CC BY
897
ОБЗОРЫ И ЛЕКЦИИ
УДК 577.23, 577.121
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ
МИТОХОНДРИЙ
ГА. Фрелих, Н.Ю. Поломеева, А.С. Васильев, В.В. Удут
ФГБУ "НИИ фармакологии" СО РАМН, Томск E-mail: galina.frelikh@ pharmso.ru
STATE-OF-THE ART METHODS OF EVALUATION OF MITOCHONDRIAL FUNCTION
G.A. Frelikh, N.U. Polomeeva, A.S. Vasil'ev, V.V. Udut
Federal State Budgetary Institution "Research Institute of Pharmacology" of Siberian Branch under the Russian Academy of Medical
Sciences, Tomsk
В статье применительно к поиску возможности оперативного получения объективной информации о митохонд-риальной дисфункции в клинической практике описаны и проанализированы современные методы исследования функций митохондрий in vitro и in vivo. Ключевые слова: митохондрии, энергетический обмен, методы.
This paper describes and analyses state-of-the-art methods of in vitro and in vivo evaluation of mitochondrial function used in order to obtain unbiased information on mitochondrial dysfunction in clinical practice. Key words: mitochondria, energy exchange, methods.
Введение
Энергетический обмен является основой обеспечения оптимальной деятельности органов и систем организма, а его нарушение - пусковым механизмом развития патологических процессов и старения [19, 48].
Основным источником энергии в клетках являются митохондрии (МХ). Участвуя в катаболизме, МХ утилизируют продукты деградации углеводов, липидов, белков, продуцируют макроэргические соединения (АТФ, ГТФ, креатинфосфат и др.), а также воду. Энергия АТФ используется для протекания многих важнейших клеточных процессов [2, 57]. МХ могут участвовать в анаболических процессах [4, 18]. В митохондриях белковый, углеводный и жировой обмен связаны между собой через цикл Креб-са [17].
МХ являются важнейшими регуляторами кальциевого гомеостаза [14], кислотно-щелочного равновесия клетки, уровня продукции свободных радикалов [10] и оксида азота, а также принимают участие в процессе апопто-за [3] и биотрансформации ксенобиотиков [17, 18]. Нарушение жизнедеятельности МХ относят к митохондриаль-ной дисфункции [27].
Таким образом, МХ являются важнейшими внутриклеточными органеллами, функционально интегрированными в работу всех систем жизнеобеспечения. Нарушение функций МХ не только приводит к дефициту АТФ, но и дезорганизует обмен веществ [27]. Исходя из этого, сво-
евременное выявление нарушений энергетического обмена позволит разработать меры профилактики развития патологических процессов и оптимизировать терапию различных заболеваний [6, 8, 9, 12].
К сожалению, функциональное состояние МХ оценивают в основном в эксперименте, а в клинической практике и при разработке новых лекарственных средств состояние системы митохондриальной энергопродукции не изучается [29, 33]. В первую очередь, это связано с инва-зивностью экспериментальных методов в сочетании с высокой сложностью алгоритмов исследования [21].
На наш взгляд, перспективным для применения в клинике является цитобиохимический метод оценки системы энергопродукции в лимфоцитах периферической крови - наиболее значительном пуле циркулирующих ядерных клеток, функции которых обеспечиваются их высоким энергетическим потенциалом. При этом ряд авторов относит лимфоциты периферической крови к "энзиматическому зеркалу тканей" [7, 12, 13].
Тем не менее, только выявление сопряженности между состоянием системы энергопродукции лимфоцитов как доступного для изучения субстрата и энергетическим статусом МХ тканей может послужить доказательством правомочности опосредованной оценки последнего через "энергетику" лимфоцитов.
Цель исследования: анализ основных современных методов и подходов к исследованию функций МХ.
Основные подходы к изучению функционального состояния МХ
Оценка митохондриального энергетического обмена выполняется в подавляющем большинстве случаев in vitro и гораздо меньше - in vivo [31, 32]. Преимущественно исследуются изолированные МХ, выделенные из тканей, что исключает влияние цитозольных факторов на оцениваемые процессы, и в "изолят" МХ напрямую проникают необходимые для исследования вещества. Возникающие сложности подобного анализа в основном связаны с необходимостью получения большого количества МХ и высокой вероятностью их выборочной изоляции, необратимого образования агрегатов и повреждения при выделении.
