CC BY
21
УДК 618.145-006.6-079:577.112.088
В.Е. Шевченко1, Н.Е. Арноцкая2, Н.Е. Левченко3, К.П. Лактионов4 СОВРЕМЕННЫЕ ПРОТЕОМНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ИДЕНТИФИКАЦИИ НОВЫХ БИОМАРКЕРОВ РАКА ЭНДОМЕТРИЯ
1 Профессор, д. б. н., заведующий лабораторией онкопротеомики ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе 24)
2С.н.с. лаборатории онкопротеомики ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
3Профессор, д. м. н., в.н.с. хирургического отделения № 8 НИИ клинической онкологии ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» 4Профессор, д. м. н., заведующий хирургического отделения № 8 НИИ клинической онкологии ФГБНУ «РОНЦим. Н.Н. Блохина»
В настоящее время фундаментальные исследования в онкологии сфокусированы на поиске новых потенциальных маркеров опухолевого роста и рациональных подходов к противоопухолевой терапии. Современные методы масс-спектрометрии и протеомные технологии широко применяются для обнаружения онкомаркеров. Постоянный поиск, идентификация биомаркеров рака эндометрия, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью, является перспективным направлением в медицине. Обнаружение новых маркеров позволит проводить скрининг, диагностику доклинических форм заболевания, оценку эффективности проводимой терапии, уменьшить риск возникновения рецидивов и метастазов заболевания.
Ключевые слова: рак эндометрия, протеомика, масс-спектрометрия, биомаркеры
Известные биомаркеры и их комбинации для ранней диагностики и прогноза рака эндометрия В настоящее время в мире растет заболеваемость раком тела матки, что можно объяснить увеличением средней продолжительности жизни и нарастанием частоты таких «заболеваний цивилизации», как ановуляция, хронический гиперэстрогенизм, бесплодие, миома матки и эндометриоз, которые часто сочетаются с нарушениями эндокринной функции и обмена веществ (метаболический синдром, сахарный диабет, гиперинсулинемия, гиперлипидемия). Что часто приводит к развитию синдрома нарушений в репродуктивной, обменной и адаптационных системах организма. Практически во всех странах мира заболеваемость РЭн за последние 2 десятилетия возросла и составляет 15,3-23,5 на 100 000 населения. Современные исследования и наблюдения доказали прямую связь роста заболеваемости РЭн и возраста пациенток. По данным МАИР в 2007 г. в России противоопухолевое лечение по поводу РЭн было проведено 5,5 % женщин в возрасте до 45 лет. В структуре заболеваемости женщин злокачественными новообразованиями РЭн занимает 2 ранговое место в возрастной группе 55-69 лет и 3 место в возрастной группе 40-54 года [1]. РЭн является причиной смерти 9-10 женщин из 100 000 женского населения в мире. Результаты статистического прогнозирования свидетельствуют о дальнейшем росте заболеваемости [2].
В настоящее время не существует никаких утвержденных диагностических и прогностических маркеров РЭн. Например, пациентки с рецидивами болезни обнаруживаются только после манифиста-ции РЭн. Следовательно, актуальны поиск и идентификация высокочувствительных и специфичных маркеров РЭн для скрининга, диагностики доклинических форм заболевания, оценки эффективности проводимой терапии с целью уменьшения риска возникновения рецидивов и метастазов заболевания. По данным ряда авторов некоторые биомаркеры имеют связь с РЭн. Например, гиперэкспрессия белков p53, HIF - HIF-1a, HIF-2a, Ki-67, VEGF, EGFR, ErbB-1 и HER2/neu коррелирует с прогрессией РЭн [4]. Повышенные уровни маркеров CA-125, CA-15-3 и CA 19-9 коррелируют с размером опухоли, стадией заболевания и продолжительностью жизни пациенток [5-6]. При РЭн повышена экспрессия IL-6, TGF-a, MMP-7, SCC-A [7-10] и снижена экспрессия AFP, adiponectin [11-12]. Ранее показано участие MMP-9, adiponectin и FSH в развитии РЭн [13-15].
В сыворотке крови больных РЭн в сравнении с контрольной группой были значительно увеличены уровни экспрессии ряда белков: IL-6, MIP-1a, MIP-ip, tumor necrosis factor receptor superfamily member 1, interleukin 2 receptor, insulin-like growth factor binding protein - I, TSH, prolactin, growth hormone, adrenocorticotropic hormone, CA 125, CA 19-9, TGFa, MMP-7, MICA, SCC-A [16]. Снижены уровни белков: eotaxin, VEGF, ErbB2, EGFR, AFP, mesothelin, FSH, lysyl hydroxylase, CD40L, sVCAM-1, sICAM-1, tPAI-1, MPO, adiponectin, MMP-2,3,8,9, UL-16 binding protein -1,3, transthyretin и soluble fas ligand (sFasL). Кроме того, уровни CA-125, CA 15-3 и сarcinoembryonic antigen были выше у больных III стадией РЭн [16].
