составных частей молекул гинсенозидов
Сахаридные остатки
но но
но
он
Glc
СООН
u ОН GluA
ОН
НО
он Ага(р)
OR
,—^OvOR НО yj но он
Ara (/)
OR
НО Rha
HH°0-^OR
ОН
Xyl
о
л,
о
о
Заместители О
R ^ R ^ R
Ацетил Акрилоил Бутеноил Декадиеноил О О О
R HO^^R
Деценоил Гептеноил
О о
R
Гексеноил Малонил Ноненоил Октеноил
Рис. 1. (окончание). Структуры составных частей молекул гинсенозидов
P. ginseng на гинсенозидный состав получаемого продукта (красный и белый женьшень). В последние 30 лет наиболее популярным методом определения гинсенозидов стала высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Вне зависимости от метода детектирования безэталонный анализ гинсенозидов трудно выполнить из-за обширных возможностей их изомерии. Помимо изомерии сапогенина и заместителей в молекулах большинства гинсенозидов присутствует хиральный атом углерода С20, что также влияет на фармакологические свойства лекарственных препаратов на их основе [11]. Изучая механизмы биологической активности гинсенозидов и развивая методы их определения, исследователи сталкиваются с проблемой трудной доступности стандартных образцов этих веществ в достаточных количествах [12]. Таким образом, дальнейшее изучение влияния гин-сенозидов на живые организмы напрямую зависит от развития методов выделения, разделения, идентификации и определения гинсенозидов в разных объектах. Цель данного обзора - выделить основные достижения и тенденции в современном анализе гин-сенозидов.
Виды женьшеня
Panax ginseng (азиатский женьшень, известный также как китайский или корейский женьшень; семейство Araliaceae) - растение, обладающее большим лечебным потенциалом. Этот вид произрастает на высокогорьях Маньчжурии (область между Китаем и Кореей). Куст Panax ginseng достигает порядка 50 см в высоту, крона состоит из темно-зеленых вертикальных листьев и небольших зеленых цветов,
развивающихся в яркие красные ягоды [13]. Б0льшую часть сырого растительного материала получают в Южной Корее, где женьшень выращивают под соломенными тентами. Когда возраст растения достигает 4-6 лет, разросшийся до 8-20 см корень, толщиной 2 см, выкапывают. Тонкие части стержневого корня и ответвления отрезают, затем корень промывают и снимают верхний слой. При высушивании под солнцем получается белый женьшень, а при обработке паром с последующей сушкой и дополнительным высушивании на солнце получается красный женьшень с гладкой поверхностью.
P. quinquefolium (американский женьшень), менее крупный по сравнению с азиатским, использовался коренными жителями Америки для лечения разных заболеваний. В данный момент его производство в США, Канаде и северо-восточном Китае составляет более 1000 т сухого корня в год.
P. japonicus (японский женьшень) японские врачеватели часто используют в лечебных целях, однако этот вид содержит меньше активных ингредиентов (гинсенозидов), чем P. ginseng.
P notoginseng F. H. Chen (нотоженьшень или san qi) также хорошо известен и используется в китайской ТМ. Он эффективен при лечении гомеостаза, питает кровь и лечит коронарный тромбоз [13, 14].
Одним из подвидов P pseudoginseng является Hi-malaicus (гималайский женьшень), который жители Гималаев используют для стимуляции аппетита и лучшего пищеварения. Лечебный потенциал этого растения значительно ниже, чем P. ginseng.
P trifolius (карликовый женьшень) - редкий подвид американского женьшеня, обычно встречается в
Северной Америке. Коренные американцы использовали P. trifolius для лечения головной боли, кашля, несварения и других заболеваний.
Eleutherococcus senticosus (сибирский женьшень) не принадлежит к роду Panax, по этой причине его даже не считают настоящим женьшенем, несмотря на то что он принадлежит к семейству Araliaceae. Сибирский женьшень чаще всего используют как более дешевый и оказывающий ослабленное действие аналог P. ginseng.
В силу широкого применения женьшеня в медицине возникла необходимость аутентификации его видов. Для идентификации азиатского [15] и американского [16] видов женьшеня были выбраны гин-сенозид Rf и 24(Я)-псевдогинсенозид F11. Генетические подходы к аутентификации видов женьшеня, описанные в работе [17], включают такие методы, как анализ случайно амплификацированной полиморфной ДНК, а также ДНК-дактилоскопия с использованием зондов мульти-локусов, полиморфизма длины фрагментов-рестрикторов, эффекта усиления длины фрагмента полиморфизма и микроспутниковой технологии. Более того, авторам удалось разработать в рамках выбранной технологии набор микроспутниковых маркеров, позволяющих отличать азиатский и американский виды женьшеня.
Химический состав женьшеня
Из корня женьшеня выделено несколько классов соединений. Они включают тритерпеновые сапонины, основные полиацетилены и сесквитерпены, полисахариды, пептидогликан и его аналоги, азотсодержащие органические соединения и другие широко распространенные соединения, например, жирные кислоты, углеводороды и фенолы [4]. Как было отмечено выше, за фармокологические свойства женьшеня отвечают тритерпеновые сапонины. На данный момент после открытия более 400 новых структур гинсенозидов [8] появилась необходимость не только в выделении достаточных количеств этих веществ из растительных материалов для подтверждения их структуры такими методами, как спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), но и в создании подробной классификации данной группы соединений и их аналогов, а также методов быстрой идентификации и определения гинсенозидов в лекарственных средствах и других продуктах на основе женьшеня. Также необходимо изучить влияние, которое могут оказывать на организм гинсенозиды, присутствующие в растительном сырье в относительно малом количестве. Вначале номенклатура гинсенози-
дов основывалась на их подвижности на подложках для тонкослойной хроматографии (ТСХ), а индекс давался в соответствии с уменьшением полярности от «а» до «h». Это свойство коррелировало с числом моносахаридных остатков в боковых сахаридных цепях. В приложении к работе [8] использована система сокращенных обозначений молекул гинсенозидов вида: S-20-R1-6-R2-3-R3, где S - сапогенин, а R1, R2 и R3 - заместители в виде последовательности сокращенных названий сахаридных остатков и радикалов (рис. 1). Такая запись, безусловно, отражает больше информации о строении гинсенозида, чем тривиальное название (Rb1, Rg1 и др.), кроме того, известно, что биологическая активность этих соединений зависит от длины и положения сахаридных заместителей и строения боковой цепи при атоме С17 (разного у различных сапогенинов). В табл. 1 представлены сокращенные обозначения самых распространенных гинсенозидов.
Стандартизованные экстракты из женьшеня коммерчески доступны [12], например, общедоступны экстракты G115 из P. ginseng (содержание гинсенозидов около 4%) («Pharmaton SA», Швейцария) и NAGE из P. quinquefolius (содержание гинсенозидов около 10%) («Canadian Phytopharmaceuticals Corporation», Канада). ВЭЖХ-исследование этих двух экстрактов показало, что гинсенозиды Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re и Rg1 присутствуют и в G115, и в NAGE, а гинсенозид Rg2 содержится только в G115. В G115 содержание Rg1 выше, но в NAGE больше гинсенозидов Rb1 и Re [18-20]. Из экономических соображений данные вещества можно производить с использованием клеточных структур. Эти подходы хорошо описаны в [21].