При работе с интактными клетками, несмотря на то, что МХ остаются неповрежденными, находятся в естественном окружении и взаимодействуют с другими клеточными структурами, сложности анализа их энергетики не менее значимы: мембрана клеток непроницаема для ряда веществ, необходимых в оценке митохондриальных функций; именно сложность клетки повышает вероятность ошибок в интерпретации получаемых данных.
Выход из этой ситуации - работа на пермеабилизи-рованных клетках и тканях, проницаемость плазматических мембран которых повышена за счет обработки ультразвуком и специальными детергентами. Для пермеаби-лизации мембран требуется меньшее количество клеток и меньше времени, чем для выделения МХ, однако сохраняется риск повреждения мембраны МХ [27, 34].
К сожалению, ни результаты изучения системы энергопродукции на изолированных МХ, ни таковые, полученные на цельных клетках, зачастую не отражают энергетический статус организма in vivo [27]. Это послужило импульсом к развитию неинвазивных методов исследования функционального состояния МХ в тканях in vivo, позволяющих получать информацию об энергетике не только в популяции МХ, но и в отдельных клетках [53, 60]. Вместе с тем прижизненные методы оценки энергетики МХ, хотя и позволяют получать информацию многократно, остаются интегративными и не содержат данных о ее нюансах [27].
Естественно, что оптимальным вариантом оценки митохондриальной энергетики организма должно явиться параллельное исследование функционального состояния МХ in vitro и in vivo с их сопоставлением [41].
Основные методы изучения функционального состояния МХ
Методы, основанные на измерении кислорода.
С учетом того, что кислород является конечным акцептором электронов в дыхательной цепи МХ, анализ его потребления остается одним из самых информативных способов оценки их функционального состояния. Изучение потребления О2 позволяет обнаружить не только изменения структуры2 МХ, но и нарушения в дыхательной цепи в процессе синтеза АТФ, что позволяет изучить метаболические пути в целом и выявить нарушения, не обнаруживаемые другими методами [32].
Из этой группы традиционным методом оценки состояния МХ является полярографический с измерением потребления кислорода при помощи электрода Кларка в различных метаболических состояниях по B. Chance [28]. Используются различные субстраты окисления, ин-гибиции и разобщения. Определяют скорость потребления кислорода, скорость синтеза АТФ, скорость утечки протонов, вычисляют эффективность сопряжения дыхания и фосфорилирования (коэффициент АДФ/О), измеряют максимальную скорость дыхания (в присутствии разобщителей), вычисляют коэффициенты дыхательного контроля (ДК), резервную дыхательную способность клеток, а также оценивают немитохондриальное потребление кислорода [27].
Для изолированных МХ и интактных клеток наилучшим способом оценки функционального состояния Мх является изучение ДК, поскольку изменение в процессе окислительного фосфорилирования приводит к изменению ДК. Как правило, при правильно подобранных условиях инкубации митохондрии имеют высокий коэффициент ДК, который свидетельствует о высокой скорости окисления субстратов и образования АТФ, а также о низком уровне утечки протонов. Коэффициенты ДК могут являться индикаторами нарушений функционального состояния МХ, помогают выявить сайты, в которых наблюдается митохондриальная дисфункция. АДФ/О - неподходящий параметр для выявления митохондриальной дисфункции, поскольку этот коэффициент меняется, только если нарушен механизм сопряжения дыхания и фосфорилирования, либо при изменении утечки протонов [27].
Тем не менее, этот метод не лишен недостатков, основными из которых являются следующие: необходимость большого количества клеток/МХ; потребление кислорода электродом; ограниченное время измерений; чувствительность к перемешиванию среды; проблема загрязнения, "отравления" электрода; помехи, дрейф сигнала и др. [34].
Также используют метод респирометрии с высоким разрешением (high-resolution respirometry) и современный прибор - респирометр Oxygraph-2k (Oroboros Instruments, Austria), позволяющие проводить высокоточные измерения кислорода в небольшом количестве биологического материала при низком парциальном давлении кислорода [34]. Разработаны разнообразные протоколы респирометрии [23, 34, 50], а также мультисенсор-ные подходы, позволяющие оценить сразу несколько параметров функционального состояния МХ [49, 59].