Новой парадигмой увеличения чувствительности и специфичности диагностических тестов является использование одновременно нескольких известных маркеров. Предпринимались попытки применить для диагностики РЭн комбинации нескольких маркеров, изменяющих экспрессию при РЭн. В сравнительном исследовании Zhang A.M. et al. [17] показали, что средние уровни CA-125 и HE-4, в сыворотке были значительно выше при РЭн, по сравнению с гиперплазией и нормальным эндометрием. При специфичности 95 % для РЭн чувствительность для HE-4, CA-125 и их комбинации составила 41,1; 22,6 и 46,0%, соответственно. Отмечено увеличение экспрессии этих белков в сыворотке крови при переходе от больных с I-II к пациенткам с III-IV стадии РЭн. Farias-Eisner G. et al. [18] проверили диагностическую эффективность для РЭн комбинации трех серологических маркеров рака яичников - apolipoprotein-1, prealbumin и transferrin. Набор этих биомаркеров разделял нормальный эндометрий от образцов ранней и поздней стадий РЭд с чувствительностью 71/82 % и специфичностью 88/86 %, соответственно. Из вышесказанного следует, что использование комбинации биомаркеров является перспективным подходом к диагностике РЭн.
В этом обзоре мы кратко рассмотрим проте-омные технологии, используемые для поиска потенциальных маркеров РЭн, обсудим трудности работы с биологическими образцами, проведем анализ современных протеомных исследований в данной области.
Протеомика и рак
Основная цель протеомики рака (онкопроте-омики) - поиск и анализ изменений в протеоме че-
ловека, которые могут потенциально привести к развитию злокачественной опухоли. Функциональные продукты генов - белки (протеом) - ответственны за многие структурные компоненты клеток и межклеточные взаимодействия. Они регулируют ключевые сигнальные пути, инициирующие клеточное деление, дифференцировку, апоптоз и другие клеточные процессы. Нарушения нормальных физиологических клеточных функций в результате различных заболеваний изменяют профили экспрессии и структуру белков. Это особенно важно учитывать при исследовании рака, где модификации в белках (например, сверх-экспрессия, полиморфизм и пост-трансляционные изменения) могут вносить специфический вклад в патогенез болезни и представлять новые мишени для диагностики и терапии [19]. Поэтому одна из первостепенных задач онкопротеомики связана с изучением белкового профиля нормальных и трансформированных клеток для выявления изменений в уровне экспрессии и структуре белков. Другая важная задача - качественный и количественный анализ ДЭ белков в данной опухолевой ткани, биологических жидкостях в сравнении со здоровыми аналогами на различных стадиях заболевания - от преднеоплазии до неопла-зии. Решение этих задач в первую очередь направлено на поиск маркеров опухолевого роста.
Учитывая сложную природу рака, а также для сведения к минимуму ложноположительных и ложноотрицательных результатов, осуществляется поиск групп специфических маркеров в различных биологических образцах (тканях, биологических жидкостях, клеточных культурах).
Особенности работы
с биологическими образцами
Биологические жидкости, например, плазма крови, легко собираются практически неинвазив-ным способом, а потому широко используются в клинической практике. Однако широкий динамический диапазон концентраций белков и преобладание в плазме высокопредставленных белков (ВПБ, белки с высокими уровнями концентраций) создают трудности для анализа и идентификации низко-представленных белков (НПБ, белки с низкими уровнями концентраций), к которым относятся маркеры РЭн [20]. Преодолеть эти трудности можно, используя образцы жидкостей, выделяемые отдельными органами [21], однако, все эти жидкости содержат ВПБ плазмы, которые должны быть удалены до анализа [22]. Следовательно, предварительное фракционирование белков - важная составляющая для любого протеомного анализа биологических жидкостей. Для удаления ВПБ или обогащения отдельных классов протеинов используется изоэлектрофокусирование, хроматография, иммунные методы, аффинная хроматография [23].
Для поиска маркеров РЭн используются образцы опухолевой ткани. Несмотря на относительно простой способ их получения (диагностическое выскабливание, биопсия), биомаркеры, найденные в ткани, в отличие от маркеров биологических жидкостей, трудно использовать в качестве рутинного клинического теста. Кроме того, в протеомах тканей преобладают структурные клеточные белки [24], которые должны быть удалены еще до анализа. Необходимо учитывать тот факт, что ткани репродуктивных органов, в частности, эндометрия, относительно неоднородны, а типы клеток в пределах одного образца очень вариабельны [25]. В этой связи в ряде исследований активно используется
лазерная микродиссекция, уменьшающая гетерогенность образца для протеомного анализа [26]. Для изучения циклических изменений ткани эндометрия используют образцы на различных стадиях менструального цикла [27]. Таким образом, для успешного протеомного анализа тканей репродуктивных органов необходим тщательный выбор образца и стратегии фракционирования белков.
Протеомные технологии,
используемые для открытия
маркеров рака эндометрия
Идентификация белков, связанных с процессами онкогенеза, стала возможна после разработки современных методов подготовки образцов, развития технологических платформ для их высокоэффективного разделения, появления высокочувствительных масс-спектрометрических (MS, mass spectrometry) методов, их идентификации в комплексе с биоинформационным анализом.
В исследованиях РЭн чаще всего используются такие протеомные технологии, как иммунофермент-ный анализ ELISA, двумерный гель-электрофорез (2-DE, two-dimensional gel electrophoresis), дифференциальный электрофорез в геле (DIGE, difference gel electrophoresis), времяпролетная масс-спектрометрия с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF-MS, surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometery), времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MAlDi-TOF-MS, matrix-assisted laser desorption/ioni-zation time-of-flight mass spectrometery), многомерная жидкостная хроматография - тандемная масс-спектрометрия (LC-MS/MS, liquid chromatography-tandem mass spectrometry).
Эти технологии применялись для элиминации маркерных белков при сравнении образцов случая и контроля (например, образцов сыворотки крови больных РЭн и контрольной группы) или для изучения молекулярных механизмов, вовлеченных в онкогенез РЭн.
Другие более современные методы пока находят ограниченное применение, например, MALDI-MS изображения (MALDI- MSI, matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging) [28].