Извлечение гинсенозидов из растительного сырья
Предложено много методов экстракции гинсено-зидов из растительного сырья. В большинстве подходов использовали метанол и этанол, а также их водные смеси. Использование смесей метанола и воды вместо чистого метанола оказалось более эффективным для выделения и отчистки гинсенозидов [22]. Исследовано влияние температуры [23-26], ультразвука [27-30] и высокого давления [31] на процесс экстракции гинсенозидов. Доказано, что нагревание во время экстракции приводит к разрушению нестабильных малонил-гинсенозидов и превращению их в соответствующие незамещенные гинсенозиды. Показано [27], что частичное (50%) разложение гинсено-зидов происходило уже через 5 ч экстракции метанолом в аппарате Сокслета, а для полного превращения
Т а б л и ц а 1
Сокращенные обозначения и формулы основных гинсенозидов
Гинсенозид(тривиальное название) Обозначение Формула
Яа1 РРБ-20-01с-Лга(р)-Ху1-3-01с-01с С58И98025
Яа2 РРБ-20-01с-Лга©-Ху1-3-01с-01с С58И98025
Яа3 РРБ-20-01с-01с-Ху1-3-01с-01с С59И100027
ЯЪ1 РРБ-20-01с-01с-3-01с-01с С И 0 54 92 23
ЯЪ2 РРБ-20-01с-Лга(р)-3-01с-01с С И 0 53 90 22
ЯЪ3 РРБ-20-01с-Ху1-3-01с-01с С И 0 53 90 22
Яс РРБ-20-01с-Лга©-3-01с-01с С53И90022
яа РРБ-20-01с-3-01с-01с С48И82018
ЯЕ3 РРБ-20-И-3-01с-01с С42И72013
ЯЬ2 РРБ-20-И-3-01с С34И6208
РРБ-20-И-3-01с-01с-Лс С44И74014
шЯЪ1 РРБ-20-01с-01с-3-01с-01с-Ма1 С И 0 57 94 26
шЯЪ2 РРБ-20-01с-Лга(р)-3-01с-01с-Ма1 С И 0 56 92 25
шЯс РРБ-20-01с-Лга©-3-01с-01с-Ма1 С И 0 56 92 25
шяа РРБ-20-01с-3-01с-01с-Ма1 С51И84021
Б2 РРБ-20-01с-3-01с С42И72013
РРБ-20-01с-Лга(р)-3-01с-01с-Лс С55И92023
Псевдо-ЯС1 РРБ-20-01с-3-01с-01с-Лс С50И84019
ЯЪ1 РРТ-20-И-6-в1с-3-И С36И6209
ЯЕ1 РРТ-20-01с-6-01с-3-И С И 0 42 72 14
ИГ РРТ-20-И-6-01с-в1с-3-И С И 0 42 72 14
ЯЕ2 РРТ-20-И-6-в1с-КЬа-3-И С42И72013
Яе РРТ-20-01с-6-01с-РМ-3-И С48И82018
РРТ-20-в1с-6-И-3-И С36И6209
Б3 РРТ-20-в1с-Лга(р)-6-И-3-И С47И70013
Псевдо-Б11 0Т-6-01с-РМ С И 0 42 72 14
Псевдо-ЯТ5 0Т-6-в1с С И 0 ^36П62^10
Яо 0Л-3-01иЛ-в1с С И 0 48 76 19
Р4(Ям4) Б7-Ъ-6-01с-КЬа-3-И С И 0 42 70 12
Б7-а-3-01с-01с С42И70012
Б7-а-3-в1с С36И6007
ИМ Б7-Ъ-6-в1с-3-И С36И6008
Б7-а-3-01с-01с-Лс С44И72013
ЯЕб 18оБ7-6-в1с-КЬа-3-И С И 0 42 70 12
Як2 18оБ7-а-3-в1с С36И6007
Як1 18оБ7-а-3-01с-в1с С И 0 42 70 12
Як3 18оБ7-Ъ-6-в1с-3-И С36И6008
18оБ7-Ъ-6-И-3-01с-Лс С38И62013
18оБ7-а-3-01с-01с-Лс С44И72013
необходимо порядка 20 ч. Для одновременного выделения и определения ацилзамещенных и незамещенных гинсенозидов в корнях растения P. ginseng предложен метод последовательной ультразвуковой экстракции (15 мин) смесью этанол:вода (40:60) при перемешивании в течение 4 ч с последующим определением методом ВЭЖХ с испарительным детектированием по светорассеянию (ИДСР) [28]. Для экстракции гинсенозидов в исследовательских целях вместо метанола можно использовать n-бутанол [32].
Проведено сравнение четырех методов экстракции (А, Б, В, Г) по степени извлечения для шести наиболее распространенных гинсенозидов (Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re и Rg1) из корней P. Quinquefolius [33].
Метод A. Ультразвуковая экстракция метанолом при комнатной температуре.
Метод Б. Экстракция 70%-м метанолом при комнатной температуре.
Метод В. Экстракция водой при 90°C без перемешивания.
Метод Г. Перемешивание при 60°C в метаноле.
Полученные образцы отфильтровывали и анализировали методом ВЭЖХ с детектированием в УФ -области. Метод Г позволил добиться наибольших коэффициентов извлечения всех гинсенозидов, кроме Rg1. Метод В оказался на втором месте по эффективности. Ультразвуковую экстракцию (3^30 мин) метанолом применяют для контроля качества коммерчески доступных препаратов на основе американского и азиатского видов женьшеня, проверяя содержание гинсенозидов Rb1, Rb2, Rc, Re, Rg1 и Rd [29, 30]. Экстракция смесью метанол:вода (30:70) при 50°C в течение 30 мин оказалась менее эффективной, чем ультразвуковая экстракция [30]. Разработаны специальные методы экстракции аналитов из гелей, жидких экстрактов, таблеток и каплет (овальных таблеток, покрытых оболочкой) [30]. Показано [34], что ультразвуковая экстракция сапонинов из корней женьшеня эффективнее экстракции в аппарате Сокслета. Кроме валового содержания продуктов экстракции, было определено количество каждого извлеченного гин-сенозида (Rb1, Rb2, Rc, Rd и Rf) при использовании ультразвуковой бани и ультразвукового экстрактора. Проанализированы образцы американского, китайского и корейского видов красного женьшеня, а также суспензии гинсенозидов в клеточных культурах. В большинстве случаев ультразвуковую экстракцию проводили при меньших температурах, что позволило избежать разложения термически нестойких ингредиентов растительного сырья. То, что температу-
ра является действительно важным фактором, может быть проиллюстрировано на примере формирования гинсенозидов Rg3 и ИЪ2. Они ценятся за свои биологические свойства и в основном содержатся в образцах корней красного корейского женьшеня. Доказано, что данные гинсенозиды не входят в состав натурального североамериканского женьшеня, они образуются в результате термообработки при экстракции из гинсенозидов ЯЬ1 и Яс, присутствующих в больших количествах [35]. В [35] приведены детально разобранные масс-спектральные данные компонентов экстрактов из корней и листьев, полученные с применением ионизации электрораспылением (ИЭР) в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов. Также не следует забывать об артефактах, таких как формирование искусственных метаболитов, например, сапогенинов протопанаксадиола и протопанак-сатриола при кислотном гидролизе [4].
Микроволновая экстракция гинсенозидов Rg1 и ЯЬ1 в течение 15 мин оказалась более эффективной, чем десятичасовая последовательная экстракция тем же объемом растворителя [36]. Оптимизированы состав экстрагента (смесь воды и метанола), время экстракции (1-15 мин) и мощность микроволнового излучения (30-150 Вт). Содержание гинсенозидов рассчитывали с помощью ВЭЖХ. Микроволновую экстракцию гинсенозидов оптимизировали в работе [37]. Специальный микроволновый экстрактор (300 Вт) с частотой излучения 2450 МГц использовали для экстракции при 72°С (4 повтора по 30 с). Эффективность извлечения ЯЬ1, ЯЬ2, Яс, Яа и Rg1 была сравнима с выходами при двенадцатичасовой экстракции растворителем того же состава (80%-й метанол) и при той же температуре.
Теоретически сверхкритическая флюидная экстракция (СФЭ) позволяет сэкономить время экстракции и расход органического растворителя, а также использовать меньшие значения таких параметров, как концентрация и температура [38]. Проведено сравнение эффективности суб- и сверхкритической экстракции из корней женьшеня гинсенозидов ЯЬ1, ЯЬ2, Яс, Яа, Яе, Rg1 и природных масел диоксидом углерода в аппарате Сокслета и ультразвуковой бане [39]. Доказано, что СФЭ диоксидом углерода с добавкой 6 мол.% этанола дает лучшие результаты, чем СФЭ чистым диоксидом углерода. Необходимо заметить, что чистый диоксид углерода имеет небольшой дипольный момент и поэтому плохо подходит для извлечения полярных метаболитов. Эффективность экстракции диоксидом углерода (660 л с добавкой 6 мол.%
этанола) при 31,2 МПа и 333 К оказалась такой же, как при экстракции горячей водой, но ниже, чем при экстракции этанолом в аппарате Сокслета. Метанол и диметилсульфоксид использовали в качестве добавок для изучения эффективности экстракции [40]. Несмотря на то что относительно большие концентрации добавок (27-30 ммол.%) и соответственно большие значения параметров (например, температура и давление) позволили добиться извлечения гинсенозидов до 90%, что сравнимо с результатами последовательной экстракции метанолом в аппарате Сокслета, СФЭ может быть сопряжена с последовательной жидкостной экстракцией для получения масел из отростков корня женьшеня.