Применяют и оптические методы измерения кислорода зондами, которые могут иметь некоторые преимущества перед полярографическим методом [52]. Кислородные зонды - сенсорные молекулы на основе платины, палладия, рутения и других веществ, оптические свойства которых меняются при связывании с кислородом нехимическим путем ("тушение флуоресценции"). Измерения при помощи флуоресцентных и фосфоресцент-ных кислородных индикаторов проводят в стандартных кюветах флуориметра, в микропланшетах, методом проточной цитометрии при помощи флуоресцентной микроскопии с визуализацией [58, 60]. Они обладают высо-
кой чувствительностью, позволяют проводить измерения кислорода в клетках и субклеточных компартментах, однако методы с их использованием часто не позволяют делать многократные добавки в среду инкубации и проводить длительные измерения [37, 58].
В настоящее время разрабатываются методы измерения кислорода в тканях in vivo. Дыхание, изучаемое in vivo, определяет скорость метаболических процессов в организме. При этом используют методы измерения тканевыми электрохимическими электродами; абсорбционной и ближней инфракрасной спектроскопии; электронной парамагнитно-резонансной оксиметрии; метод ок-симетрии, основанный на динамической поляризации ядер; ядерной магнитно-резонансной оксиметрии [55], методы, основанные на кислородзависимом тушении фосфоресценции металлопорфириновых красителей [35], а также эндогенного протопорфирина IX [47]. Измеряют in vivo концентрацию кислорода, парциальное давление кислорода, скорость потребления кислорода, содержание и степень оксигенации гемоглобина и миогло-бина. Достоинства и недостатки методов измерения кислорода in vivo приведены в обзоре [55].
Применяемый в клинической практике принцип Фика [5] для оценки потребления кислорода дает значительные ошибки, а полученные данные зачастую не содержат достоверной информации о дыхании Мх [27].
Другим достаточно интересным подходом к оценке биоэнергетики является измерение митохондриального мембранного потенциала. Поддержание мембранного потенциала служит индикатором "здоровья" МХ и уровня метаболической активности клеток [1, 20]. В настоящее время возможно измерить разность потенциалов на мембранах клеток и МХ. Градиент pH измеряют реже [26]. Мембранный потенциал Мх часто оценивают при помощи проникающих через мембраны катионных флуоресцентных или фосфоресцентных красителей, которые распределяются в Мх по уравнению Нернста и позволяют выявить деполяризацию мембран МХ [17, 42]. Измерения могут проводиться методом спектральной флуо-риметрии в кювете методом проточной цитометрии либо методами конфокальной и мультифотонной микроскопии с визуализацией [42].
Однако некоторые красители имеют ряд недостатков: длительность достижения уравновешивания, распределение не по уравнению Нернста, окрашивание не всех МХ, ингибирование комплекса I, окрашивание немитохонд-риальных мембран, индуцируемое светом образование свободных радикалов, цитотоксичность и др. [30]. После деполяризации МХ теряют флуорофоры и становятся невидимыми на флуоресцентных изображениях. Для решения этой проблемы дополнительно применяют флуо-рофоры MitoTracker [32]. Считается, что измерение Душ в отдельности не позволяет оценить, какие именно функции МХ нарушены. Совместное изучение дыхания и мембранного потенциала МХ дает больше информации о состоянии МХ [27].
Измерение аутофлуоресценции НАДН и флаво-протеинов.
Пиридиннуклеотиды (НАДН, НАДФН) и флавопроте-ины (ФАД, ФАДн) участвуют в гликолизе, цикле Кребса,
окислении жирных кислот и клеточном дыхании, являются эндогенными флуорофорами, содержание которых изменяется в зависимости от активности метаболизма [28]. Усиление клеточного дыхания сопровождается изменением соотношения количества их восстановленных и окисленных форм в сторону преобладания окисленных [16]. Для изучения функционального состояния МХ измеряют флуоресценцию восстановленного НАДН, а флуоресценцию флавопротеинов измеряют реже в связи со слабым флуоресцентным сигналом [32, 60]. Измерения проводят при помощи спектрофлуориметра, методами проточной цитометрии, мультифотонной и конфокальной микроскопии. Разработаны различные муль-типараметрические системы для in vivo мониторинга флуоресценции НАДН и других показателей в МХ интакт-ных тканей [32, 43]. Достоинства и недостатки метода подробно описаны в литературе [44, 60].
Методы измерения митохондриальных ферментов.