Использование протеомных методов позволяет идентифицировать ДЭ-белки, которые могут являться потенциальными маркерами РЭн. Выполнение протеомного картирования биологических образцов от отдельных пациентов открывает перспективу для использования персонифицированной терапии [29]. Современные масс-спектрометричес-кие методы позволяют проводить секвенирование белков, анализировать их посттрансляционные модификации, изучать белковые взаимодействия и другие фундаментальные аспекты онкогенеза. В качестве биологических образцов обычно используют хирургический и биопсийный материалы (опухолевую и нормальную ткань) с обработкой или без обработки лазерной микродиссекцией (LCM, laser capture microdissection). Можно использовать предварительно фракционированную сыворотку/плазму крови, мочу, культуры опухолевых клеток. По мере развития протеомных технологий, которые становятся все более сложными, обозначились ряд ключевых требований для проведения успешного исследования. Воспроизводимость результатов и тщательная унифицированная подготовка образцов - ключевые факторы при идентификации биомаркеров [30].
Для валидации потенциальных биомаркеров, идентифицированных протеомными методами, используется иммуноферментный анализ, вестерн-блоттинг, иммуногистохимическое окрашивание и ПЦР в реальном времени.
Новая технология мультиплексного иммунологического анализа, такая как Luminex или AlphaScreen, позволяет проводить измерения уровней десятков белков в одном образце [31].
Таргетная масс-спектрометрия также все шире применяется для валидации биомаркеров. Мониторинг многократных реакций (MRM, multiple reaction monitoring) позволяет обнаруживать и количественно оценивать определенные
Плазма и сыворотка крови Несмотря на очень низкие уровни (<1 пМ), белки, попадающие в кровоток из опухолевой ткани, могут служить надежным источником новых
пептиды в сложном образце, измеряя известные фрагментные ионы в тройном квадрупольном масс-спектрометре [32].
Потенциальные маркеры рака эндометрия Для повышения эффективности поиска потенциальных маркеров РЭн и улучшения качества протеомных исследований использовались различные биообразцы, которые имеют свои достоинства и недостатки. В этой части обзора мы кратко рассмотрим наиболее интересные протеомные исследования РЭн. Табл. демонстрирует список идентифицированных потенциальных маркеров рака эндометрия.
Таблица
Потенциальные протеомные маркеры рака эндометрия
Название протеина Рак эндометрия
Ткань Сыворотка/плазма
а-1-antitrypsin -
а-1 -antitrypsin precursor - +
а-1-в glycoprotein +
antithrombin III +
apolipoprotein A-IV + -
apolipoprotein C-II precursor +
apolipoprotein E precursor +
calcyphosine +
calgizzarin +
calgranulin A +
c'AMP dependent protein kinase type I-P regulatory chain +
chaperonin 10 +
cleaved high molecular weight kininogen -
clusterin +
complement component 3 +
complement component 4A +
complement component 4B +
creatine kinase B -
cyclophilin A + +
epidermal fatty acid binding protein +
glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase +
haptoglobin precursor +
heat shock 27 kDa protein +
heat shock 70 kDa protein 1 +
heat shock cognate 71 kDa protein +
heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D0 +
heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 +
histidine-rich glycoprotein precursor +
insulin-like growth factor-binding protein 4 precursor +
inter-a-trypsin inhibitor family heavy chain-related protein +
leucine-rich glycoprotein +
macrophage migratory inhibitory factor +
matrix metallopeptidase 2 +
phosphoglycerate kinase +
polymeric immunoglobulin receptor precursor +
prohibitin +
prolactin +
pyruvate kinase M1 or M2 isozyme +
serotransferrin precursor +
serum albumin precursor +
serum amyloid A +
serum amyloid A2 isoform a +
transgelin -
trypomyosin fibroblast isoform TM3 +
"+" - экспрессия возрастает; "-" - экспрессия снижается
эффективных биомаркеров. Считается, что 20-25% всех белков, кодируемых геномом, должны секре-тироваться клетками [33] и попадать в сыворотку/плазму крови человека, формируя один из самых
информативных и важных с клинической точки зрения протеом. Так как возникновение и развитие рака приводит к характерным изменениям в проте-оме сыворотки/плазмы крови больного, можно использовать протеомные методы для поиска потенциальных биомаркеров РЭн в этих биологических жидкостях. Особый интерес представляет мало изученная низкомолекулярная фракция протеома, в которой, как полагают, могут находиться потенциальные биомаркеры опухолевого роста и мишени для таргетной терапии, обладающие повышенной сосудистой проницаемостью [34]. Дополнительную информацию можно получить, изучая компоненты протеома биологических жидкостей, источником которых могут быть органы и ткани непосредственно не затронутые опухолевым процессом, но реагирующие на изменение гомеостаза организма-опухоленосителя. Как правило, уровни их концентраций на несколько порядков выше таковых опу-холь-ассоциированных маркеров.
