CC BY
272
DOI 10.23946/2500-0764-2018-3-1-90-101
СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ТАКСОНОМИИ, МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВАХ БИФИДОБАКТЕРИЙ
ЗАХАРОВА Ю.В., ЛЕВАНОВА Л.А.
ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России, г. Кемерово, Россия
LECTURE
CURRENT OPINION ON TAXONOMY, MORPHOLOGICAL, AND FUNCTIONAL PROPERTIES OF BIFIDOBACTERIA
YULIYA V. ZAKHAROVA, LYUDMILA A. LEVANOVA
Kemerovo State Medical University (22a, Voroshilova Street, Kemerovo, 650056), Kemerovo, Russian Federation
Резюме
В лекции представлены современные сведения по систематике бифидобактерий, основанные на комбинированном принципе таксономии, включающем фенотипические, геноти-пические и филогенетические характеристики бактерий. Приведены данные о новых и реклас-сифицированных видах и подвидах бифидобак-терий. Дана характеристика состава и общих признаков представителей семейства Bifidobac-teriaceae. Описаны морфология, особенности строения клеточной стенки бифидобактерий, современные данные о геноме и внехромосом-ных факторах наследственности. Уделено вни-
мание пилеподобным структурам как основным факторам адгезии, их строению, условиям и интенсивности образования у разных видов бифидобактерий. Показана роль некоторых са-харолитических ферментов бифидобактерий в адгезивном процессе. Представлены данные по физиологии бифидобактерий, в том числе особенностям метаболизма, ключевых ферментах, участвующих в сбраживании гексоз, описаны источники питания и условия роста, о чувствительности бифидобактерий к кислороду и их экологии.
Ключевые слова: бифидобактерии, таксономия, морфология, метаболизм, экология.
Engiish ► Abstract
Here we present current information on the taxonomy of bifidobacteria, which is based on their phenotypic, genetic and phylogenetic characteristics. We also provide the data on newly discovered and reclassified species and subspecies of bifidobacteria. Furthermore, we consider the composition of the Bifidobacteriaceae family. This lecture summarizes the general data on morphology, cell wall structure, genome, and
extrachromosomal inheritance in bifidobacteria. Particular attention is given to pili-like structures and saccharolytic enzymes responsible for adhesion. We then review key energy sources of bifidobacteria, their growth conditions, and specific enzymes involved in the fermentation of hexoses. Finally, we discuss ecological aspects related to bifidobacteria.
Keywords: bifidobacteria, taxonomy, morphology, metabolism, ecology.
Введение врачей различных специальностей. Это связано
В настоящее время бифидобактерии все ча- с тем, что бифидобактерии, являясь облигатны-
ще привлекают внимание исследователей и ми представителями нормальной микрофлоры
-•-•-
90
толстого кишечника, выполняют многочисленные функции, направленные на поддержание и сохранение здоровья человека. Кроме того, би-фидобактерии широко используются в качестве микроорганизмов, являющихся основой для изготовления пробиотических препаратов, биологически активных добавок и продуктов функционального питания, показания к применению которых все время расширяются. Однако в последние годы появляются отдельные сведения об участии бифидобактерий в патологических процессах, таких как, кариес, септические состояния у иммунодефицитных больных, что свидетельствует о том, что даже индигенная микрофлора при определенных состояниях может проявлять оппортунистические свойства.
Несмотря на то, что бифидобактерии были открыты еще в конце 19 века, сведения о них достаточно немногочисленны и противоречивы. Поэтому становится важным систематизировать и актуализировать данные по биологии и экологии бифидобактерий с учетом достижений отечественных и зарубежных исследователей.
Филогения и таксономическое положение бифидобактерий
Бифидобактерии впервые были обнаружены в 1899 году Tissier, который называл их "палочка бифидо". В начале 20 века, учитывая сходство бифидобактерий с лактобактериями, согласно 7-му изданию «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology», они были включены в род Lactobacterium. В 8-м издании руководства Берги бифидобактерии были уже выделены в отдельный род Bifidobacterium, название которого было первоначально предложено Orla-Jen-sen в 1924 году [1]. Род включал восемь видов и был отнесен в семейство Actinomycetaceae, порядка Actinomycetales, хотя строение пепти-догликана клеточной стенки бифидобактерий больше было похоже на пептидогликан микроорганизмов семейства Lactobacillaceae.
В 1980 году применение молекулярно-гене-тических методов анализа последовательности генов р-РНК подтвердило принадлежность бифидобактерий к группе «Актиномицетов». В настоящее время использование молекуляр-но-генетических методов позволило определить и уточнить таксономическое положение и классификацию различных представителей нормальной микрофлоры, в том числе и би-фидобактерий. Для исследования таксономии рода Bifidobacterium была использована поли-
меразно-цепная реакция (ПЦР) с видоспеци-фическими праймерами для генов 16S рРНК, выявляющих консервативные нуклеотидные последовательности [1]. При этом идентификация видов бифидобактерий даже с помощью молекулярно-генетических методов считается проблематичной в связи с присущей им геноти-пической гетерогенностью [1, 2]. Интеграция и анализ данных по фенотипическим, генотипи-ческим и филогенетическим характеристикам, получившие название полифазной или комбинированной таксономии, упорядочили номенклатуру и систематизацию представителей рода Bifidobacterium, реклассифицировав многие виды бифидобактерий [1].
