CC BY
90
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
А. В. Говоров. Мировой опыт использования теста определения ПСА с целью ранней диагностики рака предстательной железы (РПЖ). Кафедра урологии МГМСУ, Москва
Широкомасштабное использование ПСА привело к изменению структуры РПЖ - возрос процент пациентов с локализованным раком, и снизилось количество случаев выявления на поздних стадиях. В начале 1990-х годов стартовали два рандомизированных исследования скрининга РПЖ - в Европе (ERSPC) и США (PLCO), в результате чего были получены противоречивые данные. По результатам ERSPC (n = 162 388) было показано, что в группе скрининга (n = 72 891) снижение смертности составило 21% по сравнению с контрольной группой (n = 88 352) при медиане наблюдения длительность 11 лет. По результатам PLCO (США) (n = 76 693) статистически значимых различий в смертности между скрининговой (n = 38 343) и контрольной (n = 38 350) группами выявлено не было. При анализе исследования PLCO установлено, что у 44% мужчин определяли уровень ПСА до включения в исследование, что привело к уменьшению случаев выявления РПЖ; 52% мужчин из контрольной группы сдали анализ ПСА в ходе исследования (вопреки протоколу); на проведение биопсии по показаниям согласились только 40% пациентов группы скрининга против 86% в исследовании ERSPC. Кроме того, медиана длительности наблюдения для PLCO составила всего 7 лет. При проведении скрининга возникла проблема гипердиагностики - высокий процент необоснованных биопсий (69% по 1 этапу ERSPC), выявление большого количества неагрессивных форм рака. Для повышения эффективности диагностики необходимо использовать ПСА в комбинации с другими показателями, в том числе калькуляторы риска, рассчитывающие индивидуальную вероятность развития РПЖ. Перспективным направлением диагностики РПЖ является внедрение новых маркеров для дифференциальной диагностики агрессивных форм рака; многообещающие результаты получены для нового маркера - 2проПСА - изоформы свободного ПСА.
M. Lazzeri, G. Lughezzani, G. Lista, A. Larcher, G. M. Gadda, G. Guazzoni. Последние данные по использованию нового маркера рака предстательной железы (РПЖ) [-2]проПСА и индекса здоровья простаты (PHI). Отделение урологии, Университет Вита-Салют Сан Рафаэль, Милан, Италия
Раннее выявление РПЖ в настоящее время основано, преимущественно, на положительном результате пальцевого ректального исследования и повышенном уровне ПСА. Положительная предсказательная ценность ПСА и %свПСА остается низкой, особенно у мужчин с уровнем ПСА 2,5-10 нг/мл. Соответственно до 75% первичных биопсий могут быть отрицательными. При этом 10-35% этих пациентов при вторичной (или далее) биопсии ставится диагноз РПЖ. Для пациентов с отрицательной первичной биопсией, но подозрением на РПЖ, характеризующимся постоянным повышенным уровнем ПСА, Европейская ассоциация урологов рекомендует проведение повторной биопсии. Для 80% мужчин повторная биопсия дает отрицательный результат. С проведением как первичной, так и вторичной биопсии связаны как экономические аспекты, так и состояние пациента: тревога, дискомфорт, вероятность возможных серьезных осложнений. В ходе проспективного исследования установлено, что изоформа свПСА - [-2]проПСА (п2ПСА) и его производные, процентное отношение п2ПСА к свПСА (%оп2ПСА) и индекс здоровья простаты (PHI) (Beckman Coulter), обладают более высокой предсказательной ценностью при диагностике РПЖ при первичной биопсии, чем ПСА и %освПСА. В 2012 г. аналогичные результаты были получены для прогнозирования результата повторной биопсии. При обследо-
вании 350 мужчин с локализованным раком, подвергшихся радикальной простатэктомии, была показана способность %п2ПСА и PHI прогнозировать обнаружение агрессивного рака по результатам простатэктомии. Индекс здоровья простаты (PHI) позволяет оценить риск развития РПЖ у здоровых мужчин, а также повысить до 70% точность неблагоприятного прогноза при биопсии у пациентов, ежегодно обследуемых согласно протоколу активного наблюдения.