До настоящего времени опубликовано лишь небольшое количество работ с использованием MS-технологий для обнаружения, идентификации и валидации в сыворотке/плазме крови биомаркеров рака эндометрия. SELDI-TOF-MS одной из первых применялась при профилировании клинических образцов сыворотки крови для обнаружения потенциальных биомаркеров рака эндометрия. С помощью этой платформы Zhu L.R. et al. [35] изучили протеом образцов сыворотки крови от больных РЭн и здоровых индивидов. Созданная модель из набора белков, при валидации в слепом тесте, показала чувствительность 75% и специфичность 60%. Takano М.И. et al. [36], методом SELDI-TOF-MS обнаружили четыре белка, два из которых были в последствии идентифицированы как аполипопро-теин A1 и модифицированный аполипопротеин Cl. Модель на их основе различала образцы сыворотки больных РЭн от контроля с чувствительностью 82 % и специфичностью 86 %. Метод MALDI-TOF-MS был использован Kikuchi S. et al. [37] для анализа пептидов, ассоциированных с альбумином в 92 образцах сыворотки больных РЭн и 33 здоровых женщин. В отличие от этих исследований Feng Qiu et al. [38] использовали MALDI-TOF-MS технологию после предварительного фракционирования образцов плазмы на магнитных частицах со слабой катионнообменной поверхностью. Эта платформа значительно увеличивает чувствительность и воспроизводимость анализа, что подтверждается рядом исследований по профилированию образцов плазмы от онкологических больных [39]. Предложенная методология, по мнению авторов, может успешно использоваться в будущем для диагностики РЭн.
В работе Abdul-Rahman P.S. et al. [40] представлены данные по 2-DE анализу уровней экспрессии ВПБ в образцах сыворотки крови больных аденокарциномой эндометрия (АКЭ), плоскоклеточной цервикальной карциномой (ПЦК) и церви-кальной аденокарциномой (ЦАК), в сравнении с контрольными образцами.
В трех группах онкологических больных наблюдали изменение экспрессии по отношению к норме у ряда ВПБ сыворотки. Экспрессия al-antitrypsin, alphal-B glycoprotein, cleaved high-molecular-weight kininogen (light chain) и antithrombin III изменялась у всех больных. Однако, уровни clusterin возрастали только у больных АКЭ, тогда как уровни экспрессии zinc alpha-2-glycoprotein увеличивались только у больных ПЦК и ЦАК.
Используя LC-MS/MS метод Negishi A. et al. [41] количественно проанализировали протеом образцов сыворотки от больных РЭн и субъектов контрольной группы и обнаружили 49 дифференциально экспрессированных протеинов, три из которых были провалидированы иммунноблотингом.
Wang Y.S. et al. [42] провели количественный протеомный анализ образцов сыворотки от больных с простой гиперплазией, сложной гиперплазией и атипичной гиперплазией эндометрия, РЭн и женщин контрольной группы. Для поиска маркеров использовали LC-MS/MS-технологию, объединенную с iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation) -методом. В целом было идентифицировано и количественно определено 430 протеинов в образцах сыворотки больных с поврежденным эндометрием и женщин с нормальным эндометрием, из которых 12 белков были дифференциально экспрессированы, по крайней мере, в одной группе случаев по отношению к контролю. Впервые были обнаружены 7 дифференциально экспрессированных белков при атипичной гиперплазии эндометрия. Впервые были обнаружены 7 ДЭ белков при атипичной гиперплазии эндометрия. Среди них, orosomucoid 1, haptoglobin, serpinc 1, а-1-antichymotrypsin, apolipoprotein A-IV, inter-a-trypsin inhibitor heavy chain H4 и histidine-rich glycoprotein.
Открытые в этом исследовании дифференциально экспрессированные белки могут являться потенциальными маркерами для диагностики гиперплазии и РЭн.
Моча
Моча - привлекательный материал для про-теомных исследований, поскольку ее образцы легко получаются, идеальны для скрининга и более стабильны к преданалитическим процедурам обработки по сравнению с сывороткой и плазмой [43]. Однако из-за присутствия гломерулярной мембраны белки высокого молекулярного веса не попадают в мочу.
Для поиска потенциальных маркеров Mu A.K. et al. [44] использовали образцы мочи от больных ранней стадией РЭн и здоровых пациенток. Протеины разделяли 2-ББ-методом с последующим анализом изображений и MALDI-MS/MS-идентификацией дифференциально экспрессиро-ванных протеинов. Выявляли возрастание уровней экспрессии zinc а-2 glycoprotein, а 1-acid glycoprotein и снижение экспрессии CD59 и фрагмента nebulin у больных РЭн, по сравнению с контрольной группой.
Ткань
При использовании биопсийного и операционного материала в качестве источника биомаркеров необходимо учитывать их зависимость от стадии заболевания и гетерогенность опухолевой ткани, которая состоит из опухолевых клеток, компонентов стромы, воспалительных инфильтратов, участков некроза. Это вызывает определенные трудности при работе с лизатами тканей. Выделение раковых клеток, как правило, проводят с помощью LCM, но часто полученного материала бывает недостаточно для MS-анализа. Кроме того, полное исключение из анализа клеток стромы нежелательно, так как эти клетки сами часто продуцируют биомаркеры наряду с опухолевыми клетками. Однако, несмотря на эти трудности, были выполнены ряд протеомных исследований РЭн с образцами опухолевой и нормальной ткани.
DeSouza L. et al. [45], используя дифференциальные метки (iTRAQ и clCAT) в комбинации с LC-MS/MS, изучили гомогенаты малигнизирован-ного и нормального эндометрия и открыли девять потенциальных маркеров РЭн. Среди них повышенную экспрессию в злокачественной ткани имели chaperonin 10, pyruvate kinase M1 или M2 isozyme, calgizzarin, heterogeneous nuclear ribonu-cleoprotein D0, macrophage migratory inhibitory factor и polymeric immunoglobulin receptor precursor, а пониженную-а-1-antitrypsin precursor, creatine kinase B и transgelin. Авторы подтвердили данные по высокой экспрессии chaperonin 10 в малигнизирован-ной ткани эндометрия, полученные ранее [46]. LC-MS/MS анализ показал низкую экспрессию chaperonin 10 и calgranulin A в гомогенатах нормального эндоматрия и высокую в малигнизиро-ванном. При MALDI-TOF-MS анализе образцов ткани РЭн и нормального эпителия эндометрия, обработанных LCM, был обнаружен ряд высоко экспрессированных протеинов в злокачественных клетках эпителия: calgranulin A и chaperonin 10 [47].