Неионные поверхностно-активные вещества (ПАВ) также использовали при экстракции гинсено-зидов. ПАВ Triton X-100 с концентрацией, большей критической концентрации мицеллообразования (ККМ), продемонстрировал способность более эффективно извлекать гинсенозиды Rg1, Re, Rb1, Rc и Rd под давлением в сравнении с ультразвуковой экстракцией метанолом или чистой водой [41]. При превышении критической температуры растворы неионных ПАВ также продемонстрировали уникальную способность к расслаиванию на фазу ПАВ и маточную водную фазу. Этот принцип в комбинации с ультразвуковой экстракцией примененили для экстракции гинсенозидов в работе [42]. Все экспериментальные факторы процесса мицеллярной экстракции для исследуемых веществ были оптимизированы. Аналогичный способ расслаивания в комбинации с жидкостной экстракцией под давлением применили для предварительного концентрирования образцов [41]. При добавлении сульфата аммония разделение между фазами было более эффективным, чем при нагревании (1 ч, 78°C). Недостатком такого подхода является относительно высокая концентрация ПАВ при дальнейшем попадании раствора в ВЭЖХ-систему, что приводит к увеличению времени регенерации хроматографической колонки.
Иногда для извлечения гинсенозидов используют экстракцию с применением ионных жидкостей. Разработан способ ультразвуковой экстракции с применением ионных жидкостей на основе 1-алкил-3-метилимидазола с разным катионным и анионным составом для выделения восьми гинсенозидов (Rg1, Re, Rf, Rb1, Rc, Rb2, Rb3 и Rd) из корня женьшеня [43]. Используя оптимальный состав ионной жидкости, удалось после 20 мин экстракции добиться в 3,2 раза лучшей эффективности по сравнению с обычной ультразвуковой экстракцией.
Для разделения гинсенозидов применяли также противоточную хроматографию. Хотя в литературе подобные примеры редко встречаются, однако в некоторых случаях использование этого метода приносит положительные результаты. Так, например, в работе [44] для выделения 13 гинсенозидов (Rg1, Re, Rf, Rg2, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, Rk1, Rg5, Rg6, F4) из красного женьшеня использовали вышеуказанную методику с применением смесей хлористого метилена с метанолом и изопропанолом в разных соотношениях. Из образцов белого женьшеня было выделено 8 гинсенозидов (Rg1, Re, Rf, Rh1, Rb1, Rb2, Rc и Rd).
Определение целевых аналитов
Отдельные гинсенозиды могут быть идентифицированы методом ТСХ, например, с использованием смеси и-бутанол:этилацетат:вода (4:1:5) в качестве элюента. Гинсенозиды образуют коричневые пятна при опрыскивании смесью серной кислоты и воды (1:1) и нагревании в печи до 105°C [34]. Изучено разделение гинсенозидов методами ТСХ, высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и хроматографии в сверхсжатом слое (СССХ) [45]. Наилучшие результаты получены при использовании СССХ на силикагеле 60 со смесью хлороформ: метанол :этил-ацетат: вода: гексан (20:22:60:8:4) в качестве подвижной фазы. Результаты анализов методами ТСХ, ВЭТСХ и СССХ показали, что главное отличие заключалось в разрешении определяемых соединений. Проточный вариант СССХ оказался наиболее чувствительным методом для определения гинсенозидов.
Однако наибольшее распространение при решении задачи определения выбранного набора гинсенозидов получил метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Так, например, для определения гинсенозидов Rg1 и Rb1 в плазме крови человека разработан способ, основанный на ВЭЖХ-ИЭР-МС [46]. Разделение гинсенозидов проводили с помощью обращенно-фазовой хроматографии (колонка с сорбентом C18; 100^2,1 мм), МС-детектирование осуществляли в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов. Проводили количественную оценку содержания этих гинсенозидов, используя ионы с m/z, равным 1107,6; 799,4 и 385,2 соответственно для Rb1, Rg1 и внутреннего стандарта (3',4',5'-триметокси-7-карбометокси флавон). Диапазон линейности для данных соединений составил два порядка (от 10 до 1000 нг/мл), а соответствующая минимальная определяемая концентрация - 10 нг/мл плазмы.
Для очистки образцов от белковой фазы использовали сульфат цинка и ацетонитрил. Данный подход успешно применили в фармакокинетическом исследовании гисенозидов Rb1 и Rg1, определяя их в плазме крови человека после орального приема коммерческих препаратов на основе женьшеня. Другим примером применения этого метода является одновременное определение гинсенозида Rg3 и его метаболитов: гинсенозидов Rg1, Rg2, F1, Rh1 и прото-панаксатриола в моче испытуемых [47]. Пробоподго-товка образцов мочи включала сорбционное концентрирование, разделение проводили в градиентном режиме с использованием смеси метанола и ацетони-трила с добавкой 0,05%-й муравьиной кислоты. Диапазон линейности составлял от 0,05 до 20 нг/мл. Не удалось обнаружить только гинсенозид Rg2, остальные метаболиты в образцах мочи присутствовали. В искусственных условиях показано [48], что гинсено-зид Rh2 и протопанаксадиол являются продуктами гидролиза гинсенозида Rg3. Для установления этого факта использовали МС-детектирование на приборе с квадруполь-времяпролетной системой с ИЭР в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов. На полученных масс-спектрах наибольшей интенсивностью обладали ионы, соответствующие потере одного и двух сахаридных остатков. Однозарядный ион депротонированной молекулы глюкозы с m/z 161 присутствовал в масс-спектрах как Rg3, так и Rh2.
Другой подход на основе метода ВЭЖХ-МС предложен для одновременного определения гинсенозида Rg1, его вторичного производного гинсенозида Rh1 и их сапогенина (протопанаксатриола) в плазме крови крыс при изучении фармакокинетического поведения Rg1 после его введения в кишечник и внутривенного введения [49]. После сорбционного концентрирования и ВЭЖХ-разделения в масс-спектрах образцов присутствовали ионы молекулярных аддуктов гин-сенозидов Rg1, Rh1 и протопанаксатриола с хлором [M+Cl] , они использованы в дальнейшем при регистрации выбранных ионов. Пределы обнаружения (ПО) для Rg1, Rh1 и протопанаксатриола составляли 20, 100 и 10 пг/г соответственно. Хроматографиче-ское разделение достигалось менее чем за 8 мин.
Аналогичный подход на основе метода ВЭЖХ-МС/МС с сорбционным концентрированием был создан для определения гинсенозидов Rh4 и Rk3 в плазме крови крыс [50]. После аттестации методики авторы установили, что при оральном введении определяемых веществ в дозе 20 мг/кг в плазме крови их обнаружить не удается, однако при внутривенном
введении 5 мг/кг их присутствие в плазме крови значительно. ПО находился на уровне 10 нг/мл.
Метод ВЭЖХ-МС/МС использовали для определения гинсенозида Re и его метаболитов в экскрементах крыс [51]. Для детектирования выбраны следующие ионные переходы m/z: 945^475 (Re), 799^637 (Rg1), 783^475 ( Rg2), 637^475 (Rh1 и F1) 475^391 (протопанаксатриол) и 779^641 (внутренний стандарт - дигоксин). Суммарное содержание гинсенози-дов в экскрементах в течение 24 ч с момента орального введения дозы в 200 мг/кг составило порядка 50% от введенного. Основным продуктом метаболизма гинсенозида Re был гинсенозид Rg1. Таким образом, масс-спектрометрическое детектирование в комбинации с ВЭЖХ представляется наиболее удобным и универсальным методом определения гинсенозидов как в экстрактах из растительного сырья и продуктах на их основе, так и в биологических образцах при исследовании метаболизма и фармакокинетики.
ВЭЖХ-определение гинсенозидов также можно проводить с флуоресцентным детектированием. Так, флуоресцирующие аналиты получены в работе [52] после предколоночной дериватизации двойной связи C24-C25 в молекулах гинсенозидов путем озонолиза с последующей реакцией с 9-фторметоксикарбони-лом гидразина. При использовании ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием ПО для Rg1 и Rb1 составило 2,5 и 0,9 пмоль/л соответственно. После добавки в сыворотку этих соединений проведен количественный анализ; степень извлечения после сорбционного концентрирования составляла 72-80%.
Альтернативой методам УФ, ИДСР и МС может также служить импульсное амперометрическое детектирование, которое успешно сочетается с ВЭЖХ [53]. В этом случае ПО составляет 0,02-0,10 нг/г. Кроме того, данным способом можно легко определить суммарное содержание гинсенозидов. Полярные и неполярные гинсенозиды разделяли на сорбенте с привитыми группами С18.