Бифидобактерии относят к домену Bacteria, типу Actinobacteria, классу Actinobacteria, порядку Bifidobacteriales, семейству Bifidobacteri-aceae, роду Bifidobacterium [1, 2]. В составе рода Bifidobacterium насчитывают более 40 видов (таблица 1).
В настоящее время номенклатура и систематизация представителей рода Bifidobacterium не закончены и осуществляются в нескольких направлениях: выявляются и описываются новые виды, реклассифицируются уже существующие, в том числе и производственные штаммы [1, 3].
Общая характеристика семейства Bifido-bacteriaceae
Семейство Bifidobacteriaceae включает роды Bifidobacterium (более 45 видов на 2016 год), Alloscardovia (один вид), Aeriscardovia (один вид), Metascardovia (один вид), Parascardovia (один вид), Scardovia (один вид), которые являются близкими филогенетическими соседями, и род Gardnerella (один вид) [1].
Представители этого семейства представляют собой полиморфные палочки, расположенные поодиночке или образующие одноклеточные цепочки или скопления. Бактерии не имеют капсулы, не образуют спор, неподвижные и не ветвятся, в окраске по Граму - грамположи-тельны, кроме гарднерелл, которые окрашиваются грамвариабельно. Большинство представителей семейства Bifidobacteriaceae являются анаэробами. Среди бифидобактерий некоторые виды аэротолерантны к кислороду, а B. psychraerophilum, B. scardovii, и B. tsurumiense могут расти в аэробных условиях. Микроорганизмы рода Gardnerella имеют факультативно анаэробный тип дыхания, представители рода Aeriscardovia могут расти в аэробных условиях.
Таблица 1.
Виды и подвиды бифидобактерий
Table 1.
Species and subspecies of bifidobacteria
Название вида или подвида Авторы Год выделения и
Species or subspecies Authors реклассификации
Year of discovery and
reclassification
Bifidobacterium bifidum, species Tissier 1900
Orla-Jensen 1924
Bifidobacterium adolescent's, species Reuter 1963
Bifidobacterium breve, species Reuter 1963
Bifidobacterium animalis, species Mitsuoka 1969
Scardovi and Trovatelli 1974
Bifidobacterium animalis subsp. animalis subsp. nov. Mitsuoka 1969
Masco et al. 2004
Bifidobacterium asteroids, species Scardovi and Trovatelli 1969
Bifidobacterium thermophilum corrig., species. Mitsuoka 1969
Bifidobacterium pseudolongum, species. Mitsuoka 1969
Bifidobacterium pseudolongum subsp. pseudolongum, Mitsuoka 1969
subsp. nov. Yaeshima et al. 1992
Bifidobacterium coryneforme species nov., nom. rev. Scardovi and Trovatelli 1969
Biavati et al. 1982
Bifidobacterium suis, species Matteuzzi et al. 1971
Bifidobacterium catenulatum, species Scardovi and Crociani 1974
Bifidobacterium pullorum, species Trovatelli et al. 1974
Bifidobacterium angulatum, species Scardovi and Crociani 1974
Bifidobacterium boum, species Scardovi et al. 1979
Bifidobacterium choerinum, species Scardovi et al. 1979
Bifidobacterium cuniculi, species Scardovi et al 1979
Bifidobacterium pseudocatenulatum, species Scardovi et al. 1979
Bifidobacterium subtile, species nov. Biavati et al. 1982
Bifidobacterium minimum, species nov. Biavati et al. 1982
Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum, Biavati et al. 1982
comb. nov. Yaeshima et al. 1992
Bifidobacterium merycicum, species nov. Biavati and Mattarelli 1991
Bifidobacterium ruminantium, species nov. Biavati and Mattarelli 1991
Bifidobacterium saeculare, species nov. Biavati et al. 1992
Bifidobacterium denticolens, species nov. Crociani et al. 1996
Bifidobacterium animalis subsp. lactis, comb. nov. Meile et al. 1997
Masco et al. 2004
Bifidobacterium thermacidophilum, species nov. Dong et al. 2000
Bifidobacterium scardovii, species nov. Hoyles et al. 2002
Bifidobacterium thermacidophilum subsp. porcinum, Zhu et al. 2003
subsp. nov.
Bifidobacterium thermacidophilum subsp. Dong et al. 2000
thermacidophilum, subsp. nov. Zhu et al. 2003
Bifidobacterium psychraerophilum, species nov. Simpson et al. 2004
Bifidobacterium tsurumiense, species nov. Okamoto et al. 2008
Bifidobacterium bombi, species nov. Killer et al. 2009
Bifidobacterium mongoliense, species nov. Watanabe et al. 2009
Bifidobacterium stercoris, species nov. Kim et al. 2010
Bifidobacterium bohemicum, species nov. Killer et al. 2011
Bifidobacterium actinocoloniiforme, species nov. Killer et al. 2011
Bifidobacterium stellenboschense, species nov. Endo et al. 2012
Bifidobacterium biavatii, species nov. Endo et al. 2012
Bifidobacterium saguini, species nov. Endo et al. 2012
Bifidobacterium callitrichos, species nov Endo et al. 2012
Bifidobacterium reuteri, species nov. Endo et al. 2012
Bifidobacterium crudilactis, species nov. Delcenserie et al. 2013
Bifidobacterium moukalabense, species nov. Tsuchida et al. 2014
Bifidobacterium aesculapii, species nov. Modesto et al. 2014
Представители семейства не гидролизуют желатин, не продуцируют индол, не имеют ок-сидазы, но обладают фруктоза-6-фосфокетола-зой, которая расщепляет фруктозо-6-фосфат до ацетилфосфата и эритрозо-4-фосфата. Содержание G+C пар в ДНК колеблется от 42 до 67
мол.%. Они хемоорганотрофы, имеющие ферментативный тип метаболизма, и разлагают различные углеводы до кислоты, без образования газа. Оптимальная температура роста составляет 30-39°С [1]. Типовой род: Bifidobacterium (Orla-Jensen, 1924).