В работе Dubé V. et al. [48] проводилась ва-лидация предварительно открытых потенциальных маркеров РЭ, включающих chaperonin 10, pyruvate kinase M2 и a1-antitrypsin. Набор этих маркеров дискриминировал образцы злокачественных и доброкачественных опухолей эндометрия с чувствительностью 85 и специфичностью 93 %. Используя ранее открытые ДЭ протеины, DeSouza L.V. et al. [49] проанализировали методом LC-MS/MS в комбинации с iTRAQ образцы нормального и малигни-зированного эндометрия.
Лучшие результаты показала комбинация из pyruvate kinase, chaperonin 10 и alpha1-antitrypsin, которая дискриминировала образцы нормы и патологии с чувствительностью 95%.
Применяя 2-DE в комбинации c MALDI-TOF-MS, Li Z. et al. [50] идентифицировали и вали-дировали calcyphosine и cyclophilin А, как потенциальные маркеры РЭн и предположили их участие в онкогенезе. Необходимо отметить, что повышенная экспрессия cyclophilin А сопровождается устойчивостью опухолевых клеток к апоптозу, индуцированному химиотерапией [51]. Следовательно, инги-бирование синтеза cyclophilin А может улучшить эффект терапии и прогноз для пациенток с РЭн [52]. Методом MRM в сочетании с mTRAQ-метками изучали экспрессию pyruvate kinase M1/M2 в нормальной и малигнизированной ткани эндометрия. Показано 4-кратное увеличение экспрессии этого белка в гомогенатах опухолевой ткани, которое подтвердилось независимыми опытами с ELISA [53]. DeSouza L.V. et al. [54] использовали методы MRM и iTRAQ для изучения уровней экспрессии изоформы М2 pyruvate kinase (PK-M2) и полимерных иммуноглобулиновых рецепторов в эпителиальных клетках, полученных LCM из фиксированных формалином парафиновых срезов ткани РЭн и нормального пролифирирующего эндометрия.
Сравнительный MS-анализ протеомов популяций эпителиальных клеток, полученных LCM из образцов ткани больных I стадией РЭн и образцов нормального эндометрия у женщин в постменопаузе, обнаружил 209 дифференциально экспрес-сированных протеинов [55]. Несколько идентифицированных белков с повышенной экспрессией при I стадии РЭн были функционально связаны с воспалением (аннексины) и окислительными процес-
сами (пероксиредоксины). Независимый анализ методом вестерн-блоттинга подтвердил высокую экспрессию peroxiredoxin 1 и annexin A2 при I стадии рака, по сравнению с нормальным эндометрием. Эти данные обеспечивают основу для дальнейшего изучения сигнальных путей, включенных в раннюю стадию РЭн и поиска возможных мишеней для таргетной терапии РЭн.
Puljiz M. et al. [56] изучили иммуногистохи-мическим методом прогностическое значение MMP 2 и 9 и показали, что у больных I стадией РЭн с содержанием высоких уровней MMP 2 в строме опухоли имеется высокий риск возникновения рецидивов. Этот же метод использовался для оценки экспресссии multiple myeloma SET domain-containing protein (MMSET) в образцах РЭн и нормального эндометрия [57]. MMSET был высоко экспрессирован при РЭн по сравнению с обычным эндометрием. Кроме того, уровни MMSET коррелировали с FIGO-стадиями, гистологическим типом, глубиной инвазии в миометрий, метастазами в лимфоузлы и сосудистой/лимфатической инвазией. Больные с повышенной экспрессией MMSET имели более низкие значения общей выживаемости по сравнению с таковыми с пониженными уровнями MMSET. Многовариантный регрессионный анализ показал, что повышенная экспрессия MMSET является независимым прогностическим фактором для больных РЭн.
Заключение
Рак эндометрия представляет серьезную угрозу здоровью женщин, а использование современных протеомных методов на базе масс-спектрометрии открывает новые возможности для поиска диагностических и прогностических маркеров заболевания. Выбор подходящих биологических объектов для их обнаружения часто определяет стратегию исследования. Проведенный анализ публикаций показывает, что большинство исследований посвящено образцам сыворотки и плазмы крови, однако до сих пор не найдены никакие специфичные диагностические и прогностические маркеры заболевания. Картирование протео-ма опухолевой и нормальной ткани может выявлять белки, участвующие в патогенезе рака эндометрия. Число таких публикаций постепенно увеличивается. Проведенные исследования в основном фокусировались на биомаркерах для ранней диагностики, однако прогностические маркеры также представляют определенный интерес. Следует отметить, что различные индивидуальные изменения и присутствие ВПБ значительно усложняют поиск биомаркеров.
В этой связи уделяется повышенное внимание стандартизации процедур сбора и хранения образцов. Учитывая сложный состав протеомов биологических жидкостей необходимо развивать методы предварительного фракционирования белков и усовершенствовать технику масс-спектрометрического анализа.
Несмотря на все трудности, намечается заметный прогресс, связанный с использованием современных протеомных технологий для обнаружения новых маркеров, которые позволят проводить скрининг, диагностику доклинических форм заболевания, оценку эффективности проводимой терапии, а также уменьшить риск возникновения рецидивов и метастазов заболевания.