Способ количественной оценки содержания гин-сенозидов создан на основе метода иммунофермент-ного анализа (ИФА) [54]. Гинсенозиды, разделенные с помощью смеси ацетонитрила воды и уксусной кислоты на полиэтилсульфоновой мембране, обрабатывали раствором иодида натрия, а затем альбумином из бычьей сыворотки (БСА). При этом на по-лиэтилсульфоновой мембране образуется конъюгат гинсенозид-БСА. Мембрану обрабатывали антителом (анти-G-Rb!) и еще одним антителом, меченным пе-роксидазой, для противодействия первому антителу.
Наконец, связанный фермент вступал в реакцию с пероксидазным субстратом. Это приводило к окрашиванию мембраны, что, в свою очередь, позволяло провести количественный анализ по степени окрашенности областей мембраны. Предел одновременного индивидуального обнаружения гинсенозидов ЯЬ1, Яс и Яё находился на уровне 60 нг/г. Диапазон определяемых содержаний для этих трех соединений составлял от 0,125 до 2,0 мкг/г.
Чувствительный и селективный метод с использованием связанного фермента на иммуносорбенте разработан для определения 20(8)-протопанаксатриола -одного из основных сапогенинов гинсенозидов [55]. Антитела, действующие против конъюгата гинсено-зид П-альбумин, продемонстрировали практически полное отсутствие реакции на другие гинсенозиды и протопанаксадиол. Рабочий интервал концентраций (от 50 пг/мл до 20 нг/мл) и количественная оценка совпали со сделанными методом ВЭЖХ.
Идентификация, или подтверждение идентичности аналита - первый и важнейший шаг для создания метода количественного анализа. Такую информацию можно получить на ионной ловушке или тандемном масс-спектрометре. Масс-спектрометрия
высокого разрешения дает детализированную и точную информацию о структуре вещества, в основном о составе неизвестных продуктов разложения или метаболитов гинсенозидов, поэтому может служить референтным методом определения этих веществ [56]. Предложенный авторами паттерн фрагментации молекул гинсенозидов часто используется другими исследователями в этой области (рис. 2). В ячейке соударений первое расщепление связей наблюдается при атоме С20, если там находится сахаридный заместитель, который и обозначают как а-цепь. Позиции С3 и С6 оказались местом присоединения Р-цепей. Буквами У и Ъ обозначены ионы с зарядом непосредственно на основной структуре гинсенозида, а буквами В и С - ионы дополняющие соответственно У и Ъ. Ион У получается в результате потери гескозы или дезоксигексозы, а ион Ъ - при полной потере сахари-да. Фрагментные ионы А- и Х-типа получаются при расщеплении сахаридного остатка, напрямую присоединенного к сапогенину.
С учетом этой схемы фрагментации успешно проведено изучение структур гинсенозидов ЯЬ1 и ЯЬ2 с помощью ИЭР-МС (на ионной ловушке) [57]. В положительном режиме регистрации ионов наи-
Рис. 2. Номенклатура фрагментов молекул гинсенозидов
более интенсивными оказались аддукты сапонинов [M+Na]+, дающие фрагментные ионы (Y-, Z-, B- и C-типа), что позволяет получить информацию об основной последовательности и ответвлениях в случае заместителей-моносахаридов, объединенных в оли-госахаридные цепочки. Ионы A- и X-типа дают информацию о связях внутри сахаридных остатков. В отрицательном режиме регистрации ионов наиболее интенсивны молекулярные ионы [M-H] , которые дают только небольшое число ионов Y- или B-типа и не дают ионов A- и X-типа из-за внутренней энергии ионов предшественников [M-H] . Этот подход может быть использован для определения структуры неде-риватизированных гинсенозидов в экстрактах из лечебных трав, что позволяет не проводить трудоемкой дериватизации сапонинов для их полного разделения [58]. Используя ИЭР-МС/МС, удалось различить и идентифицировать три пары изомерных гинсенози-дов (Rg2 и Rg3, Rg1 и Fl1, Rd и Re) благодаря точному измерению массы в МС- и МС/МС-режимах. Оказалось что для фрагментации в ячейке соударений лучше использовать аддукты гинсенозидов с литием [M+Li]+, чем [M+H]+ или [M+Na]+. В спектре фрагментов ионов [M+Li]+наиболее интенсивными оказались ионы Z (соответствующие потере сахаридов), а также ионы С (ионы сахаридных заместителей). Детектирование и интерпретация Z- и C-ионов позволяли провести идентификацию в парах изомерных гин-сенозидов, т.е. Rg2 и Rg3, Rg1 и F11, Rd и Re. Ионы [сахарид+Li^ наблюдались для Rg2 и Rg3 с m/z, равным 333 и 349 соответственно, что свидетельствовало о присутствии двух видов дисахаридных заместителей (т.е. глюкозо-рамнозного и глюкозо-глюкозно-го). Исследование метаболизма гинсенозидов проводят также с помощью квадруполь-времяпролетных систем. Так, основные метаболиты нотогинсенозида R1, гинсенозидов Rg1, Rb1 и Rd выделены из желчи крыс с помощью процедуры микродиализа [59]. Эти метаболиты, гинсенозиды Rg2, Rh2 и компонент K, детектировали на квадруполь-времяпролетном масс-анализаторе с помощью динамического варьирования энергии фрагментации.
Групповая идентификация и определение метаболических профилей
Концепция групповой идентификации гинсенози-дов изложена в работе [60] и использована с незначительными изменениями многими исследователями [39, 41, 61]. Этот метод основан на ВЭЖХ (колонка C18, подвижная фаза - вода:ацетонитрил, режим градиентного элюирования, УФ-детектирование при
203 нм). Данный метод позволяет разделить гинсено-зиды Rg1, ЯГ, Яе, Яа, Яс, ЯЬ2 и ЯЬ1 по порядку элю-ирования. Также описан улучшенный метод анализа для определения 12 гинсенозидов [62], основанный на сорбционном концентрировании с последующим ВЭЖХ-УФ-детектированием. В этом варианте метода программа градиентного элюирования позволяла разделить гинсенозиды Rg2, 20(R)-Rg2 и ЯЫ на ко -лонке С18 (150x4.6 мм). Хорошее разделение получено для всех исследуемых гинсенозидов: ЯЬ1, ЯЬ2, ЯЬ3, Яс, Яа, Яе, Rg1, Rg2, 20(R)-Rg2, Rg3, ЯЫ и ЯИ2. Тот же метод использовали для анализа листьев и ягод американского женьшеня, а также для определения содержания сапонинов в ягодах женьшеня до и после термообработки [63]. После паровой обработки (1 ч при 100-120°; 0,5-4 ч при 120°С) содержание семи гинсенозидов (Rg1, Яе, ЯЬ1, Яс, ЯЬ2, ЯЬ3 и Яё) уменьшилось, а содержание пяти остальных (ЯЫ, Rg2, 20(R)-Rg2, Rg3 и ЯИ2) увеличилось. Согласно экспериментам с использованием клеточных культур обработка ягод женьшеня паром приводила к увеличению содержания гинсенозида Rg3, который оказывает сильное влияние на рост колоректальных раковых клеток. ВЭЖХ с диодноматричным детектированием (ДМД) использовали для одновременного определения гинсенозидов и полиацетиленов в корнях американского женьшеня [64]. Гинсенозиды ЯЬ1, ЯЬ2, Яс, Яа, Яе, Rg1, Яо, малонил-ЯЬ1, малонил-Яс и малонил-Яа и полиацетилены фалкаринол и панакса-диол были разделены. Этот метод использовали для определения содержания полиацетиленов и гинсе-нозидов в корневых отростках, боковых и основных корнях шестилетнего растения женьшеня. Общее среднее содержание гинсенозидов и полиацетиленов в корневых отростках оказалось значительно выше, чем в основном корне. Применяя градиентное элю-ирование смесью ацетонитрила воды и изопропано-ла на обращенно-фазовой аналитической колонке с аминными связями, удалось разделить гинсенозиды ЯЬ1, ЯЬ2, Яс, Яа, Яе, ЯГ, Rg1, Rg2, Rg3 и ЯЫ [23]. Детектирование в элюате осуществлялось с помощью ИДСР, ПО составил 35-155 нг/г.