Морфология и ультраструктура бифидобактерий
Представители рода Bifidobacterium являются палочками, размером 0,5-1,3x1,5-8 мкм. Они обычно несколько изогнуты, имеют разветвления в виде Y- или V-формы, с булавовидными вздутиями на концах. Иногда встречаются раздутые кокковидные формы. В мазках клетки располагаются одиночно, парами, иногда цепочками, палисадом или розетками. Грампо-ложительные, окрашивание часто неравномерное, не образуют спор, неподвижны. Микроскопическая картина каждого вида бифидобак-терий имеет особенности по размеру, форме и расположению клеток [1, 4].
Наиболее часто встречающиеся морфологические формы среди бифидобактерий представлены на рисунке 1.
Морфология бифидобактерий зависит от условий культивирования. При выращивании би-фидобактерий на печеночном агаре или в молоке ветвление исчезает, появляется много гранулированных форм, которые иногда можно принять за кокки, клетки становятся грамвари-абельными. Ветвление чаще происходит в среде, неполноценной в отношении источников питания. Появление полиморфных клеток у бифи-добактерий индуцируется ионами металлов (калия, натрия, лития, цезия), а также исключением из среды культивирования одной из четырех аминокислот (аланина, серина, аспарагиновой кислоты, L(+)-глутаминовой кислоты). Среди штаммов, выделенных из кишечника взрослых людей, преобладают палочковидные и булавовидные формы; ветвящиеся палочки чаще встречаются у детей грудного возраста. На ранних стадиях развития у бифидобактерий преобладают палочковидные формы, а при дальнейшем культивировании образуются разветвленные нити с многочисленными перегородками в основном стволе и ответвлениях [1, 4].
В клеточных стенках бифидобактерий содержится значительное количество полисахаридов, как правило, галактоза, глюкоза с рам-нозой [1]. О наличии липотейхоевых кислот, которые не разрушаются после применения лизоцима, стало известно в 1983 году. Имму-нохимические исследования показали, что ли-потейхоевые кислоты являются общим антигеном в пределах рода Bifidobacterium. Кроме того, белки и липотейхоевые кислоты обусловливают самостоятельно либо в составе динамических комплексов гидрофобный характер
поверхности бифидобактерий [5]. Поверхностные белковые компоненты участвуют в адгезии бифидобактерий [5, 6]. Изучение клеточных структур (липотейхоевых кислот, белков) и взаимодействие клеток с субстратом необходимы для понимания механизмов, которые регулируют бактериальную адгезию и, следовательно, колонизацию.
Фосфолипидный состав клеточной стенки некоторых бифидобактерий был изучен еще в 1971 году. Различия в составе полиглицерина фосфолипидов и аминоацилфосфатидилглице-рола помог различить два рода. Изменения состава поверхностных бактериальных липидов в процессе роста на желчесодержащих средах позволило говорить, что липидная композиция напрямую влияет на адгезивные свойства би-фидофлоры [6, 7].
В настоящее время изучено большое число факторов адгезии бифидобактерий [6]. Так, с помощью атомно-силовой микроскопии у би-фидобактерий выявлено наличие пилеподоб-ных структур. Выросты, напоминающие пили, обнаружены у штаммов B.bifidum, B.longum subsp. \ongum, B.dentium, B.adolescentis и B.an-imalis subsp. lactis. Ворсинки бифидобактерий организованы как у большинства грамположи-тельных бактерий и характеризуются ковалент-ной полимеризацией субъединиц пилина, которая осуществляется посредством транспепти-дазного фермента сортазы [8].
В секвенированных геномах B. dentium, B. \ongum subsp. \ongum, B. bifidum, B. adolescen-tis, и B. anmalis subsp. \actis обнаружены гены, кодирующие субъединицы пилина и сортазы. Однако эти гены отсутствуют в геноме B. \ong-um subsp. \nfantis. Наибольшее количество генов, кодирующих пили, идентифицировано в геноме B. dentium, поэтому данный микроорганизм обладает широким адаптивным потенциалом и обнаруживается в разных экологических нишах [8, 9].
Кроме пилеподобных структур у бифидо-бактерий присутствуют и афимбриальные факторы адгезии [6]. Это поверхностно-связанные белки с ферментативной активностью, опосредующие колонизацию кишечника человека через деградацию внеклеточного матрикса. Анализ протеинов B. bifidum с помощью масс-спек-трометрии позволил идентифицировать в качестве адгезина фермент трансальдолазу. Этот фермент участвует в пентозофосфатном пути и отвечает за конверсию фруктозо-6-фосфата и
Рисунок 1.