Дыхательная цепь МХ состоит из нескольких комплексов ферментов, в которых происходят окислительно-восстановительные реакции и синтез АТФ [30]. Применение различных субстратов, разобщителей, а также ингибиторов комплексов дыхательной цепи помогает изучить процесс окислительного фосфорилирования и транспорта электронов в МХ. Очень популярным методом выявления митохондриальной дисфункции является измерение экспрессии, концентрации и активности ферментных комплексов и отдельных ферментов, которые контролируют скорость дыхания и биоэнергетическую функцию МХ. Однако контроль скорости дыхания и образования АТФ многопланен, нет какого-то одного фермента, который ограничивает скорость этих процессов, и многое зависит от выбора условий эксперимента [27].
Чаще всего активность комплексов ферментов дыхательной цепи МХ измеряют полярографически или спек-трофотометрически [23]. Спектрофотометрические методы количественной оценки активностей дыхательных ферментов в МХ основаны на ферментативных окислительно-восстановительных реакциях. Активность всех пяти комплексов ферментов может быть оценена в МХ с разрушенными мембранами. Некоторые виды измерений могут проводиться в интактных клетках. Часто вычисляют отношения активностей разных ферментных комплексов, а активности ферментов нормализуют по числу клеток, массе белка МХ или по активности цитрат-синтазы [23]. Данный подход является чувствительным и быстрым способом выявления нарушений функционального состояния МХ даже в небольшом количестве биологического материала [25].
Для оценки функционального состояния МХ также применяют метод, основанный на изучении спектральных характеристик митохондриальных цитохромов (a, a3, с, и b), который позволяет напрямую оценивать функциональное состояние отдельных комплексов дыхательной цепи МХ, что является невозможным при использовании более общих маркеров дыхательной активности МХ (НАДН и флавопротеинов) или показателя Душ. Изменения абсорбции цитохрома с могут рассматриваться как мера доступности O2 в тканях при различных физиологических условиях [32].
Также существует способ неспецифической оценки активности ферментов и дыхательной активности МХ лимфоцитов периферической крови, тканей печени и головного мозга, основанный на измерении флуоресценции восстановленной формы красителяресазурина [22].
Несомненно, оценка активностей митохондриальных ферментов - ценный подход для изучения состояния системы энергопродукции, однако он не позволяет однозначно диагностировать наличие митохондриальной дисфункции, поэтому для выявления точных причин нарушений в системе энергопродукции требуется проведение дополнительных исследований [54].
Перспективными для применения в клинической практике являются методы цитохимического анализа активности митохондриальных ферментов (сукцинат-дегидрогеназы и др.) в форменных элементах периферической крови, которые отличаются сравнительной простотой, неинвазивны, требуют анализа всего нескольких капель крови и позволяют изучить активность ферментов в естественном клеточном окружении МХ, благодаря иммобилизации сети МХ на стекле. Методы основаны на восстановлении тетразолиевых красителей мито-хондриальными ферментами с образованием окрашенных гранул формазана, по количеству или площади которых судят об активности фермента [12, 13]. Недавно предложен цитобиохимический метод оценки состояния системы энергопродукции лимфоцитов периферической крови с применением компьютеризованного видеомик-роскопирования, позволяющий измерить несколько характеристик активности сукцинатдегидрогеназы и выявить различные функциональные состояния этого фермента [10].
Изучение синтеза АТФ в МХ.
Измерение уровня АТФ позволяет оценить функциональное состояние МХ в клетках и тканях. Скорость синтеза АТФ в МХ можно оценить полярографическим методом [23]. Наиболее часто для определения уровня АТФ используют биолюминесцентный метод, основанный на люциферин-люциферазной реакции, запускаемой АТФ. Метод может применяться как быстрый кинетический подход для мониторинга синтеза АТФ и позволяет вычислить долю АТФ, синтезированного в МХ в ходе окислительного фосфорилирования [57]. Содержание АТФ в пробе измеряют по количеству НАДФН2, образованного под действием митохондриальных ферментов гексокиназы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы. Однако такой подход не позволяет измерять уровень АТФ в клетках в динамике [32]. Также содержание АТФ определяют методом, основанным на обратной зависимости между уровнем АТФ и концентрацией ионов Mg2+ (^2+^). Mg2+ связывается с АТФ и высвобождается, когда происходит гидролиз АТФ. Расчет концентрации АТФ проводят по концентрации Mg2+ с учетом констант реакций. Увеличение говорит о снижении уровня АТФ в цитозоле. В настоящее время разработаны протоколы для кинетического изучения обмена АТФ АДФ в клетках, основанные на измерении флуоресценции различных Mg-содержащих красителей [32, 38]. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет точно измерить концентрацию аде-ниновых нуклеотидов и других высокоэнергизированных
фосфатов для оценки функционального состояния МХ [57]. Единственным неинвазивным способом, который позволяет определять АТФ в клетках in vivo, является метод ядерной магнитно-резонансной спектроскопии [57].