Более типичным является применение ВЭЖХ-МС для групповой идентификации гинсенози-дов. Так, 25 гинсенозидов разделены с помощью градиентного элюирования на колонке С18 [65], подвижная фаза - смесь 8 мМ ацетата аммония (рИ 7) и ацетонитрила. Детектирование в элюате проводили с помощью ИДСР и ионной ловушки (МС-детектирование). В масс-спектрах простых сапонинов присутствовали сигналы квазимолеку-
лярного иона [М-Н] , и его аддуктов [М+АсО] и [М-СН2О+АсО] , а также сильные сигналы двух-зарядных аддуктов, например [М-Н+АсО]2 и [М+2АсО] . Спектры малонил-замещенных гинсено-зидов из-за термической нестабильности содержали помимо [М-Н]- ионы [М-СО2-Н]-, [М-СО2+АсО]-, [М-СО2-Н+АсО]2- и [М-СО2+2АсО]2-. МС/МС-спектры для простых сапонинов соответствовали обычным паттернам фрагментации подобных соединений с последовательной потерей сахаридных остатков, в то время как спектры малонил-замещен-ных гинсенозидов содержали интенсивные сигналы, соответствующие потере малонил-радикала. В работе [66] даны значения относительной интенсивности ионов [М-Н]-/1[М+ОАс]-, 1[М-2Н]2-/1[М-Н+2ОАс]2-, 1[М-Н+ОАс]2-/1[М+ОАс]2- и показано, как их различие связано со структурой гинсенозидов, что может быть использовано для идентификации изомеров, а именно Ш^, Б-11 и Rg1, Яё и Яе, ЯЬ2 и Яс. Метод ВЭЖХ с ДМД- и ИЭР-МС- детектированием применяли для анализа экстрактов из азиатского и американского видов женьшеня [67]. Разработанный способ подходил для разделения и одновременного определения основных найденных гинсенозидов в охлажденных льдом спиртовых экстрактах. Этот способ также подходит для обнаружения других соединений, часто встречающихся в экстрактах из корня женьшеня. Более того, данный метод можно применять для разделения и определения продуктов гидролиза гинсенозидов, например образующихся в условиях, при которых происходит пищеварение (0,1 М соляная кислота при 37°С).
Для проведения контроля качества обычно используется метод ВЭЖХ-МС/МС. Например, при анализе препарата «8Иепта1>>* [68] с помощью ВЭЖХ-МС обнаружено 39 гинсенозидов, содержащихся в этом лекарственном средстве. В режиме регистрации отрицательно заряженных ионов большинство найденных гинсенозидов, кроме малонил-гинсенозидов, дают масс-спектр, содержащий молекулярные ионы [М-Н]-, а также ионы аддуктов [М+С1]- и [М+АсО]-. Иногда появляются сигналы ионов [2М-Н] . Термически нестабильные малонил-гинсенозиды дают ионы [М-СО2-Н]- и [М-СО2+С1]- (несмотря на то, что авторы не использовали хлоридсодержащих растворителей). Некоторые соединения с одинаковой молекулярной массой удалось идентифицировать, основываясь на характеристичных сигналах, соот-
ветствующих потере глюкозы и рамнозы, в МС/МС-спектрах.
Другой препарат ТМ, «отвар Sijunzi», изготавливают из корней P. ginseng, Poria cocos, Atractylodes macrocephala и Glycyrrhiza uralensis. Метод ВЭЖХ-МС использовали для идентификации трех классов активных компонентов, входящих в состав этого лекарственного средства, а именно, гинсенозидов (из женьшеня), флавоноидов и тритерпеноидов (из G. Uralensis) [69]. Гинсенозиды давали аддукт с натрием в масс-спектрах. Потеря нейтральных масс 194 и 176 оказалась характеристичной особенностью тритерпе-ноидных МС/МС-спектров. Соотношение концентраций основных активных компонентов растительного сырья (отдельно Panax ginseng и G. uralensis) отличается от этого показателя для «отвара Sijunzi». Это свидетельствует о том, что процесс варки влияет на состав конечного продукта.
Кроме ИЭР некоторые исследователи использовали химическую ионизацию при атмосферном давлении (ХИАД), которая считается подходящим методом ионизации для слабополярных и стабильных веществ. ХИАД лучше, чем ИЭР, совместима с жидкостной об-ращенно-фазовой хроматографией, поскольку предполагает использование больших скоростей потоков подвижной фазы. Кроме того, ХИАД предполагает использование испарения при высокой температуре, что способствует лучшему МС-детектированию лабильных гинсенозидов. Методом ВЭЖХ-ХИАД удалось успешно идентифицировать 35 гинсенозидов в P. ginseng [70]. Этот метод позволил одновременно определить 10 основных биологически активных компонентов Naodesheng, включая саффлоровый желтый A, пауэрарин, дайдзеин, гинсенозиды (Rg1, Rg2, Rb1, Rd, Re, Rh1) и нотогинсенозид R-1. Разделение проводили на колонке C18 с многоступенчатым градиентным элюированием смесью 0,1%-й муравьиной кислоты и метанола. Наименьшие определяемые кон -центрации лежали в диапазоне от 0,02 до 0,2 нг/г [71].
Новая стратегия групповой идентификации гинсе-нозидов в растительном сырье предложена в работе [8]. Из растений Panax ginseng, Panax quinquefolium и Panax notoginseng выделено более 620 гинсенозидов, из которых более 400 ранее не были описаны в литературе, для их выделения и очистки использовали экстракцию этанолом, гексаном и метанолом, а разделение проводили методом последовательной двумерной хроматографии на колонках с неподвижными
*8Иепта1 - популярное медицинское средство в ТМ, используемое для лечения кардиомиопатии, инфаркта миокарда и гипертензии, изготавливается из красного женьшеня и офиопогона.
фазами на гелевой основе и силикагелевой матрице. Детектирование проводили методом МС на ионной ловушке масс-анализатора. Подтверждение предложенных структур гинсенозидов получали методами МС высокого разрешения и ЯМР.
Таким образом, растительные материалы, лекарственные средства, чаи и другие продукты на основе женьшеня содержат большое число близких по структуре активных компонентов (гинсенозидов). Фрагмен-
тация этих веществ как в положительном, так и в отрицательном режимах регистрации сигналов достаточно хорошо изучена. Применяя методы масс-спектрометрии высокого разрешения и информационно-зависимого сканирования на ионной ловушке, можно дифференцировать некоторые изомерные гинсенозиды. В течение одного анализа (около 60 мин) на гибридной линейной ионной ловушке были получены масс-спектры 16 различных гинсенозидов (рис. 3) [72], присутствующих в
п
CD
-Q Е-
О О X PQ S о X
CD H X
S
8е6
7е6
беб
5е6
4е6
Зеб
2е6
1е6 5е5 0,0
405,5
187,1
100
200
300
400
441,4
459,4 515, i
585,5 ,5531,2
500
600
643,7 721,4 783,4
1 '
700 m/z, Da
800
839,5
1241,7
..L» 1 .JJ
900
1000
1100 1200
1300
1300
Рис. 3. Масс-спектры гинсенозидов 1^1 (а) и Шэ1 (б), полученные в режиме сканирования на
гибридной линейной ионной ловушке [72]
корейском женьшеневом чае. Предложенный способ ВЭЖХ-разделения и МС-сканирования универсален, и его можно использовать как для анализа растительных экстрактов, так и для анализа чаев, фито-продуктов, биодобавок и лекарственных средств на основе женьшеня. Так как традиционный процесс обработки корня женьшеня не предполагает полного разрушения молекул гинсенозидов, более того, даже при попадании в живой организм эти вещества дают метаболиты, не сильно отличающиеся по структуре от исходных гинсенозидов (см. раздел «Определение целевых аналитов»), такой способ быстрого сканирования можно использовать и для анализа биологических образцов с соответствующей пробоподготовкой. При этом данный способ детектирования стабилен в широком диапазоне концентраций, и его можно применять для количественного анализа, например, для решения задач сравнения качества образцов. Правильность идентификации аналитов подтверждается при интерпретации большого числа сигналов в масс-спектре [72], что позволяет использовать данный подход в качестве референтного.
Получение метаболических профилей является одним из краеугольных камней в системе биологического анализа, и множество исследований проводится с целью развития методологии сбора информации, интерпретируемой с точки зрения биологии. На настоящий момент методы ЯМР и ВЭЖХ-МС наиболее часто используются для получения характеристических метаболомных профилей. ЯМР используют особенно часто для идентификации метаболитов в клинических образцах [73], так как данный метод позволяет одновременно определять все соединения, содержащие протон. В этот перечень попадает большинство органических соединений, например углеводороды, аминокислоты, органические и жирные кислоты, амины, эфиры и жиры. ЯМР-спектры неотчищенных экстрактов из растительного сырья теоретически могут быть достаточно характеристичными, несмотря на перекрывание большинства сигналов метаболитов, присутствующих в растворе. Однако в сфере изучения метаболомики наибольшее значение имеют способы анализа ВЭЖХ-МС. Это обусловлено лучшей эффективностью хроматографических систем (например, нано-ВЭЖХ, ультра-ВЭЖХ) и их сочетанием с масс-спектрометрией (высокого разрешения, высокой скорости сканирования и т.д.). Разработки в этой области позволили расширить спектр соединений метаболома и, что особенно важно, дают возможность идентифицировать эти новые метаболиты. Для идентификации первостепенное значение имеет
определение элементного состава метаболита. Такое определение можно сделать, основываясь только на данных высокой точности о массе метаболита (масса должна быть определена с точностью до 5 миллионных долей от теоретической. Масс-спектрометры ион-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием, принадлежащие к последнему поколению, дают возможность измерить массу с точностью намного лучше 5 миллионных долей (обычно с точностью до 1 миллионной доли), что дает возможность инвариантного определения элементного состава. С точки зрения практичности метода, необходимо отметить, что столь точное определение массы можно проводить с привязкой к хроматографической шкале времени и без внутренней калибровки [74]. Одно значение массы может соответствовать более чем одному гинсенозиду. Так, авторы работы [75] сообщают о 136 различных гинсенозидах, имеющих всего 62 уникальные комбинации элементов в своем составе. Точные молекулярные массы некоторых гинсенози-дов приведены в табл. 2.