Морфология различных видов рода Bifidobacterium. фазово-контрастные микрофотографии (увеличение 1500*)
■ в» V
I (ч
±"Г
Figure 1.
Morphology of various Bifidobacterium species. Phase-contrast microscopy, x1500 magnification
m ■ -
iM .
ti^ni I/
да®
«ж. л?*
В.——J 1 Ti ■ »¡^.'i:. ^яршк. л
10 ^^^Sf11 ЙТШЯИЙ
(Ш^МшмМ --Ы & --
I Л1 ^ к ^^ ^ 1, B. bifidum; 2, B. adolescentis; 3, B. angulatum; 4a, B.
| ^ ¿V^f ' ^VV^ ^ySi! animalis subsp. animalis; 4b, B. animalis subsp. lactis;
» » ^ j ■ 5, B. asteroides; 6, B. bombi; 7, B. boum; 8, B. breve; 9, B.
I.C\4 Г,ч |\ %j5 fc,' catenulatum; 10, B. choerinum; 11, B. coryneforme; 12; B.
£/jfy Ц < cuniculi;
эритрозо-4-фосфата в седогептулозу-7-фосфат и глицеральдегид-3-фосфат, позднее включающийся в гликолиз. Хотя фермент расположен на цитоплазматической мембране, у нескольких видов бифидобактерий он обнаружен во внеклеточном пространстве или на поверхности бактериальной клетки [1]. Установлена связь между адгезией к муцину и аутоагрегацией бифидофлоры. Аутоагрегация играет важную роль в выживаемости бактерий при транзите по желудочно-кишечному тракту, обеспечивая возможность колонизации, как минимум, тон-
кого кишечника. Агрегативный фенотип про-биотических бактерий может также обеспечивать их коагрегацию с патогенными микроорганизмами, тем самым способствуя выведению возбудителя из разных отделов желудочно-кишечного тракта и уменьшению их вирулентности [1, 6, 10].
Еще одним белком-ферментом из группы са-харолитических, участвующим в адгезии би-фидобактерий, является енолаза. Енолаза обеспечивает формирование фосфоенолпирувата из 2-фосфоглицерата. Этот белок имеет срод-
том 3 № 1 фундаментальная ЛЕКЦИЯ П) ЯВИЛ®
юга а, И. I и клиническая медицина лслцпл ^^ВГ*! -•-•-
К тРт:
ЖъЖ
'¿г1
' ^ЩЯ 21 " 22 ШШГЩ
Ж)
I тт шШ шш^
13, B. dentium; 14, B. gallicum; 15, B. gallinarum; 16, B. indicum; 17a, B. longum subsp. longum; 17b, B. longum subsp. infantis; 17c, B. longum subsp. suis; 18, B. magnum; 19, B. merycicum; 20, B. minimum; 21, B. mongoliense; 22, B. pseudocatenulatum.
ство к человеческому плазминогену. Взаимодействие с системой плазминогена/плазмина хозяина представляет собой новый компонент в молекулярных перекрестных взаимодействиях между бифидобактериями и организмом человека. Плазминоген является проферментом плазмина, трипсиноподобной сериновой проте-азой с широкой субстратной специфичностью. Он синтезируется в основном гепатоцитами, однако выявлены и другие источники плазми-ногена, в том числе плазминоген синтезируется в кишечнике. В активной форме плазмин уча-
ствует в фибринолизе и деградации экстрацел-люлярного матрикса и базальной мембраны. С прикреплением плазминогена на поверхности бактериальной клетки и его последующим преобразованием в плазмин, микроорганизм приобретает поверхностно-связанный белок с протеолитической активностью. Это облегчает миграцию бактерий между физическими и молекулярными барьерами макроорганизма и позволяет удовлетворять питательные потребности микробов в ходе колонизационного процесса. Недавно продемонстрировано действие
енолазы как плазминоген-связывающего рецептора у трех видов бифидобактерий - B. lac-tis, B. bifidum и B. longum. При этом енолаза В. lactis отличается меньшим сродством к плаз-миногену по сравнению с енолазой патогенных микроорганизмов - Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae. Дело в том, что у енолазы В. lactis присутствует только один сайт связывания с человеческим плазминогеном [9].
В адгезии бифидобактерий на эпителиальных клетках принимают участие также липо-тейхоевые кислоты (ЛТК). У всех грамположи-тельных бактерий они состоят из 1,3-связанных цепей полиглицеролфосфата и гликолипидных фрагментов. Липотейхоевые кислоты закреплены в клеточной стенке посредством липидных остатков. У бифидобактерий ЛТК имеют уникальное строение, что обусловлено расположением анионных глицерофосфатных цепочек в виде боковых радикалов на галактофуранано-вых цепях. У B. bifidum, B. breve, и B. longum имеются два типа ЛТК, которые отличаются по содержанию жирных кислот [5]. Иногда дополнительные остатки жирных кислот могут быть присоединены к углеводному остатку липидно-го якоря, такому как галактопираноза. У бифидобактерий отмечается большое содержание в составе липидной части молекулы олеиновой и пальмитиновой кислот, доля которых достигает 40%, тогда как у стрептококка, например, их содержание не превышает 24%. У разных штаммов и видов бифидобактерий ЛТК отличаются по длине ß-гликановых и ß-галактофуранано-вых цепей, а также числом глицерофосфатных цепочек, т.е. как и у большинства микроорганизмов эти полимеры имеют таксономическое значение. С помощью ЛТК бифидобактерии обратимо связываются с колоноцитами, при этом взаимодействие c эпителиальными клетками происходит посредством липидной части кислот [5].
