Статья поступила в редакцию 04.04.2020 г.
Клинышкова Т.В., Миронова О.Н.
Омский государственный медицинский университет, БУЗОО «Клинический диагностический центр»,
г. Омск, Россия
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ ПРИ CIN, АССОЦИИРОВАННЫХ С ВПЧ
Цель исследования - определить частоту коэкспрессии p16/Ki-67 в цервикальном эпителии больных с ВПЧ-ассоциированными CIN различной степени в сравнении с пациентками без цервикальной патологии по данным имму-ноцитохимического исследования.
Материалы и методы. В исследование включены 62 женщины с цервикальной ВПЧ-инфекцией и 13 женщин группы контроля. Пациентки с CIN1 составили 1-ю основную группу (n = 21), женщины с CIN2-CIN3 - 2-ю основную группу (n = 26), группу сравнения составили пациентки с латентной ВПЧ-инфекцией (n = 15). Методы исследования: жидкостная цитология, кольпоскопическое, гистологическое исследование; методы определения ДНК ВПЧ ВР; иммуноцитохи-мическое исследование для определения двойного окрашивания маркеров р16/й-67, статистический анализ. Результаты. На фоне ВПЧ-инфекции, как в 1-й основной группе пациенток с CIN1, так и в группе сравнения пациенток с NILM, зафиксированы единичные случаи двойного окрашивания маркеров p16 и Ki-67 без существенных различий между группами (р = 0,44). Во 2-й основной группе пациенток с CIN2, CIN3 коэкспрессия p16 и Ki-67 была отмечена у каждой второй женщины, она доминировала относительно 1-й группы и группы сравнения (р = 0,003, р = 0,005 соответственно). При отсутствии ВПЧ в группе контроля установлено отсутствие двойного окрашивания маркеров. Заключение. Не установлено различий коэкспрессии при CIN1 в сравнении с латентной ВПЧ-инфекцией и группой контроля. При CIN 2+, ассоциированной с ВПЧ ВР, в два раза повышена частота иммуноцитохимического подтверждения экспрессии р16/й-67 в сравнении с CIN1, что повышает риск прогрессирования предрака. При выборе дифференцированной тактики ведения пациенток с CIN на фоне ВПЧ необходимо учитывать данные пролиферативного потенциала цервикального эпителия.
Ключевые слова: CIN; ВПЧ; CINtec PLUS; p16ink4a; Ki-67
Klinyshkova T.V., Mironova O.N.
Omsk State Medical University,
Clinical Diagnostic Center, Omsk, Russia
CURRENT APPROACHES FOR HPV - ASSOCIATED CIN
The aim of the study was to determine the frequency of expression of p16/Ki-67 in the cervical epithelium of patients with HPV-associated CIN of various degrees according to immunocytochemical studies in comparison with patients without cervical pathology.
Materials and methods. The study included 62 women with cervical HPV infection and 13 women in the control group. Patients with CIN 1 formed the 1st main group (n = 21), women with CIN2-CIN3 - the 2nd main group (n = 26), and the comparison group consisted of patients with latent HPV infection (n = 15). Research methods: liquid cytology, colposcopic, histological research; methods for determining HPV BP DNA; immunocytochemical research to determine the double staining of p16/ Ki-67 markers, statistical analysis.
Results. Against the background of HPV infection, both in the 1st main group of patients with CIN1 and in the comparison group of patients with NILM, isolated cases of double staining of P16 and Ki-67 markers were recorded without significant differences between the groups (p = 0.44). In the 2nd main group of patients with CIN2, CIN3, co-expression of p16 and Ki-67 was observed in every second woman, it dominated relative to the 1st group and the comparison group (p = 0.003, p = 0.005, respectively). In the absence of HPV, the control group found that there was no double staining of markers. Conclusion. There were no differences in coexpression in CIN1 compared to latent HPV infection and the control group. When CIN 2+ is associated with HPV BP, the frequency of immunocytochemical confirmation of P16/Ki-67 expression is increased compared to CIN1, which increases the risk of precancerous progression. When choosing a differentiated management strategy for patients with CIN on the background of HPV, it is necessary to take into account the data of the proliferative potential of the cervical epithelium.
Key words: CIN; HPV; CINtec PLUS; p16ink4a; Ki-67
Несмотря на достижения цервикологии, отмечается ежегодное увеличение пациенток, страдающих раком шейки матки (РШМ) [1]. Распространенность РШМ выросла с 110,3 в 2008 г.