А. В. Ружанская, С. А. Евгина. Стандартизация определения ПСА: практическое значение для лаборатории и врачей-клиницистов. ООО "Бекмен Культер", отдел клинической лабораторной диагностики, Москва
В 1986 г. метод Hybritech "Total Р8А" был одобрен FDA для мониторинга, а в 1994 г. - для ранней диагностики РПЖ. Большинство последующих производителей альтернативных тест-систем использовали метод Hybritech "Total PSA", в том числе внутренний стандарт Hybritech, в качестве референс-ного, зачастую не проводя полномасштабных исследований по определению клинически значимых уровней ПСА. Различия в антителах и эквимолярности методов, используемых для производства тест-систем, приводят к высокой вариабельности результатов измерения ПСА. В 1999 г. ВОЗ был утвержден первичный референсный калибратор - стандарт ВОЗ 96/670, состоящий из связанного и свободного ПСА в соотношении 90:10. В качестве первичной референсной методики измерения использовался метод масс-спектрометрии в отличие от метода Лоури для стандарта Hybritech. При этом коэффициент экстинкции (КЭ) стандарта ВОЗ оказался на 26% выше по сравнению с КЭ стандарта Hybritech. Пороговое значение для теста Hybritech "Total PSA" по калибровке ВОЗ составило 3,1 нг/мл, что на 22% ниже, чем пороговое значение 4 нг/мл, установленное на основе проспективного исследования для калибровки Hybritech. Эти изменения особенно важны при мониторинге пациентов по уровню ПСА. Игнорирование изменений пороговых значений при внедрении прослеживаемости до стандарта ВОЗ ведет к получению ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Несмотря на улучшение эквимолярности методов, достичь полноценной стандартизации и взаимозаменяемости тест-систем не удалось. В этой связи согласно рекомендации европейской группы по онкомаркерам вместе с результатом ПСА врач должен получать информацию о методе определения и соответствующие ему референсные значения.
М. Н. Пешков. Постгеномные технологии в диагностике рака предстательной железы. Кафедра урологии и ан-дрологии МГУ им. М. В. Ломоносова, НИИ физико-химической медицины ФМБА России
Геномные, постгеномные технологии в значительной степени ориентированы на решение актуальных биомедицинских проблем, позволяющих реализовать принципы, персонифицированной медицины. Медицина XXI века требует не только новых маркеров заболеваний, но и разработку целостного биохимического профиля заболевания (Create profiles of disease), необходимого для прогнозирования развития, ранней диагностики, метаболического сопровождения и оценки вероятности развития осложнений заболеваний.
Рак предстательной железы (РПЖ) - это актуальная медико-социальная проблема. В России РПЖ занимает 4-е место в структуре онкологической заболеваемости мужчин. В Европе РПЖ находится на 2-3 месте после рака легких и желудка, а в США в 2007 г РПЖ вышел на 1-е место. Перспективы улучшения результатов лечения связаны с предупреждением и ранней диагностикой предраковых изменений и опухолевого процесса в предстательной железе. Маркер рака предстательной железы - простатспецифический антиген
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 9, 2012
не является универсальным. По мнению Европейской ассоциации урологов, у пациентов с нормальным уровнем ПСА крови (3,1-4,0 нг/мл) риск РПЖ составляет 26,9%. В настоящее время существует более 200 химических соединений, встречающихся при этом заболевании. В последнее время все более очевидно, что анализ и клиническая интерпретация моновещества для ранней диагностики и мониторинга пациентов не удовлетворяет требованиям медицины XXI века.
Авторский коллектив видит решение данного вопроса в разработке и создании геномно-протеомной системы для прогнозирования развития, ранней диагностики, мониторинга, подбора индивидуальной терапии и оценки результатов лечения пациентов с РПЖ.
Для разработки диагностической системы выполняется проспективное обследование и динамическое наблюдение 1500 пациентов с РПЖ. Для выделения группы полиморфизмов (SNP's), встречающихся у этих пациентов, проводили мини-секвенирование с последующим анализом продуктов на времяпролетном масс-спектрометре Reflex IV (Bruker Dultonics, Германия) (MALDI-TOF based mini-sequencing) в линейном режиме, положительной моде (регистрация положительно заряженных ионов), используя азотный лазер с длиной волны 337 нм и частотой импульса 9 Гц. Фрагменты генов, содержащих области анализируемых полиморфизмов, получали в ходе полимеразной цепной реакции.
Для определения белков плазмы и мочи выполняется высокоточная масс-спектрометрия (MALDI-Mass spectrometry)
и ИФА (ELISA). Спектры MS-MS-фрагментации трип-синовых пептидов получали с использованием масс-спектрометра MALDI-TOF-TOF Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия), укомплектованного УФ-лазером с длиной волны 337 нм, в режиме регистрации положительно заряженных ионов. Точность определения отношения молекулярной массы и заряда ионов-фрагментов составляла 0,03%. Стратификация диагноза осуществляется по результатам морфологического исследования биопсийного материала с имму-ногистохимией.