Таким образом, бифидобактерии обладают широким набором факторов адгезии, что позволяет им доминировать в кишечном микросим-биоценозе и успешно конкурировать в борьбе за сайты связывания на слизистой с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.
Генетика бифидобактерий
Исследование генома бифидобактерий является важным шагом к пониманию механизмов взаимодействия между микробами и хозяином. Недавно были полностью секвенированы геномы B. adolescentis, B.animalis subsp. lactis,
B.longum subsp. longum, B. longum subsp. infan-tis. Эти геномы показывают высокое сходство последовательностей по всей хромосоме с некоторыми особенностями для каждого штамма [1].
В геноме B.longum subsp. longum, выделенной от младенца, было определено 1730 нукле-отидных последовательностей с соотношением G+C пар равным 60 моль%. Биоинформационный анализ выявил несколько особенностей, которые могут объяснить успешную адаптацию этого микроорганизма в толстой кишке. У B.longum subsp. longum неожиданно большое количество белков оказались специализированы для катаболизма различных олигосаха-ридов, некоторые, возможно, являются редкими или новыми гликозилгидролазами, действующими на неперевариваемые волокна или на производные гликопротеинов и гликоконъюга-тов. Это умение утилизировать большое количество разнообразных питательных веществ, способствует повышению конкурентоспособности и устойчивости бифидобактерий в толстой кишке [1].
Также был секвенирован геном В. longum subsp. infantis. Этот крупнейший геном среди бифидобактерий, состоящий из 2832748 ну-клеотидных пар. Это геном отражает конкурентную стратегию, ориентированную на использование молока, которое имеет огромную ценность для новорожденного. Несколько хромосомных локусов отражают адаптационный потенциал данных бифидобактерий, в том числе 43 kbp кластер, который осуществляет кодировку внеклеточных белков и пермеаз, активных в отношении олигосахаридов молока. Анализ олигосахаридов, присутствующих в грудном молоке, и возможностей метаболизма у «младенческих» штаммов является основой для гипотезы о трёх эволюционных механизмах: грудное молоко-младенец-бифидобак-терии. Грудное молоко является источником олигосахаридов, которые не перевариваются в кишечнике ребенка, а используются бифидо-бактериями, которые играют важную роль для младенческого организма.
При исследовании генома 1461 изолятов бифидобактерий, относящихся к 24 видам, у 20% были обнаружены плазмиды [1]. Однако только четыре вида этих бактерий содержали внехромосомные факторы наследственности, а именно Bifidobacterium longum subsp. longum, Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum,
Bifidobacterium asteroides и Bifidobacterium in-dicum. Bifidobacterium longum subsp. longum имеют несколько плазмид (1.25-9.5 Мда), B. pseudolongum subsp. globosum, содержит одну плазмиду из трех классов молекулярных масс (13,5, 24,5 и 46 Мда). B. indicum содержат одну плазмиду массой 22 Мда. Примечательно, что Bifidobacterium longum subsp. infantis, тесно связанная с Bifidobacterium longum subsp. longum, не содержала плазмид, хотя штаммы этих видов были изолированы от одних и тех же людей. Позже плазмиды были также выделены у B.breve. Все плазмиды до сих пор плохо изучены. Только у Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum обнаруживается связь между плазмидными генами и ауксотрофностью по L-лейцину. У остальных бифидобактерий фе-нотипические свойства не коррелируют с наличием плазмид [1].
Питание и условия роста бифидобактерий
Важными компонентами для стимулирования роста бифидобактерий являются биотин, кальций пантотенат и пиридоксин. Также стимулирует рост бифидофлоры панкреатин. Для B. asteroides незаменимы парааминобензойная и фолиевая кислоты. Исследование потребностей в питании девяти видов Bifidobacterium человеческого и животного происхождения, в том числе B.dentium, показало большую гетерогенность среди видов по этому признаку, но чаще всего необходимыми питательными веществами для роста являются пантотенат кальция и рибофлавин. Большое количество бифи-добактерий в качестве единственного источника азота могут использовать соли аммония. Однако B. choerinum, B. cuniculi, B.magnum, B. pseudolongum subsp. globosum и B. longum sub-sp. suis не растут в отсутствие органического азота. Активность ферментов, таких как глу-таматдегидрогеназа и глутаминсинтетазы позволяет бифидобактериям ассимилировать аммиак. В средах с органическими соединениями азота значительное количество аминокислот продуцируют виды B.adolescentis, B. animalis, B.dentium, Bifidobacterium longum subsp. infantis и Bifidobacterium thermophilum. В общем пуле продуцируемых бифидобактериями аминокислот большая доля приходится на сумму алани-на, аспарагиновой кислоты и валина. B.bifidum способны продуцировать треонин [1].
Сравнительные исследования по синтезу водорастворимых витаминов (цианокобаламина, фолиевой и пантотеновой кислоты, никотино-
вой кислоты, пиридоксина, рибофлавина, тиамина) среди видов, выделенных из человеческих фекалий, показали, что многие штаммы могут синтезировать все перечисленные витамины, за исключением пантотеновой кислоты и рибофлавина [1]. Концентрация витаминов широко варьирует у различных видов или штаммов. Также была продемонстрирована способность бифидобактерий синтезировать биотин.