до 123,7 на 100 тыс. населения в 2018 г. в масштабах России. Заболеваемость РШМ находится на второй позиции в структуре раков гениталий в стране [2].
Корреспонденцию адресовать: Иформация для цитирования:
КЛИНЫШКОВА Татьяна Владимировна, Клинышкова Т.В., Миронова О.Н. Современные подходы при CIN,
644099, г. Омск, ул. Ленина, д. 12, ассоциированных с ВПЧ //Мать и Дитя в Кузбассе. 2020. №2(81). С.
ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России. 15-19.
Тел: 8 (3812) 23-02-93, E-mail: [email protected] DOI: 10.24411/2686-7338 -2020-10016
сЛръ и^итя в^^збассе №2 (81) 2020
В рамках вторичной профилактики РШМ существенную роль играет совершенствование методов диагностики папилломавирусной инфекции, правильная клиническая интерпретация результатов обследования и своевременное адекватное лечение пациенток с цервикальным предраком. Активная разработка профилактических стратегий, основанная на ВПЧ-детекции, углубленное изучение ВПЧ-генотипирования, маркеров пролиферации, метилирования при цервикальной ВПЧ-инфекции, их внедрение в практику побуждают к анализу клинических данных [3-5].
Среди прогностических маркеров риска большое внимание уделяется p16ink4a (или р16) и Ki-67 [6, 7]. Белок p16 осуществляет контроль клеточного цикла, относится к ингибиторам циклинзависимых киназ, которые тормозят пролиферацию. Ki-67 является белком клеточной пролиферации и экспресси-руется в течение всех активных фаз клеточного цикла. При персистирующем течении инфекции, вызванной ВПЧ ВР, уровень экспрессии р16 возрастает, способствуя усилению пролиферации цер-викального эпителия. Признается, что р16/Ю67 — надежный инструмент стратификации риска среди ВПЧ-позитивных женщин. В пользу информативности р16 и Ki-67 свидетельствуют следующие факты. При обследовании на р16 (без Ki-67) женщин 35-60 лет риск CIN3+ в течение 3 лет был 4,7 % среди ВПЧ+/р16-позитивных в сравнении с 0,8 % ВПЧ+/р16-негативных женщин в рамках NTCC-исследования [6]. Кроме того, 83,7 % женщин с последующим развитием CIN3+ были исходно р16-позитивными. Гиперэкспрессию р16 называют маркером CIN2 и связывают с высоким риском CIN3+ в течение 3 лет у ВПЧ-позитивных женщин, особенно в возрасте 35-60 лет.
Диагностическое значение в последние годы имеет не только изолированное определение р16 или Ki-67, а одновременное обнаружение р16, Ki-67 (коэкс-прессия), что проявляется двойным окрашиванием (dual stain): коричневой цитоплазмой (р16) и красным ядром (Ki-67). Так, в крупномасштабном исследовании ATHENA (n = 7727) было показано, что для выявления CIN3+ чувствительность метода р16/Ю-67 была значительно выше Рар-цитологии (74,9 % против 51,9 %) [8]. Учитывая опыт предыдущих исследований, оценка коэкспрессии биомаркеров в сравнительном контексте представляет интерес.
Цель исследования — определить частоту коэкс-прессии р16/Ю-67 в цервикальном эпителии больных с ВПЧ-ассоциированными CIN различной степени в сравнении с пациентками без цервикальной патологии по данным иммуноцитохимического исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование включены 62 женщины с церви-кальной ВПЧ-инфекцией (средний возраст — 26,4 ± 6,13 лет), среди которых основную группу составили 47 пациенток с верифицированной CIN, ассоциированной с ВПЧ ВР. Пациентки с CIN1 составили 1-ю основную группу (n = 21), женщины с CIN2-CIN3 составили 2-ю основную группу (n = 26). Выделены группа сравнения, которую составили пациентки с латентной ВПЧ-инфекцией (n = 15), и группа контроля (n = 13).
Критериями включения в 1-ю основную группу явились: репродуктивный возраст, наличие позитивного цервикального ВПЧ-теста, LSIL по данным цитологического исследования, гистологическая верификация CIN1, иммуноцитохимическое исследование цервикального материала на р16/Ю-67. Критериями включения во 2-ю основную группу явились: репродуктивный возраст, наличие позитивного цервикального ВПЧ-теста, наличие SIL по данным цитологического исследования, гистологическая верификация CIN2, CIN3, иммуноцитохими-ческое исследование цервикального материала на р16/Ю-67. Критерии включения в группу сравнения: репродуктивный возраст, позитивный ВПЧ-тест с типированием на 14 типов, NILM по данным цитологического исследования и отсутствие аномальных кольпоскопических картин, иммуноцито-химическое исследование цервикального материала на р16/Ю-67. Критерии включения в группу контроля: репродуктивный возраст, наличие негативного ВПЧ-теста, NILM по данным цитологического исследования, отсутствие цервикальной патологии. Информированное согласие пациенток являлось обязательным условием для участия в исследовании. Критерии исключения: несоответствующий возраст больных, беременность и лактация, рак шейки матки, отказ от участия в исследовании.