Для определения соединений с одинаковой молекулярной массой необходимо сначала провести процедуру разделения. Обычно используется комбинация высокоэффективного разделения и масс-спектрометрического детектирования высокого разрешения при сочетании времяпролетных масс-спектрометров с нано-ВЭЖХ-системами. Так, в режиме регистрации положительно заряженных ионов проводили анализ экстрактов из женьшеня описанным выше способом [75]. Ширина некоторых пиков составляла менее 10 с, а в масс-спектрах встречались как молекулярные и фрагментные ионы для гинсено-зидов, так и многозарядные ионы, особенно характерные для спектров наиболее интенсивных пиков, соответствующих веществам, имеющим белковую природу. Однако идентификация всех пиков на хро-матограмме оказалась затруднительной. Обнаружено 9 разных изомерных гинсенозидов с элементным составом С42Н72О14 (точная масса 800,4922). Успешно разделить удалось лишь пять из них, каждый из изомеров давал в спектре характерное изотопное расщепление молекулярного иона. По сравнению со способом прямого введения пробы в спектрах пиков на хроматограмме интенсивность натриевых аддуктов была ниже и составляла порядка нескольких процентов от интенсивности протонированного молекулярного иона. Сделав поправку на образование аддуктов, авторы работы оценили общее число обнаруженных метаболитов в несколько сотен, построив соответствующую карту интенсивности. Использование
Т а б л и ц а 2
Точные молекулярные массы гинсенозидов и их основных ионов в положительном и отрицательном режимах регистрации масс-спектров высокого разрешения
Гинсенозид Молекулярная масса Молекулярная масса аддуктов с натрием [M+Na]+ Молекулярная масса ионов [M-H]-
Ra1 1210,6346 1233,6244 1209,6268
Ra2 1210,6346 1233,6244 1209,6268
Ra3 1240,6452 1263,6350 1239,6374
Rb1 1108,6029 1131,5927 1107,5951
Rb2 1078,5924 1101,5822 1077,5846
Rb3 1078,5924 1101,5822 1077,5846
Rc 1078,5924 1101,5822 1077,5846
Rd 946,5501 969,5399 945,5423
Rg3 784,4973 807,4871 783,4895
Rh2 622,4445 645,4343 621,4367
Rs3 826,5079 849,4977 825,5001
Rh1 638,4394 661,4292 637,4316
Rg1 800,4922 823,4820 799,4844
Rf 800,4922 823,4820 799,4844
Rg2 784,4973 807,4871 783,4895
Re 946,5501 969,5399 945,5423
F1 638,4394 661,4292 637,4316
Ro 956,4981 979,4879 955,4903
F4(Rg4) 766,4867 789,4765 765,4789
Rg5 766,4867 789,4765 765,4789
Rh3 604,4339 627,4237 603,4261
Rh4 620,4288 643,4186 619,4210
Rs4 808,4973 831,4871 807,4895
Rg6 766,4867 789,4765 765,4789
Rk2 604,4339 627,4237 603,4261
Rk1 766,4867 789,4765 765,4789
Rk3 620,4288 643,4186 619,4210
Rs7 662,4394 685,4292 661,4316
Rs5 808,4973 831,4871 807,4895
двумерной технологии высокого разрешения позволило получить очень малые и хорошо различимые точки на этой карте, плотность расположения этих точек достаточно велика, что дает возможность в будущем расширить список до более полного метаболома. В этой связи необходимо предварительно разделять и концентрировать следовые количества редких метаболитов с помощью ВЭЖХ.
Альтернативные подходы к определению
Анализ в фитохимии обычно проводят с помощью полярных фаз в ТСХ, ГХ и ВЭЖХ. Однако до сих пор наблюдается недостаток необходимых методик и технологий для оценки состава растительных экстрактов. Наиболее успешные из недавно предложенных альтернативных способов определения гинсенозидов приведены ниже. Спектроскопию отражения в ближней инфракрасной области в качестве такой альтернативы применяли для определения индивидуальных гинсенозидов и определения суммарного содержания этих веществ в Р. quinquefolium [76]. Теоретически этот вариант спектроскопии имеет преимущества по сравнению с ВЭЖХ, например, в пробоподготовке и времени анализа. Выделение и разделение гинсено-зидов ЯЬ1, ЯЬ2, Яс, Яё, Яе, Rg1, Яо, малонил-ЯЬ1, малонил-ЯЬ2, малонил-Яс и малонил-Яё из отростков и основных корней проводили с помощью ВЭЖХ на колонке ЯР-18 с эндкеппингом элюируемой смесью фосфатного буфера (рН 5,8) и ацетонитрила в градиентном режиме с промежуточным УФ-детектированием при 203 нм. Спектры отражения записывали в интервале длин волн 400-2500 нм. Был сделан вывод о том, что данный вид спектроскопии можно применять как для определения основных гинсенозидов (ЯЬ1, Яе и малонил-ЯЬ1), так и для оценки суммарного содержания гинсенозидов в американском виде женьшеня. Кроме того, спектроскопию отражения в ближней инфракрасной области с успехом применяли для оценки суммарного содержания сахара в китайском виде женьшеня [77]. Использование метода калибровочного графика, основанного на применении метода наименьших квадратов (МНК) для количественной обработки результатов описанных выше экспериментов, позволило добиться одинаковой точности с наиболее часто используемыми методами для анализа растительных материалов. Следовательно, предлагаемый способ применим для определения суммарного содержания сахара в китайском женьшене.
Для оценки содержания полиацетиленов в корнях американского женьшеня также использовали рама-новскую спектроскопию [78]. Рамановский спектр
свежего корня женьшеня содержал сигнал, характерный для полиацетиленовой группы (2237 см х), в то время как в спектре высушенного корня этот сигнал был сдвинут до ~2258 см \ Полученные данные хорошо коррелировали с информацией из спектров изолированных стандартов фалкаринола (2258 см 1) и панаксадиола (2260 см х). Химический сдвиг полиацетиленовой группировки свидетельствует об изменении в молекуле, произошедшем из-за потери воды. Применение технологии романовской спектральной картографии в анализе корней женьшеня позволило выяснить, что содержание этих двух основных полиацетиленов уменьшается с увеличением размера корня. Этот факт подтвердили и эксперименты с применением ВЭЖХ.
Использование биосенсоров, состоящих из биологического распознающего элемента, который находится в прямом контакте с преобразователем, также применимо в анализе биологически активных соединений. Биологические компоненты иммобилизуются на поверхности распознающего элемента, где они вступают в реакцию с определяемыми соединениями. Преобразователи регистрируют изменение какого-либо биологического параметра, например массы, оптических свойств, температуры или протекания электрохимической реакции, и преобразуют это изменение в электрический сигнал. Антиоксидантная способность женьшеневого чая оценена с помощью биосенсора, разработанного на основе супероксид-дисмутазы [79]. Оптический биосенсор, основанный на лазерной технологии и оптически селективных волокнах, разработан для дифференциации женьшеня из опилок, который является фальсификатом, морфологически близким к диетическим продуктам на основе женьшеня, а также американскому и азиатскому видам женьшеня [80]. Спектроскопический анализ проводили напрямую с использованием порошка высушенного корня, в результате был получен характеристический интервал между 2000 и 600 см \ что и предлагалось использовать для определения различия между женьшенем и опилками, а также между американским и азиатским видами женьшеня.