Литература
1. Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований женских половых органов // Опухоли женской репродуктивной системы. - 2009. - (1-2).-P. 76-80.
2. Сидоренко Ю.С., Левченко Н.Е. Органосохраняющие и функционально-щадящие операции в онкоги-некологии // Тез. докл. науч.-практ. конференции «Лечение рецидивов и метастазов злокачественных опухолей». М. - 2003. -P. 453-6.
3. Hall K.L., Dewar M.A., Perchalski J. Screening for gynecologic cancer. Vulvar, vaginal, endometrial and ovarian neoplasms // Prim. Care. - 1992. - 19. - P. 607-20.
4. Schimp V.L., Ali-Fehmi R., Solomon L.A., Hammoud A., Pansare V, Morris R.T., Munkarah A.R. Theracial disparity in outcomes in endometrial cancer: Could this be explained on a molecular level? //Gynecol. Oncol.- 2006.-102.- P. 440-46.
5. Lo S.S., Cheng D.K., Ng T.Y., Wong L.C., Ngan H.Y. Prognostic significance of tumour markers inendo-metrial cancer // Tumour Biol. - 1997. - 18. - P. 241-9.
6. Gadducci A., Cosio S., Carpi A., Nicolini A., Genazzani A.R. Serum tumor markers in the managementof ovarian, endometrial and cervical cancer // Biomed. Pharmacother. - 2004 - 58 - P. 24-38.
7. Chopra V, Dinh T.V., Hannigan E.V Serum levels of interleukins, growth factors and angiogenin inpatients with endometrial cancer // J. Cancer Res. Clin. Oncol.- 1997.-123.-P.167-172.
8. Bellone S., Watts K., Cane S., Palmieri M., Cannon M.J., Burnett A., Roman J.J., Pecorelli S., Santin A.D. High serum levels of interleukin-6 in endometrial carcinoma are associated with uterine serouspapillary histology, a highly aggressive and chemotherapy-resistant variant of endometrial cancer //Gynecol. Oncol.-2005.-98.- P. 92-98.
9. Ueno H., Yamashita K., Azumano I., Inoue M., Okada Y. Enhanced production and activation of matrix met-alloproteinase-7 (matrilysin) in human endometrial carcinomas // Int. J. Cancer.- 1999.-84.- P.470-477.
10. Salman T., el-Ahmady O., Tony O., Darwish M. Clinical value of squamous cell carcinoma antigen (SCC-A) in Egyptian gynecologic cancer patients // Anticancer Res. - 1997 - 17 - P. 3083-6.
11. Giavazzi R., Sennino B., Coltrini D., Garofalo A., Dossi R., Ronca R., Tosatti M.P., Presta M. Distinct role of fibroblast growth factor-2 and vascular endothelial growth factor on tumor growth and angiogenesis // Am. J. Pathol. - 2003 - 162 - P. 1913-26.
12. Ishiguro T., Yoshida Y., Tenzaki T., Ohsima M., Suzuki H. Serum alpha fetoprotein in gynaecologicrelated malignancies // Zentralbl. Gynakol.- 1980.-102.- P.1209-1212.
13. Berstein L., Kovalevskij A., Zimarina T., Maximov S., Gershfeld E., Vasilyev D., Baisheva S., Baymak-hasheva A., Thijssen J.H. Aromatase and comparative response to its inhibitors in two types of endometrial cancer // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. - 2005.-95.- P. 71-74.
14. Soliman P.T., Wu D., Tortolero-Luna G., Schmeler K.M., Slomovitz B.M., Bray M.S., Gershenson D.M., Lu K.H. Association between adiponectin, insulin resistance, and endometrial cancer // Cancer.- 2006.-106.- P. 2376-2381.
15. Kamat A.A., Feng S., Agoulnik I.U., Kheradmand F., Bogatcheva N.V., Coffey D., Sood A.K., Agoulnik A.I. The role of relaxin in endometrial cancer // Cancer Biol. Ther. - 2006 - 5 - P. 71-7.
16. Yurkovetsky Z., Ta'asan S., Skates S., Rand A., Lomakin A., Linkov F., Marrangoni A., Velikokhatnaya L., Winans M., Gorelik E., Maxwell G.L., Lu K., Lokshin A. Development of multimarker panel for early detection of endometrial cancer. High diagnostic power of prolactin // Gynecol. Oncol.- 2007.- 107(1).-P. 58-65.
17. Zhang A.M., Zhang P. Clinical value of combined detection of serum human epididymal secretory protein E4 and CA(125) in the diagnosis of endometrial carcinoma // Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi.- 2012.-47(2).-P. 125-128.
18. Farias-Eisner G., Su F., Robbins T., Kotlerman J., Reddy S., Farias-Eisner R. Validation of serum biomarkers for detection of early- and late-stage endometrial cancer // Am. J. Obstet. Gynecol.- 2010.-202(1).- P. 73.
19. Шевченко В.Е. Современные масс-спектрометрические методы в ранней диагностике рака // Масс-спектрометрия.- 2004.-1(2).- C.103-126.
20. Anderson N.L. The clinical plasma proteome: a survey of clinical assays for proteins in plasma and serum // Clinical Chemistry.- 2010.-56.- P. 177-185.
21. Hanash S.M., Pitteri S.J., Faca V.M. Mining the plasma proteome for cancer biomarkers // Nature.- 2008.452 .- P. 571-579.