Некоторые факторы, получившие название «бифидогенных-факторов», способны стимулировать рост именно бифидобактерий. Первый «бифидогенный-фактор» был обнаружен в 1954 году, он был найден в грудном молоке. Этот фактор был позже найден в составе глико-протеинов и олигосахаридов, содержащих N-а-цетил^-глюкозамин. Другим стимулирующим бифидобактерии фактором, как предполагали, является низкое содержание белка в человеческом молоке [1, 11]. Сниженное содержание белка в молоке уменьшает буферную емкость и таким образом способствует формированию кислотной среды в кишечнике, что должно способствовать росту бифидобактерий. Однако в экспериментальных исследованиях [1, 11] использование сниженного содержания протеина в молочной смеси (1,2 г/100 мл) не увеличивало количество бифидобактерий.
Росту бифидобактерий способствует лакто-феррин - железо-связывающий белок. Лакто-феррин из зрелого коровьего молока увеличивает in vitro рост B.breve и B. infantis в зависимости от концентрации, в то время как лакто-феррин человека способствует росту B.bifidum, но не B. breve и B. infantis [1].
Олиго- и полисахариды также классифицируются как «бифидогенные факторы». Было установлено, что олигомерные формы некоторых моносахаридов используются бифи-дофлорой более эффективно, чем мономерные [1, 11, 12]. Среди многочисленных олигосаха-ридов, олигосахариды сои, которые состоят в основном из трисахарида раффинозы и тетра-сахарида стахиозы, стимулируют рост бифидо-бактерий. Недавно были выявлены и названы «бифидогенными факторами» фруктоолигоса-хариды (ФОС), синтетические олигосахари-ды, и трансгалактозилированные олигосахари-ды (ТОС). Гликоолигосахариды также способны стимулировать рост бифидобактерий, хотя и менее интенсивно, чем ФОС и ТОС [11, 12]. Полисахарид инулин увеличивает количество фекальных бифидобактерий, имея похожий
пребиотический эффект, что и олигофруктоза.
Отношение бифидобактерий к кислороду
Бифидобактерии - анаэробные микроорганизмы. Они, как правило, не развиваются в аэробных условиях. Однако чувствительность к кислороду варьирует в зависимости от штамма или вида. Большинство видов не развиваются в атмосфере СО2-обогащенного воздуха (90% воздуха : 10% СО2), но Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum, Bifidobacterium thermophilum, и Bifidobacterium longum subsp. suis способны продуцировать каталазу. B. asteroides растет в этих условиях и также является каталазоположительными. B. indicum ведет себя аналогично, но становятся каталазапо-ложительными, только если к среде добавляется гемин. Большинство недавно описанных видов - B. mongoliense, B. psychraerophilum, и B. tsurumiense - способны расти в аэробных условиях [1].
Способность бифидобактерий переносить временные контакты с атмосферным кислородом связана с системами никотинамидаденин-динуклеотид восстановленная форма - окси-даза (НАДН - оксидаза), никотинамидаденин-динуклеотид восстановленная форма - перок-сидаза (НАДН - пероксидаза). Показано, что В. breve, В. infantis и В. longum способны к слабому росту в условиях частичной аэрации. Эти виды бифидобактерий могут поглощать кислород, так как содержат НАДН - оксида-зу, НАДН - пероксидазу. Надо отметить, что увеличению устойчивости бифидобактерий к кислороду способствует молочная кислота, вырабатываемая ими в процессе метаболизма углеводов [1].
Метаболизм и метаболические пути расщепления гексоз
Брожение из гексоз происходит у представителей рода Bifidobacterium через последовательность реакций (бифидо-шунт), которые показаны на рисунке 2. Многие ферменты для расщепления моно- и дисахаридов в фрукто-за-6-фосфатном шунте не выявлены, но установлено присутствие арабинозидаз, А и В-га-лактозидаз, глюкозидаз, гексозаминидаз, ину-линазы, изомальтазы, маннозидазы, неопулла-назы и ксиланазы [1, 12-14].
В дополнение к этим ферментам, ответственным за расщепление сложных углеводов, были найдены восемь высокоаффиных олиго-сахарид-транспортеров и этим можно объяснить олигомирезацию сахаров [13, 14].
ФОС являются одними из сахаров, которые квалифицируются как пребиотики. Они включают в себя разнообразные семейства естественных олигосахаридов, используемых в продуктах питания и в виде пищевых добавок.
Они представляют собой неперевариваемые олигосахариды и состоят из коротких и средних цепей фруктозы, связанных Ё-(2-1) связью, которые в свою очередь соединены с глюкозой. Из-за этих Ё-(2-1) связей ФОС устойчивы к действию ферментов млекопитающих и, таким образом, способны достичь толстой кишки, где они служат источником легкоусвояемых субстратов для бифидобактерий. Инвертазы катализируют гидролиз Ё-(2-1) гликозидных связей сахарозы, которая распадается на смесь глюкозы и фруктозы в эквимолярных соотношениях. Недавние исследования о деятельности инвер-таз продемонстрировали способность бифи-добактерий расщеплять ФОС, а также сахарозу. Экзоинулазы были обнаружены у B.infantis (АТСС 15697T). Этот фермент представляет собой мономерный белок (М-70 000 кДа), который катализирует деградацию инулина, 1-ке-стозы, нистозы, раффинозы и сахарозы [12, 13].