Выводы и перспективы
На данный момент ВЭЖХ-УФ является самым простым и удобным методом контроля содержания гинсенозидов в растительном сырье, экстрактах и продуктах на их основе. Выбор этого метода обусловлен его простотой, доступностью и распространенностью в аналитических лабораториях. Однако из-за слабого УФ-поглощения гинсенозидов детектирова-
ние приходится осуществлять при 200-205 нм, что приводит к высокому значению фонового сигнала и шума, а следовательно, и к низкой чувствительности. Хорошей альтернативой методу ВЭЖХ-УФ считается метод ВЭЖХ-ИДСР, позволяющий получать хро-матограммы со стабильной базовой линией и расширить круг используемых растворителей для лучшего хроматографического разделения. Недостатком как УФ-, так и ИДСР-метода является невозможность давать достаточно информации о структуре идентифицируемых соединений, что делает невозможным соотнесение пиков на хроматограмме со стандартными образцами, избавленными от влияния матрицы и примесей изомеров.
Использование ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием позволяет идентифицировать гинсенозиды, так как дает важную информацию об их структуре. Например, этот метод позволяет определить величину молекулярной массы, последовательность сахаридных заместителей и величину массы сапогенина. Препараты на основе различных видов из рода Panax отличаются по составу гинсенозидов, что и выясняется с помощью методов ВЭЖХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС. Более того, эти технологии можно использовать в качестве селективных и чувствительных способов количественной оценки содержания гинсенозидов. Несмотря на то что данные подходы достаточно дороги и сложны для рутинного анализа, их с успехом применяют для изучения фармакокинетики и метаболомики. Наиболее существенными недостатками использования ВЭЖХ для рутинного анализа на содержание гинсенозидов являются потери времени на сложную пробоподго-товку и продолжительный (обычно более 60 мин) анализ, что связано с большим числом компонентов, которые необходимо разделить.
Спектроскопию в ближней инфракрасной области успешно применяют для определения гинсенозидов в растительном сырье. Этот метод характеризуется хорошей чувствительностью и воспроизводимостью, сравнимыми с ВЭЖХ. Кроме того, он более прост в применении и не требует затрат времени на анализ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Dharmananda S. // HerbalGram. 2002. 54. P. 34.
2. European Scientific Cooperative on Phytoterapy. Exeter.
2003.
3. Kiefer D., Pantuso T. // Am. Family Phys. 2003. 68. N 8.
P. 1539.
4. Sticher O. // Chemtech. 1998. 28. N 4. P. 26.
и пробоподготовку, что значимо для рутинного анализа. Однако для этого необходимо провести калибровку по образцам с известным содержанием гин-сенозидов, определенных с помощью подходящего референтного метода.
В литературе описано большое разнообразие гин-сенозидов, присутствующих в разной пропорции в растительном сырье и продуктах на его основе. Это разнообразие даже для одного вида женьшеня можно объяснить разными природными условиями в местах обитания растений (вид почвы, климат, географическое положение), а также разными способами их первичной обработки. Однако такие отклонения могут быть минимизированы при введении систем стандартизованных способов культивации и обработки. Более того, получаемые исследователями результаты могут зависеть от способов пробоподготовки, экстракции, методов анализа и интерпретации данных. В большинстве научных работ не рассматривают малонил-производные гинсенозидов, присутствие которых обнаружено на уровне 60% от общего количества.
Препараты на основе женьшеня - одни из самых продаваемых средств ТМ в мире, поэтому следует на уровне национальных властей узаконить общие правила анализа таких продуктов для обеспечения их надлежащего качества. Первые шаги в этом направлении сделаны в США и Европе, где недавно выпущены монографии, посвященные растительному сырью и экстрактам из P. ginseng (USP и Ph. Eur.) и P. quin-quefolius (USP). Однако единообразие спецификаций производства таких препаратов, а также методов их анализа крайне необходимо, и его еще предстоит достигнуть.
В будущем предполагается более широкое применение и внедрение инструментальных методов анализа, таких как ЯМР и ВЭЖХ-МС, особенно в области исследований метаболома, в целях контроля качества препаратов на основе женьшеня. Такие технологии позволят не только обезопасить применение средств ТМ, но также выявить и изучить пути метаболизма и биологического действия гинсенози-дов в живом организме.
5. Francis G., Kerem Z., Makkar H.P.S., Becker H. // Brit. J. Nutr. 2002. 88. N 6. P. 587.
6. Kang J.H., SongK.H., Woo J.K., ParkM.H., RheeM.H., Choi C., Oh S.H. // Plant Foods Hum. Nutr. 2011. 66. N 3. P. 298.
7. NagS.A., Qin J.-J., Wang W., WangM.-H., WangH., ZhangR. // Front. Pharmacol. 2012. 3. P. 25.
8. Yang W.-Z., Ye M., Qiao X., Liu C.-F., Miao W.-J., Bo T, Tao H.-Y., Guo D.-A. // Analyt. Chim. Acta. 2012. 739. P. 56.
9. Kitagawa I., Taniyama T., Yoshikawa M., Ikennishi Y., Nak-agawa Y. // Chem. Pharm. Bull. 1989. 37. N 11. P. 2961.
10. Fuzzati N. // J. Chromatogr. B. 2004. 812. N 1-2. P. 119.
11. Zhang J., Zhou F., Niu F., Lu M., Wu X., Sun J., Wang G. // PLoS One. 2012. 7. N 4. P. 35768.
12. Leung K.W., Wong A.S.-T. // Chinese Medicine. 2010. 5. P. 20.
13. Xiao G. Modern Chinese Materia Medica. Beijing, 2002.
14. Jia W., Gao W.Y. // J. Plant Biotechnol. 2003. 5. P. 7.
15. Chan T.W., But P.P.-H., Cheng S.W., Kwok, I.M., Law, F.W., Xu H.X. // Anal. Chem. 2000. 72. N 6. P. 1281.
16. Li W.K., Gu C.G., ZhangH.J., AwangD.V.C, Fitzloff J.F., Fong H.H.S., van BreemenR.B. // Anal. Chem. 2000. 72. N 21. P. 5417.
17. Hon C.C., Chow Y.C., ZengF.Y., LeungF.C.C. // Acta Pharm. Sin. 2003. 24. N 9. P. 841.
18. Cutler S.J., Cutler H.G. Biologically Active Natural Products: Pharmaceuticals. N.Y., 2000.
19. Hall T., Lu Z.Z., Yat P.N., Fitzloff J.F., Arnason J.T., Awang D.V.C., Fong H.H.S., Blumenthal M. // HerbalGram. 2001. 52. P. 31.
20. Chang T.K.H., Chen J., Benetton S.A. // Drug Metab. Dispos. 2002. 30. N 4. P. 378.
21. Wu J., Zhong J.J. // J. Biotechnol. 1999. 68. N 2-3. P. 89.
22. Anderson M.L., Burney D.P. // J. AOAC Int. 1998. 81. N 5. P. 1005.
23. Park M.K., Park J.H., Han S.B., Shin Y.G., Park I.H. // J. Chromatogr. A. 1996. 736. N 1-2. P. 77.
24. Kim W.K., Kim J.M., Han S.B., Lee S.K., Kim N.D., Park M.K., Kim C.K., Park J.H. // J. Nat. Prod. 2000. 63. N 12. P. 1702.
25. Kwon S.W., Han S.B., Park I.H., Kim J.M., Park M.K., Park J.H. // J. Chromatogr. A. 2001. 921. N 2. P. 335-339.
26. Harkey M.R., Henderson G.L., Gershwin M.E., Stern J.S., Hackman R.M. // Am. J. Clin. Nutr. 2001. 73. N 6. P. 1101.
27. Court W.A., Hendel J.G., Elmi J. // J. Chromatogr. A. 1996. 755. N 1. P. 11.
28. Fuzzati N., Gabetta B., Jayakar K., Pace R., Ramaschi G., Villa F. // J. AOAC Int. 2000. 83. N 4. P. 820.
29. Li W., Fitzloff J.F. // J. Liq. Chromatogr. Rel. Technol. 2002. 25. N 1. P. 29.
30. Li W., Fitzloff J.F. // J. Liq. Chromatogr. Rel. Technol. 2002. 25. N 16. P. 2485.
31. Suh H.J., Shin K.S., Oh S.H., Yoon B.K. Processing of extraction from ginseng using high hydrostatic pressure extraction. Korea Patent 10-0970455. 2009.