Другие методы оценки состояния системы энергопродукции.
В ряде случаев для изучения функционального состояния МХ измеряют концентрацию кальция, значение митохондриального pH, оценивают продукцию активных форм кислорода, продукцию лактата и др.
Концентрацию Ca2+ в МХ оценивают по флуоресценции красителей (Rhod-2 в отдельности и в сочетании с цитозольными индикаторами Ca2+, а также в комбинации с митохондриальными маркерами MitoTracker) методами оптической визуализации [40, 56]. Однако точное содержание Ca2+ в МХ бывает сложно измерить из-за насыщения красителей, попадания их за пределы МХ, а также фотовыгорания красителей, что может ограничивать время измерения. Технология рентгеновского микроанализа позволяет измерять митохондриальный Ca2+ в течение нескольких часов [45]. Для измерения кальция также используют белок экворин и рекомбинантные флуоресцентные белки GFP [51].
Концентрацию протонов в МХ измеряют рН-чувстви-тельными сенсорами, которые меняют свои оптические свойства при связывании с протонами, а также при помощи рекомбинантных белков GFP, EYFP и др. Однако некоторые флуоресцентные зонды не позволяют точно определить значение pH в матриксе МХ [30, 51].
Главный сайт продукции активных форм кислорода - комплекс I дыхательной цепи МХ. Их продукцию можно оценить при помощи красителей, образующих с активными формами кислорода флуоресцентные соединения (производные дихлородигидрофлуоресцина, HEt, DHR123, MitoTracker и др.). Для многих индикаторов характерны недостаток селективности к отдельным видам АФК и чувствительность к атмосферному кислороду [30, 32]. Для количественного определения АФК используют рекомбинантные флуоресцентные белки (GFP, YFP и др.), однако методы с их применением также имеют серьезные недостатки [32].
Для оценки функционального состояния МХ тромбоцитов, лимфоцитов, культивируемых клеток in vitro используют метод, основанный на эффекте Пастера, который отражает способность МХ к образованию энергии [46].
Модульный кинетический анализ протонного цикла позволяет упростить сложные процессы, происходящие в МХ, до трех модулей реакций (окисление субстратов, утечка протонов, оборот АТФ), связанных через про-тондвижущую силу, и дает возможность выявить любые изменения функционального состояния МХ, а также различить первичные и вторичные изменения функционального состояния МХ [27].
In vivo мониторинг биоэнергетики
Большинство исследований системы энергопродукции проводится in vitro. Однако существует ряд методик оценки состояния системы энергопродукции неинвазив-
ным способом in vivo, которые позволяют различать снижение количества МХ и митохондриальные дисфункции. В основном для исследования функционального состояния МХ in vivo измеряют флуоресценцию НАДН и фла-вопротеинов, концентрацию и парциальное давление кислорода в ткани, а также скорость его потребления, скорость синтеза АТФ, насыщение гемоглобина и мио-глобина кислородом [24, 35, 36, 44, 47, 55]. К сожалению, большинство этих методов не применяется в клинической практике.
Заключение
Нарушения в системе митохондриальной энергопродукции могут наблюдаться при различных патологических состояниях. Своевременное выявление этих нарушений позволяет разработать меры профилактики и оптимизировать терапию.
Существующие подходы к оценке состояния системы энергопродукции in vitro и in vivo могут быть разделены на быстрые и простые скрининговые протоколы и сложные алгоритмы анализа, требующие специализированного оборудования и особой тщательности в соблюдении условий измерений. В качестве индикаторов функционального состояния МХ применяют митохондриальный мембранный потенциал, окислительно-восстановительное состояние и активность митохондриальных ферментов, уровень восстановленности пиридиннуклеотидов, митохондриальный pH, уровень Ca2+ и другие показатели. Состояние системы энергопродукции очень часто оценивают по скорости потребления кислорода и образования АТФ в МХ клеток и тканей. Также существуют методы оценки энергетического обмена in vivo, позволяющие не только изучать многие биохимические процессы, но и визуализировать сами органы, в которых эти процессы развиваются.