Установлено, что бифидобактерии обладают уреазой. Уреазная активность была найдена у всех видов бифидобактерий за исключением B. cuniculi. Наибольшую уреазную активность имеют Bifidobacterium longum subsp. suis, при чем более 80% бифидобактерий этого вида являются уреолитическими. Среди B. breve и Bifidobacterium longum subsp. longum только 10% штаммов являются уреолитическими, а B.bif-idum характеризуются низкой уреазной активностью [1].
Экология бифидобактерий
Бифидобактерии являются резидентами пищеварительного тракта младенцев и взрослых [15]. Однако в исследованиях по изучению экологии бифидобактерий, проведенных кафедрой микробиологии Болонского университета (Италия), изолировано более 7000 штаммов из разных источников, а не только из кишечника [1].
Выделенные штаммы хранятся и поддерживаются в коллекции BUSCOB (Bologna University Scardovi Collection of Bifidobacteria) [1]. Исследования показали, что B.bifidum и B. longum subsp. longum чаще всего обнаруживают в кишечнике детей и взрослых, в то время как B.dentium вместе с другими представителями семейства Bifidobacteriaceae, такими как Scardovia inopinata и Parascardovia denticolens, являются
ТОМ 3 № 1 фундаментальная
iuivio, im-i и клиническая медицина
Рисунок 2.
Схема утилизации глюкозы
бифидобактериями (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, second edition)
Figure 2.
Metabolism of glucose by bifidobacteria (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, second edition)
типичными представителями кариесных очагов [16]. B. adolescentis, B. bifidum, Bifidobacterium longum subsp. longum, и B. breve обычно обнаруживают во влагалище здоровых женщин [17]. Кроме того, бифидобактерии получены от многих животных и от медоносных пчел [1].
Одиннадцать видов бифидобактерий были обнаружены в сточных водах: шесть человеческого происхождения и пять от животных [1]. B. minimum и B. subtile были первоначально изолированы из сточных вод. Эти два вида не могли выделить из других биотопов в течение двух
десятилетий, таким образом, вставал вопрос о возможном развитии бифидобактерий в экс-траэнтеральных экологических нишах. Однако в 2003 году B. minimum были изолированы из слепой кишки кролика, а в 2009 году B. subtile были изолированы от человека с кариозным поражением зубов. Это подтвердило, что канализация не является средой обитания для бифидо-бактерий. B. mongoliense выделили из кумыса. Недавно выделенные B. thermacidophilum sub-sp. thermacidophilum и B. thermacidophilum были изолированы из анаэробного варочного котла, который использовался для очистки сточных вод от отходов фермерского производства. Эти виды отличаются от других видов бифидобактерий по их способности расти при 49,5°С и в средах с рН 4.0. В 2002 году из человеческой крови были изолированы B. scardovii. Еще один недавно описанный вид B. tsurumiense изолирован из зубного налета хомячка, а в 2009 году из пищеварительного тракта шмелей выделены B. bombi. Таким образом, не смотря на анаэробный тип дыхания и сложные питательные потребности, бифидобактерии являются микроорганизмами с широким адаптивным потенциалом, которые можно выделить не только из различных биотопов человека и животных, но и из объектов окружающей среды.
Заключение
В связи с высокой генотипической гетерогенностью таксономия бифидобактерий ба-
зируется на сочетании молекулярно-генети-ческих, фенотипических и филогенетических признаков. Использование комбинированного принципа (полифазная таксономия) позволило реклассифицировать множество видов бифидобактерий.
Бифидобактерии обладают очень большим набором фимбриальных и афимбриальных ад-гезинов, что позволяет им конкурировать в борьбе за сайты связывания на слизистой кишечника с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.
Исследование генома бифидобактерий раскрывает высокий адаптационный потенциал данных микроорганизмов к симбиотическим взаимоотношениям с человеком. Адаптационная пластичность обусловлена гетерогенностью бифидобактерий по отношению к температуре и кислороду, которая варьирует в зависимости от штамма и вида. Кроме того, би-фидобактерии обладают широким набором сахаролитических ферментов, позволяющим им сбраживать огромное количество гексоз через уникальный «бифидо-шунт». Благодаря экологической пластичности бифидобактерии можно обнаружить не только в различных биотопах человека, животных и насекомых, но их также можно выделить из окружающей среды, что изменяет мнение о том, что они являются прихотливыми анаэробными микроорганизмами, которые «зависят» от организма хозяина-симбионта.
Литература / References:
1. Whitman WB, Goodfellow M, Kämpfer P, Busse H-J, Trujillo ME, Ludwig W, et al. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., Vol. 5, parts A and B, Springer-Verlag, New York, 2012: 2031 p. 2 5.
2. Levanova LA, Zakharova YuV. Systematics, taxonomy and classification of bacteria. Fundamental and Clinical Medicine. 2017; 1(2): 91-101. Russian (Леванова Л.А., Захарова Ю.В. 6. Систематика, таксономия и классификация бактерий // Фундаментальная и клиническая медицина. 2017. № 1 (2).
С. 91-101).