22. Hannan N.J., Stephens A.N., Hincks C., Rainczuk A., Rombauts L.J.F., Salamonsen L.A. The endometrial secretome: potential roles in endometrial receptivity // Biology of Reproduction.- 2008.- 81.- P.419.
23. Ametzazurra A., Matorras R.,Garcia-Velasco J.A., Prieto B., Simon L.,Martinez A., Nagore D. Endometrial fluid is a specific and non-invasive biological sample for protein biomarker identification in endometriosis // Human Reproduction.- 2009.- 24.- P. 954-965.
24. Chen J., Hannan N., Mak Y., Nicholls P., Zhang J., Rainczuk A., Stanton P., Robertson D., Salamonsen L. Stephens A.N. Proteomic characterization of mid-proliferative and mid-secretory human endometrium // Journal of Proteome Research.- 2009.- 8.- P. 2032-2044.
25. Braun D.P., Gebel H., Rana N., Dmowski W.P. Cytolysis of eutopic and ectopic endometrial cells by peripheral blood monocytes and peritoneal macrophages in women with endometriosis // Fertility and Sterility.-1998.- 69.- P. 1103-1108.
26. Chand A.L., Murray A.S., Jones R.L., Hannan N.J., Salamonsen L.A., Rombauts L. Laser capture microdissection and cDNA array analysis of endometrium identify CCL16 and CCL21 as epithelial-derived inflammatory mediators associated with endometriosis // Reproductive Biology and Endocrinology.- 2007.- 5.-P.18.
27. DeSouza L., Diehl G., Rodrigues M.J., Guo J., Romaschin A.D., Colgan T.J., Siu K.W. Search for cancer markers from endometrial tissues using differentially labeled tags iTRAQ and cICAT with multidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry // Journal of Proteome Research.- 2005.- 4.- P. 377-386.
28. Meehan K.L., Rainczuk A., Salamonsen L.A., et al. Proteomics and the search for biomarkers of female reproductive diseases // Reproduction.- 2010.- 505.- P. 519-540.
29. Sharon D., Chen R., Snyder M. Systems biology approaches to disease marker discovery // Disease Markers.- 2010.- 28.- P. 209-224.
30. Rai A.J., Vitzthum F. Effects of preanalytical variables on peptide and protein measurements in human serum and plasma: implications for clinical proteomics // Expert Review of Proteomics.- 2006.- 3.- P. 409426.
31. Huttenhain R., Malmstrom J., Pitcotti P., Aebersold R. Perspectives of targeted mass spectrometry for protein biomarker verification // Current Opinion in Chemical Biology. - 2009.- 13.- P. 518-525.
32. Schmidt A., Claassen M., Aebersold R. Directed mass spectrometry: towards hypothesis-driven proteomics // Current Opinion in Chemical Biology.- 2009.- 13.- P. 510-517.
33. Chen Y., Yu P., Luo J., Jiang Y. Mamm. Secreted protein prediction system combining CJ-SPHMM, TMHMM, and PSORT // Genome.- 2003.-14(12).- P. 859-865.
34. Dellian M., Yuan F., Trubetskoy V.S., Torchilin VP., Jain R.K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence // Br. J. Cancer -2000.- 82(9).- P. 1513-1518.
35. Zhu L.R., Zhang W.Y., Yu L., Zheng Y.H., Hu J., Liao Q.P. Proteiomic patterns for endometrial cancer using SELDI-TOF-MS // J. Zhejiang Univ. Sci. B.- 2008.- 9(4).- P. 286-290.
36. Takano M., Kikuchi Y., Asakawa T., Goto T., Kita T., Kudoh K., Kigawa J., Sakuragi N., Sakamoto M., Su-giyama T. Identification of potential serum markers for endometrial cancer using protein expression profiling // Journal of Cancer Research and Clinical Oncology.- 2010.- 136.- P. 475-481.
37. Kikuchi S., Honda K., Handa Y., Kato H., Yamashita K., Umaki T., Shitashige M., Ono M., Tsuchida A., Aoki T., Hirohashi S., Yamada T. Serum albumin-associated peptides of patients with uterine endometrial cancer // Cancer Sci.- 2007.- 98(6).- P.822-829.
38. Qiu F., Gao Y.H., Jiang C.G., Tian Y.P., Zhang X.J. Serum proteomic profile analysis for endometrial carcinoma detection with MALDI-TOF MS // Arch Med Sci.- 2010.- Vol. 30, N 6(2).- P. 245-252.
39. Shevchenko V.E., Arnotskaya N.E., Zaridze D.G. Detection of lung cancer using plasma protein profiling by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry // Eur. J. Mass Spectrom.- 2010.-16(4).- P. 539-549.
40. Abdul-Rahman P.S., Lim B.K., Hashim O.H. Expression of high-abundance proteins in sera of patients with endometrial and cervical cancers: Analysis using 2-DE with silver staining and lectin detection methods // ELECTROPHORESIS.-2007.- 28.- P. 1989-1996.
41. Negishi A., Ono M., Handa Y., Kato H., Yamashita K., Honda K., Shitashige M., Satow R., Sakuma T., Ku-wabara H., Omura K., Hirohashi S., Yamada T. Largescale quantitative clinical proteomics by label-free liquid chromatography and mass spectrometry // Cancer Sci.- 2009.- 100.- P. 514-519.
42. Wang Y.S., Cao R., Jin H., Huang Y.P., Zhang X.Y., Cong Q., He Y.F., Xu C.J. Altered protein expression in serum from endometrial hyperplasia and carcinoma patients // J. Hematol. Oncol.- 2011.- 14.- P.4-15.