Комплексная диагностика включала традиционные методы [цитологическое исследование (жидкостная цитология — Sure Path), кольпоскопическое исследование; гистологическое исследование церви-кальных биоптатов и эндоцервикальных образцов] и дополнительные методы [метод ПЦР с гибридиза-ционно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени использовался для дифференцированного выявления и количественного определения ДНК ВПЧ 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 и 59]. Иммуноцитохимическое исследование для определения двойного окрашивания маркеров р16/Ю-67 (тест-система «CINtec® PLUS Kit»).
Статистический анализ данных проводился с применением пакета STATISTICA-6, пакета Epilnfo
Сведения об авторах:
КЛИНЫШКОВА Татьяна Владимировна, доктор мед. наук, профессор, профессор кафедры акушерства и гинекологии ДПО, ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России, г. Омск, Россия. E-mail: [email protected]
МИРОНОВА Ольга Николаевна, врач клинической лабораторной диагностики, патоморфологический отдел, БУЗОО КДЦ, г. Омск, Россия. E-mail: mironova63gmail.com
(версия 3.3), возможностей MS Excel. Проверка нормальности распределения количественных признаков проводилась по критерию Шапиро-Уилки. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости р принимался равным 0,05. Данные в тексте представлены в виде M ± SD, где M — средняя арифметическая, SD — стандартное отклонение средней. Для сравнения качественных показателей в группах использовался точный критерий Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
В соответствии с критериями включения, дана оценка экспрессии биомаркеров p16ink4a и Ki-67 цервикальных образцов 75 пациенток: с CIN1 (средний возраст — 24,9 ± 3,77 лет), CIN2-3 (средний возраст — 29,1 ± 7,22 лет), с латентной формой ВПЧ-инфекции (средний возраст — 25,7 ± 5,63 лет) и группы контроля (средний возраст — 25,9 ± 6,97 лет).
Позитивный тест двойного окрашивания биомаркеров посредством иммуноцитохимического исследования материала отражал факт коэкспрессии p16/Ki-67 (табл.).
В группе контроля у пациенток без цервикаль-ной патологии, негативным ВПЧ-тестом и NILM, по данным цитологического исследования, установлено отсутствие двойного окрашивания маркеров. В группе сравнения у женщин с NILM и отсутствием аномальных кольпоскопических картин на фоне ВПЧ тест явился положительным в одном случае.
В 1-й основной группе и группе сравнения зафиксированы единичные случаи двойного окрашивания маркеров (р = 0,44). Во 2-й основной группе коэкспрессия p16 и Ki-67 была отмечена у каждой второй женщины, она доминировала относительно 1-й группы (10 %) и группы сравнения (6,7 %). Сравнительный анализ позволил установить отсутствие различий в коэкспрессии р16/ Ki-67 при ВПЧ-ассоциированной CIN1 относительно латентной ВПЧ-инфекции и женщин без ВПЧ и
цервикальной патологии. СШ2-3 характеризовалась статистически значимым преобладанием уровня биомаркеров не только в сравнении с латентной инфекцией, но и с СШ1 (р = 0,005, р = 0,003 соответственно).
Если ВПЧ-тест отражает факт наличия вируса, цитологическое изучение — состояние эпителиальных клеток на момент исследования, то оценка уровня р16/Ю-67 детализирует уровень пролифера-тивной активности эпителия шейки матки. Уровень биомаркеров можно оценивать не только в эпителиальных клетках при проведении иммуноцитохимии, но и в ткани экзоцервикса биоптата посредством иммуногистохимии. По нашим данным предыдущего иммуногистохимического исследования экспрессии одного маркера — р16тк4а — среди пациенток с ВПЧ-ассоциированными поражениями высокой степени (СШ2-СШ3) выявлено трехкратное повышение величины иммуногистохимического индекса р16тк4а в эпителии экзоцервикса (по интенсивности реакции, протяженности экспрессии и наличию ядерной метки) в сравнении с поражениями низкой степени (СШ1) [5]. Одновременное определение двух маркеров имеет преимущества как с позиции более высокой информативности, так и неинвазив-ности забора материала для иммуноцитохимическо-го исследования.