32. Liu S., Zhong J.J. // Process Biochem. 1998. 33. N 1. P. 69.
33. Corbit R.M., Ferreira J.F.S., Ebbs S.D., Murphy L.L. // J. Agric. Food Chem. 2005. 53. N 26. P. 9867.
34. Wu J., Lin L., Chau F.T. // Ultrasonics Sonochemistry. 2001. 8. N 4. P. 347.
35. Popovich D.G., Kitts D.D. // Phytochemistry. 2004. 65. N 3. P. 337.
36. Shu Y.Y., KoM.Y., Chang Y.S. // Microchem J. 2002. 74. N 2. P. 131.
37. Kwon J.-H., Belanger J.M.R., Pare J.R.J., Yaylayan V.A. // Food Res. Int. 2003. 36. N 5. P. 491.
38. Sahena F., Zaidul I.S.M., Jinap S., Karim A.A., Abbas K.A., Norulaini N.A.N., et al. // J. Food Eng. 2009. 95. N 2. P. 240.
39. Wang H.C., Chen C.R., Chang C.M.J. // Food Chem. 2001. 72. N 4. P. 505.
40. Wood J.A., Bernards M.A., Wan W.K., Charpentier P.A. // J. Supercrit. Fluid. 2006. 39. N 1. P. 40.
41. Choi M.P.K., Chan K.K.C., Leung H.W., Huie C.W. // J. Chromatogr. A. 2003. 983. N 1-2. P. 153.
42. Fang Q., Yeung H.W., Leung H.W., Huie C.W. // J. Chro-matogr. A. 2000. 904. N 1. P. 47.
43. Lin H., Zhang Y., Han M., Yang L. // Ultrasonics Sonochemistry. 2013. 20. N 2. P. 680.
44. ShehzadO., Kim H.P., Kim Y.S. // Anal. Bioanal. Chem. 2012 DOI 10.1007/s00216-012-6609-z.
45. LudwiczukA., Nyiredy S., Wolski T. // J. Planar Chromatogr. Mod. TLC. 2005. 18. N 102. P. 104.
46. Ji H.Y., Lee H.W., Kim H.K., Kim H.H., Chang S.G., Sohn D.H., Kim J., Lee H.S. // J Pharm. Biomed. Anal. 2004. 35. N 1. P. 207.
47. Liu L., Huang J., Hu X., Li K., Sun C. // J. of Chromatogr. B. 2011. 879. N 22. P. 2011.
48. Bae E.A., HanM.J., Kim E.J., Kim D.H. // Arch. Pharm. Res. 2004. 27. N 1. P. 61-67.
49. Sun J., Wang G.J., Xie H.T., Li H., Pan G.Y., Tucker I. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. 38. N 1. P. 126.
50. Patel D.N., Lin H.S., Koh H.L. // J. Mass Spectrom. 2012. 47. N 11. P. 1510.
51. Kim U., ParkM.H., Kim D.H., Yoo H.H. // Food Chem. 2013. 136. N 3-4. P. 1364.
52. Shangguan D.H., Han H., Zhao R., Zhao Y.X., Xiong S.X., Liu G.Q. // J. Chromatogr. A. 2000. 910. N 2. P. 367.
53. Lee S.I., Kwon H.J., Lee Y.M., Lee J.H., Hong S.P. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2012. 60. P. 80.
54. Morinaga O., Fukuda N., Tanaka H., Shoyama Y. // Glycobi-ology. 2005. 15. N 10. P. 1061.
55. Jung D.W., Lee J.M., Sung C.K. // Anal. Chim. Acta. 2002. 462. N 2. P. 157.
56. PerreaultH., Costello C.E. // Org. Mass Spectrom. 1994. 29. N 12. P. 720.
57. Liu S.Y., CuiM., Liu Z.Q., SongF.R., Mo W.J. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004. 15. N 2. P. 133.
58. Song F.R., Liu Z.Q., Liu S.Y., Cai Z.W. // Anal. Chim. Acta.
2005. 531. N 1. P. 69.
59. Wen X.D., Yang J., Ma R.H., Gao W., Qi L.W., Li P., Bauer B.A., Du G.J., Zhang Z., Somogyi J., Wang C.Z., Yuan C.S. // J. Chromatogr. B. 2012. 895. P. 162.
60. The Directorate for the Quality of Medicines of the Council of Europe. Strasbourg. 2004.
61. Pan J.Y., Cheng Y. Y, Wang Y, Xiao X.Y., Lin R.C. // Chinese J. Anal. Chem. 2005. 33. N 11. P. 1565.
62. Wang C.Z., Wu J.A., McEntee E., Yuan C.S. // J. Agric. Food Chem. 2006. 54. N 6. P. 2261.
63. Wang C.Z., ZhangB, Song W.X., WangA.B, NiM., LuoX.J., Aung H.H., Xie J.T., Tong R., He T.C., Yuan C.S. // J. Agric. Food Chem. 2006. 54. N 26. P. 9936.
64. Christensen L.P., Jensen M., Kidmose U. // J Agric Food Chem. 2006. 54. N 24. P. 8995.
65. Fuzzati N., Gabetta B., Jayakar K., Pace R., Peterlongo F. // J. Chromatogr. A. 1999. 854. N 1-2. P. 69.
66. Ng K.M., Che C.M., Wo S.K., Tam P.K.H., Lau A.S.Y. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006. 20. N 10. P. 1545.
67. Sloley B.D., Lin Y.C.J., Ridgway D., Semple H.A., Tam Y.K., Coutts R.T., Lobenberg R., Tam-Zaman N. // J. AOAC Int.
2006. 89. N 1. P. 16.
68. Zhang H.J., Wu Y.J., Cheng Y.Y. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2003. 31. N 1. P. 175.
69. Liu Y., Yang J.S., Cai Z.W. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. 41. N 5. P. 1642.
70. MaX.Q., LiangX.M., Xu Q., ZhangX.Z., Xiao H.B. // Phy-tochem. Anal. 2005. 16. N 3. P. 181.
71. Yu Z.G., Gao X.X., Zhao Y.L., Chen X.H., Bi K.S. // Chem. Pharm. Bull. 2006. 54. N 4. P. 588.
72. Stavrianidi A., Rodin I., Braun A., Shpigun O. // Biomed. Chromatogr. 2012. (wileyonlinelibrary.com) DOI 10.1002/ bmc.2857
73. Beckwith-Hall B.M., Holmes E., Lindon J.C., Gournarides J., VickersA., Shapiro M., Nicholson J.K. // Chem. Res. Toxicol. 2002. 15. N 9. P. 1136.
74. Van der Greef J., van der Heijden R., Verheij E.R. The role of mass spectrometry in systems biology: data processing and identification strategies in metabolomics // Advances in Mass Spectrometry. Amsterdam, 2004.
75. Buckingham J. Dictionary of Natural Products. Boca Raton, FL. 2003.
76. Ren G.X., Chen F. // J. Agric. Food Chem. 1999. 47. N 7. P. 2771.
77. Lu Y.J., Qu Y.L., Cao Z.Q., SongM. // Spectrosc. Spectrom. Anal. 2006. 26. P. 1457.
78. Baranska M., Schulz H., Christensen L.P. // J. Agric. Food Chem. 2006. 54. N 10. P. 3629.
79. Campanella L, Bonanni A, Tomassetti M. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2003. 32. N 4-5. P. 725.
80. Yap K.Y., Chan S.Y., Weng Chan Y., Sing Lim C. // Assay Drug Dev. Technol. 2005. 3. N 6. P. 683.
Поступила в редакцию 15.01.13
MODERN APPROACHES FOR IDENTIFICATION AND DETERMINATION OF GINSENOSIDES
I.A. Rodin, A.N. Stavrianidi, A.V. Braun, O.A. Shpigun
(Division of Analytical Chemistry)
Ginsenosides are the main bioactive compounds of the plants of Panax genus. Ginseng and its analogies are often use in the production of traditional medicine in China, Korea, Japan, USA and Russian Far East. For more than 40 years researchers have been developing methods of identification and determination of ginsenosides in plant materials, extracts and commercial products. For the purification of ginsenosides from plant materials different extraction techniques were used. Separation of ginsenosides has been achieved using gas chromatography, thin layer chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC). From the list of approaches HPLC prevailed. Spectophotometric, fluorescence, and, recently, evaporative light scattering and mass-spectrometric detection were coupled with HPLC for the detection of ginsenosides. The most recent methods are here discussed together with a critical evaluation of the published results.
Key words: ginsenosides, Panax ginseng, HPLC, bioactive compounds.
Сведения об авторах: Родин Игорь Александрович - ст. науч. сотр. кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук; Ставрианиди Андрей Николаевич - аспирант кафедры аналитической химии химического факультета МГУ (stavrianidi.andrey@gmail.com); Браун Аркадий Владимирович - аспирант кафедры аналитической химии химического факультета МГУ; Шпигун Олег Алексеевич - профессор кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, член-корр. РАН, докт. хим. наук.