3. Salgina AV, Bondarenko TA, Ivanova EV, Perunova NB. Comparison of methods for identification of the genus 7. Bifidobacterium. Vestnik of Orenburg State University. 2014; 13 (174): 92-95. Russian (Салгина А.В., Бондаренко Т.А., Иванова Е.В., Перунова Н.Б. Сравнение методов идентификации представителей рода Bifidobacterium // Вестник Оренбургского государственного университета. 2014. № 13 (174). С. 92-95).
4. Amerhanova AM. Morphological variability of microorganisms
of bifidobacterium genus. Public Health and Environment. 2012; 8. (12): 33-35. Russian (Амерханова А.М. Морфологическая
изменчивость микроорганизмов рода бифидобактериум // Здоровье населения и среда обитания. 2012. №12. С. 3335).
Percy MG, Grundling A. Lipoteichoic acid synthesis and function in gram-positive bacteria. Annu Rev Microbiol. 2014; 68: 81-100.
Zakharova YuV. Factors of adhesion of bifidobacteria. Journal of Microbiology, Epidemiology, and Immunology. 2016; (5): 80-87. Russian (Захарова Ю.В. Факторы адгезии бифидобактерий. Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016. № 5. С. 80-87). Zakharova Yu, Sukhikh AS. Chromatographic analyses of membrane fatty acid Bifidobacterium with different hydrophobicity. Sorption and Chromatographic Processes. 2015; 6 (15): 280-287. Russian (Захарова Ю.В., Сухих А.С. Хроматографический анализ жирных кислот клеточных стенок бифидобактерий с разной гидрофобностью // Сорбционные и хроматографические процессы. 2015. № 6 (15). С. 280-287).
Turroni F, Serafini F, Mangifesta M, Arioli S, Mora D, van Sinderen D, et al. Expression of sortase-dependent pili of
Bifidobacterium bifidum PRL2010 in response to environmental gut conditions. FEMS Microbiol Lett. 2014; 357 (1): 23-33.
9. Wei X, Yan X, Chen X, Yang Z, Li H, Zou D, et al. Proteomic analysis of the interaction of Bifidobacterium ¡ongum NCC2705 with the intestine cells Caco-2 and identification of plasminogen receptors. J Proteomics. 2014;108: 89-98.
10. Milani C, Turroni F, Duranti S, Lugli GA, Mancabelli L, Ferrario C, et al. Genomics of the genus Bifidobacterium reveals species-specific adaptation to the glycan-rich gut environment. Appl Environ Microbiol. 2015; 82(4): 980-991.
11. Gibson GR, Rastall RA. Prebiotics: development and applications. John Wiley and Sons, Ltd, 2006: 256.
12. Sannohe Y, Fukasawa T, Koda J, Kubota H, Kanegae M. Comparison of the growth of Bifidobacteria in two culture media containing either 1-kestose (GF2 ) or nystose (GF3). Bioscience Microflora. 2008; 27(1): 13-17.
13. Turroni F, Strati F, Foroni E, Serafini F, Duranti S, van Sinderen
D, et al. Analysis of predicted carbohydrate transport systems encoded by Bifidobacterium bifidum PRL2010. Appl Environ Microbiol. 2012; 78(14): 5002-5012.
14. González-Rodríguez I, Gaspar P, Sánchez B, Gueimonde M, Margolles A, Neves AR. Catabolism of glucose and lactose in Bifidobacterium animalis subsp. lactis, studied by 13C nuclear magnetic resonance. Appl Environ Microbiol. 2013; 79(24): 7628-7638.
15. Sivieri K, Bassan J, Peixoto G, Monti R. Gut microbiota and antimicrobial peptides. Anaerobe. 2017; 44: 48-50.
16. Beighton D, Al-Haboubi M, Mantzourani M, Gilbert SC, Clark D, Zoitopoulos L, et al. Oral Bifidobacteria: caries-associated bacteria in older adults. J Dent Res. 2010; 89(9): 970-974.
17. Freitas AC, Hill JE. Quantification, isolation and characterization of Bifidobacterium from the vaginal microbiomes of reproductive aged women. Anaerobe. 2017; 47: 145-156.
Сведения об авторах
Захарова Юлия Викторовна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии, ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Кемерово, Россия. Вклад в статью: написание лекции, поиск литературы.
Леванова Людмила Александровна, доктор медицинских наук, заведующая кафедрой микробиологии, иммунологии и вирусологии, ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Кемерово, Россия.
Вклад в статью: написание и оформление лекции.
Authors
Dr. Yuliyа V. Zakharova, MD, PhD, Associate Professor, Department of Microbiology, Immunology and Virology, Kemerovo State Medical University, Kemerovo, Russian Federation. Contribution: performed a literature search; wrote the manuscript.
Prof. Lyudmila A. Levanova, MD, PhD, Head of the Department of Microbiology, Immunology and Virology, Kemerovo State Medical University, Kemerovo, Russian Federation. Contribution: wrote the manuscript.
Корреспонденцию адресовать:
Захарова Юлия Викторовна
650056, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22 а,
E-mail: yvz@bk.ru
Corresponding author:
Dr. Yuliya V. Zakharova,
22a Voroshilova Street, Kemerovo, 650056, Russian Federation E-mail: yvz@bk.ru
Статья поступила: 30.12.17г. Принята к печати: 01.03.18г.
Acknowledgements: There was no funding for this project.