Оценка уровня пролиферативного потенциала эпителия шейки матки на основании одновременного изучения экспрессии двух маркеров р16/ Ю-67 позволяет прогнозировать течение папиллома-вирусной инфекции. Даже при СШ1, как мы видим по результатам данного исследования, могут встречаться случаи (около 10 %) более активного течения заболевания. Соответственно и тактика ведения таких пациенток должна быть более активной и возможность выжидательной тактики в течение 24 месяцев представляет риск ввиду трансформации в СШ2 еще до отведенного срока обследования по алгоритмам. Аналогично для пациенток с СШ2, допустимость консервативного ведения которых остается дискутабельной. Возможность консервативной тактики должна быть оценена с учетом
Таблица
Сравнительная характеристика коэкспрессии p16/Ki - 67 у пациенток с ВПЧ - ассоциированной CIN
Table
Comparative characteristics of coexpression of p16/Ki - 67 in patients with HPV-associated CIN
Показатели
1-я основная группа (n = 21) (1)
2-я основная группа (n = 26) (2)
Группа сравнения (n = 15) (3)
Группа контроля (n = 13) (4)
ф 1,2 р 1,2
ф 1,3 р 1,3
ф 2,3 р 2,3
ф 2,4 р 2,4
Экспрессия p16/Ki-67
2
13
1
0
0,186 0,014 0,193 0,250 0,003 0,44 0,005 0,001
Information about authors:
KLINYSHKOVA Tatyana Vladimirovna, doctor of medical sciences, professor, professor of the department of obstetrics and gynecology of further professional education, Omsk State Medical University, Omsk, Russia. Е-mail: [email protected]
MIRONOVA Olga Nikolaevna, doctor of clinical laboratory diagnostics, pathomorphological department, Clinical Diagnostic Center, Omsk, Russia. E-mail: mironova63gmail.com
c/^lTb и^ггя в^^збассе №2 (81) 2020
состояния биомаркеров. При положительном тесте двойного окрашивания рациональной является тактика комплексного хирургического лечения. При отрицательном тесте двойного окрашивания допустим консервативный подход с учетом возраста, отсутствия персистирующей формы папилломави-русной инфекции, кольпоскопической картины, включая тип зоны трансформации, а также регулярного наблюдения и отсутствия рецидива CIN.
Данный метод оценки биомаркеров может применяться не только у пациенток с CIN с целью выбора тактики ведения, но и на этапе цервикаль-ного скрининга. По мнению ряда авторов, при первичном ВПЧ-скрининге цитологический метод двойного окрашивания рекомендуется использовать для отбора/дообследования (triage) ВПЧ-позитивных пациенток, поскольку он повышает чувствительность цитологии [7-9]. ВПЧ+/р16-пози-тивным женщинам показана немедленная кольпо-скопия. Так, направление на кольпоскопию всех ВПЧ 16/18-позитивных женщин, а также р16/ Ю67-позитивных при других генотипах ВПЧ ВР (non-16/18) позволило достичь повышения чувствительности для CIN3+, составившую 86,8 %. Учитывая очевидные преимущества, цитологический метод двойного окрашивания предлагается к внедрению в программы цервикального скрининга [10]. Мета-анализ E. Peeters и др. подтвердил, что р16 и окрашивание p16/Ki-67 более специфичны для детекции CIN2+/CIN3+ в сравнении с ВПЧ ВР тестом даже среди пациенток с начальными признаками аномальных цитологических мазков — ASC-US или LSIL [11]. Все вышесказанное свидетельствует о рациональности внедрения данного метода в клиническую практику. Внедрение новых диагностиче-
ских технологий раскрывает перспективы усовершенствования цервикального скрининга, а также лечебных подходов при CIN.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При ВПЧ-ассоциированной CIN1 отмечаются единичные случаи коэкспрессии р16/Ю-67 в церви-кальном эпителии по данным позитивного иммуно-цитохимического теста двойного окрашивания. Не установлено различий коэкспрессии при CIN1 в сравнении с латентной ВПЧ-инфекцией и группой контроля, что допускает возможность наблюдательной тактики в условиях противовирусного лечения. Наличие признаков коэкспрессии p16/Ki-67 диктует нецелесообразность наблюдательной тактики при CIN1.