Определение серии полиморфизмов (SNP's), характерных для РПЖ, позволит выявлять риск-группу пациентов по данному заболеванию и осуществлять диспансеризацию. Определение белков, специфичных для РПЖ, позволяет выявлять самую раннюю (доклиническую) стадию заболевания. Вместе с этим выделенные в настоящий момент белки и метаболиты. Аннексин III (ANXA3, Annexin A3), саркозин (sarcosine) и др., их корреляция с ПСА и -2PROPSA обладают большей чувствительностью и специфичностью, чем ПСА.
Таким образом, созданная научно-практическая модель геномно-протеомной системы позволит выделить группу риска по РПЖ из наблюдаемой популяции и организовать диспансеризацию с индикаторами контроля качества. В клинической практике данная технология молекулярной биологии позволит врачу-онкоурологу осуществлять лечебно-диагностический менеджмент, а не только констатировать факт заболевания у пациента.
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ АНАЛИТИКИ
А. А. Кубанова, А. А. Кубанов, Н. В. Фриго, Р. Ф. Хайрул-лин, С. В. Ротанов. Разработка биочипа для диагностики сифилиса путем одновременного определения антител к кардиолипину и специфическим антигенам Т. pallidum.
ФГБУ ГНЦДК Минздравсоцразвития России, Москва
В соответствии со стандартами оказания медицинской помощи больным сифилитической инфекцией при установлении клинического диагноза и последующем клинико-лабо-раторном наблюдении необходимо применять трепонемные и нетрепонемные тесты в разных сочетаниях. Одновременное определение антител к кардиолипину и антигенам T. pallidum в формате одного теста позволяет повысить эффективность и качество диагностики.
Цель исследования - разработка полезной модели биочипа для одновременного определения антител к кардиолипину и специфичным антигенам Т. pallidum.
Материалами для разработки биочипа являлись реком-бинантные химерные полипептиды-аналоги антигенов T. pallidum (Тр15, Tp17, TmpA, Тр47), кардиолипин, бычий сывороточный альбумин, флуорофоры Су 5 и Су3, микроскопные альдегидные слайды, а также образцы сыворотки крови больных сифилисом и здоровых лиц.
Разработанный биочип для иммунологического исследования представляет собой стеклянный или полимерный слайд с модифицированной поверхностью, разделенный на повторяющиеся зоны-эрреи для одновременного определения в биологических образцах человека антител (классов G и М) к кардиолипину и антигенам T. pallidum. Внутренняя структура эрреев содержит раздельно иммобилизованные в определенной последовательности и необходимом числе повторов трепонемные антигены Тр15, Тp17, Тр47, Тп^А, кардиолипиновый антиген, маркеры границ и внутренние контроли. Каждый слайд рассчитан на исследование 10 образцов, включая необходимые контроли. Для обеспечения иммунологического исследования разработаны необходимые
буферные растворы, реагенты, температурные условия и время экспозиции на каждом этапе. Для считывания и анализа результатов исследования адаптирована компьютерная программа многоканального сканера для микроскопных слайдов.
Разработанный формат биочипа позволил подать заявку на его патентование в качестве полезной модели, а также осуществлять комплекс необходимых испытаний для регистрации в Российской Федерации в качестве изделия медицинского назначения.
Н. Ф. Тимченко, М. Б. Раев, Б. Г. Андрюков, Е. П. Не-дашковская, Е. В. Персиянова. Экономичное, быстрое и безинструментальное определение антител к Yersinia pseudotuberculosis с помощью сконструированной тест-системы на основе конъюгированных наночастиц углерода в формате иммуномембранных технологий. ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток; УРАН НИИ экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь
В настоящее время псевдотуберкулез (ПТ) постоянно регистрируется в различных странах, в том числе и в Российской Федерации. Чаще всего инфекция вызывается возбудителем О1 и О3 сероваром Y. pseudotuberculosis. Поэтому поиск высокоспецифичных, высокочувствительных и экономичных тест-систем является актуальным.
Цель работы - конструирование экономичной неферментной тест-системы для безинструментального определения антител к Y. pseudotuberculosis на основе конъюгированных наночастиц углерода в формате иммуномембранных технологий для повышения эффективности диагностики ПТ. В качестве источника наночастиц диаметром 162 нм использовали аморфный углерод, который получали в виде сажи путем конденсирования из пламени горящего толуола на стеклянной поверхности. Конъюгацию наночастиц осуществляли по