43. Kumar S., Tsai C.J., Nussinov R.. Temperature range of thermodynamic stability forthe native state of reversible tow stat proteins // Biochemistry.- 2003.-42.- P.4864-4873.
44. Mu A.K., Lim B.K., Hashim O.H., Shuib A.S. Detection of differential levels of proteins in the urine of patients with endometrial cancer: analysis using two-dimensional gel electrophoresis and o-glycan binding lectin // Int. J. Mol. Sci.- 2012.-13(8).- P.9489-9501.
45. DeSouza L., Diehl G., Rodrigues M.J., Guo J., Romaschin A.D., Colgan T.J., Siu K.W. Search for cancer markers from endometrial tissues using differentially labeled tags iTRAQ and cICAT with multidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry // J. Proteome Res.- 2005.-4(2).- P.377-386.
46. Yang E.C., Guo J., Diehl G., DeSouza L., Rodrigues M.J, Romaschin A.D., Colgan T.J., Siu K.W. Protein expression profiling of endometrial malignancies reveals a new tumor marker: chaperonin 10 // J. Proteome Res.- 2004.-3(3) - P.636-643.
47. Guo J., Yang E.C., Desouza L., Diehl G., Rodrigues M.J., Romaschin A.D., Colgan T. J., Siu K.W. A strategy for high-resolution protein identification in surface-enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry: calgranulin A and chaperonin 10 as protein markers for endometrial carcinoma // Proteomics.- 2005.-5(7).-P.1953-1966.
48. Dube V, Grigull J., DeSouza L.V., Ghanny S., Colgan T.J, Romaschin A.D, Siu K.W. Verification of endo-metrial tissue biomarkers previously discovered using mass spectrometry-based proteomics by means of immunohistochemistry in a tissue microarray format // J. Proteome Res.- 2007.-6(7).- P.2648-2655.
49. DeSouza L.V, Grigull J., Ghanny S., Dube V., Romaschin A.D., Colgan T.J., Siu K.W. Endometrial carcinoma biomarker discovery and verification using differentially tagged clinical samples with multidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry // Mol. Cell Proteomics.- 2007.-6(7).- P. 11701182.
50. Li Z., Huang C., Bai S., Pan X., Zhou R., Wei Y. Zhao X .Prognostic evaluation of epidermal fatty acid-binding protein and calcyphosine, two proteins implicated in endometrial cancer using a proteomic approach // International Journal of Cancer.- 2008.-123.- P. 2377-2383.
51. Li Z., Zhao X., Bai S., Wang Z., Chen L., Wei Y., Huang C. Proteomics identification of cyclophilin a as a potential prognostic factor and therapeutic target in endometrial carcinoma // Molecular and Cellular Pro-teomics.- 2008.- 7.- P. 1810-1823.
52. Choi K.J., Piao Y.J., Lim M.J., Kim J.H., Ha J., Choe W., Kim S.S. Overexpressed cyclophilin A in cancer cells renders resistance to hypoxia- and cisplatin-induced cell death // Cancer Research.- 2007.- 67.- P. 3654-3662.
53. Gonzalez-Santiago L., Alfonso P., Suarez Y., Nunez A., Garcia-Fernandez L.F., Alvarez E., Munoz A., Casal J.I. Proteomic analysis of the resistance to aplidin in human cancer cells // Journal of Proteome Research.-2007.- 6.- P. 1286-1294.
54. DeSouza L.V., Krakovska O., Darfler M.M., Krizman D.B., Romaschin A.D., Colgan T.J., Siu K.W. mTRAQ-based quantification of potential endometrial carcinoma biomarkers from archived formalin-fixed paraffin-embedded tissues // Proteomics.- 2010.- 10(17).- P3108-3116.
55. Maxwell G.L., Hood B.L., Day R., Chandran U., Kirchner D., Kolli V.S., Bateman N.W., Allard J., Miller C., Sun M., Flint M.S., Zahn C., Oliver J., Banerjee S., Litzi T., Parwani A., Sandburg G., Rose S., Becich M.J., Berchuck A., Kohn E., Risinger J.I., Conrads T.P. Proteomic analysis of stage I endometrial cancer tissue: identification of proteins associated with oxidative processes and inflammation // Gynecol. Oncol. -2011.- 121(3).- P.586-594.
56. Puljiz M., Puljiz Z., Vucemilo T., Ramie S., Knezevie F , Culo B , Alvir I , Tomica D., Danolie D. Prognostic significance of matrix metalloproteinases 2 and 9 in endometrial cancer // Coll. Antropol.- 2012.- 36(4).-P.1367-1372.
57. Xiao M., Yang S., Chen J., Ning X., Guo L , Huang K , Sui L. Overexpression of MMSET in endometrial cancer: a clinicopathologic study // J. Surg. Oncol.- 2013.- 107(4).- P.428-432.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ДЭ - дифференциально экспрессированных
EGFR, ErbB-1 - epidermal growth factor receptor
HIF - hypoxia-inducible factors ()
AFP - a-fetoprotein
TSH - temperature sensitive hemagglutinin
MIP-la - macrophage inflammatory protein-1a
MMP-7 - matrix metalloproteinase-7
MPO - myeloperoxidase
tPAI-1 - total plasminogen inhibitor-1
SCC-A - squamous cell carcinoma antigen
sICAM-1 - intercellular adhesion molecule 1
sVCAM-1 - vascular cell adhesion protein 1
TGF-a - transforming growth factor a
HE-4 - human epididymis protein 4
VEGF - vascular endothelial growth factor