Среди пациенток с CIN2+, ассоциированной с ВПЧ ВР, в два раза повышена частота иммуноци-тохимического подтверждения экспрессии р16/ Ki-67 в сравнении с пациентками с CIN1, что повышает риск прогрессирования предрака и требует активной тактики ведения с применением комплексного лечения. При отсутствии противовирусного компонента лечения и с учетом пролиферативного потенциала цервикального эпителия (по данным позитивного теста) существует риск рецидивирова-ния CIN.
Информация о финансировании и конфликте интересов
Исследование не имело спонсорской поддержки. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES:
1. State of cancer care in Russia in 2018 /Ed. by AD. Kaprin, VV Starinsky, and GV Petrova. M.: 2019. 236 р. Russian (Состояние онкологической помощи населению России в 2018 году /Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2019. 236 с.)
2. Klinyshkova TV, Turchaninov DV, Buyan MS. Cervical cancer in the Omsk Region: epidemiological aspects. Obstetrics and Gynecology. 2018; 3: 102-108. Russian (Клинышкова Т.В., Турчанинов Д.В., Буян М.С. Эпидемиологические аспекты рака шейки матки в Омской области //Акушерство и гинекология. 2018. № 3. С. 102-108.)
3. Wentzensen N, Arbyn M, Berkhof J, Bower M, Canfell K, Einstein M et al. Eurogin 2016 Roadmap: how HPV knowledge is changing screening practice. Int J Cancer. 2017; 140(10): 2192-2200.
4. Prilepskaya VN. HPV-associated cervical diseases: screening, methods of examination, principles of treatment. Gynecology. 2019; 21(3): 6-8. Russian (Прилепская В.Н. ВПЧ-ассоциированные заболевания шейки матки: скрининг, методы обследования, принципы лечения //Гинекология. 2019. Т. 21, № 3. С. 6-8.)
5. Klinishkova TV, Karatyuk TI, Mozgovoy SI, Pritykina TV. Features of expression of P16ink4a and metabolites of estradiol in HPV-associated squamous lesions of the cervix. Questions of gynecology, obstetrics and perinatology. 2011; 10 (2): 45- 49. Russian (Клинышкова Т.В., Каратюк Т.И., Мозговой С.И., Притыкина Т.В. Особенности экспрессии р16 ink4a и метаболитов эстрадиола при ВПЧ-ассоциированных плоскоклеточных поражениях шейки матки //Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2011. Т. 10, № 2. С. 45-49.)
6. Carozzi F, Gillio-Tos A, Confortini M, Mistro AD, Sani C, Marco LD et al. Risk of high-grade cervical intraepithelial neoplasia during follow-up in HPV-positive women according to baseline p16-INK4A results: a prospective analysis of a nested sub-study of the NTCC randomised controlled trial. Lancet Oncol. 2013; 14(2): 168-76.
7. Wright TC Jr, Behrens CM, Ranger-Moore J, Rehm S, Sharma A, Stoler MH, Ridder R. Triaging HPV-positive women with p16/Ki-67 dual-stained cytology: Results from a sub-study nested into the ATHENA trial. Gynecol Oncol. 2017; 144(1): 51-56.
8. Wentzensen N, Fetterman B, Castle PhE, Schiffman M, Wood ShN, Stiemerling E et al. p16/Ki-67 Dual Stain Cytology for Detection of Cervical Precancer in HPV-Positive Women. Journal of the National Cancer Institute. 2015; 107(12): djv257.
9. Gustinucci D, Giorgi Rossi P, Cesarini E, Broccolini M, Bulletti S, Carlani A et al. Use of Cytology, E6/E7 mRNA, and p16IN-K4a-Ki-67 to Define the Management of Human Papillomavirus (HPV)-Positive Women in Cervical Cancer Screening. Am J Clin Pathol. 2016; 145(1): 35-45.
10. Benevolo M, Allia E, Gustinucci D, Rollo F, Bulletti S, Cesarini E et al. Interobserver reproducibility of cytologic p16INK4a / Ki-67 dual immunostaining in human papillomavirus-positive women. Cancer Cytopathol. 2017; 125(3): 212-220.
11. Peeters E, Wentzensen N, Bergeron C, Arbyn M. Meta-analysis of the accuracy of p16 or p16/Ki-67 immunocytochemistry versus HPV testing for the detection of CIN2+/CIN3+ in triage of women with minor abnormal cytology. Cancer Cytopathol. 2019; 127(3): 169-180.
* * *
cJforb a^na Bj^ßacce №2 (81) 2020