К сожалению, большинство современных методов исследования МХ, применяемых в экспериментальных исследованиях, в том числе многие методы оценки состояния системы энергопродукции in vivo, в настоящее время не применяются в клинической практике в нашей стране. По нашему мнению, для оценки состояния системы энергопродукции в клинической практике перспективным является простой и минимально инвазивный цитобиохимический метод оценки активности митохон-дриальных ферментов в лимфоцитах периферической крови [7]. Выявление сопряженности функционального состояния митохондрий тканей органов, наиболее подверженных патологическому процессу, и функционального состояния митохондрий клеток периферической крови послужит основанием для возможности оценки энергетического статуса жизненно важных тканей организма по функциональному состоянию митохондрий лимфоцитов периферической крови.
Литература
1. Аверченко Е.А., Кавок Н.С., Степаненко А.М. и др. Оценка
митохондриального потенциала изолированных гепатоци-
тов при изменении окислительного статуса // Бюф1зичний
Вкник Вип. - 2009. - T. 22, № 1. - С. 49-56.
2. Албертс Б. Молекулярная биология клетки : в 3 т. / пер. с англ. - М. : Мир, 1994. - Т. 1. - 517 с.
3. Бра М., Квинан Б., Сузин С.А. Митохондрии в программированной гибели клетки: различные механизмы гибели (обзор) // Биохимия. - 2005. - Т. 70, № 2. - С. 284-293.
4. Виноградов А.Д. Преобразование энергии в митохондриях // Соросовский образовательный журнал. - 1999. - № 9. -С. 11-19.
5. Камкин А.Г., Каменский А.А. Фундаментальная и клиническая физиология : учебное пособие. - М. : Академия, 2004. -1073 с.
6. Кашуро В.А., Долго-Сабуров В.Б., Башарин В.А. и др. Некоторые механизмы нарушения биоэнергетики и оптимизация подходов к их фармакотерапии // Биомедицинский журнал Medline.ru. - 2010. - Т. 11. - С. 611-634.
7. Кондрашова М.Н., Хундерякова Н.В., Захарченко М.В. Оригинальный цито-биохимический метод выявления индивидуальных различий физиологического состояния организма по комплексной характеристике (паттерну) активности сукцинатдегидрогеназы // Биомедицинский журнал Medline.ru. - 2009. - Т. 10. - С. 27-43.
8. Кондрашова М.Н. Взаимодействие метаболической и гормональной регуляции (биоэнергетические аспекты) // Регуляторы энергетического обмена : материалы симпозиума. - Томск, 2002. - С. 16-26.
9. Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В., Бабский А.М. и др. Гоме-остазирование физиологических функций на уровне митохондрий // Молекулярные механизмы клеточного гоме-остаза. - Новосибирск : Наука, 1987. - С. 40-66.
10. Кушнарева Ю.Е., Старков А.А. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях (обзор) // Биохимия. - 2005. -Т. 70, № 2. - С. 246-264.
11. Мамендалиева Н.М., Шищенко В.М., Фурсова З.К. и др. Эффективность применения метаболической коррекции у беременных с привычным невынашиванием и группы высокого риска развития плацентарной недостаточности и перинатальных осложнений // Здравоохранение Казахстана. - 1991. - № 3. - С. 30-33.
12. Нарциссов Р.П. Анализ изображения клетки - следующий этап развития клинической цитохимии в педиатрии // Педиатрия. - 1998. - № 4. - С. 101-105.
13. Петричук С.В., Шищенко В.М., Духова З.Н. и др. Диагностические и прогностические возможности клинической цитохимии. - М., 2005. - 74 с.
14. Сарис Н.-Е.Л., Карафоли Э. Роль митохондрий в перераспределении внутриклеточного кальция: исторический обзор (обзор) // Биохимия. - 2005. - Т. 70, № 2. - С. 231-239.
15. Семенова Г.Ф., Комарова Е.В., Потапов А.С. и др. Информативность основного энергообмена МХ лимфоцитов периферической крови у детей с хроническими запорами // Вопросы современной педиатрии. - 2007. - Т. 6, № 3.
- С. 48-52.
16. Сидоренко В.М. Молекулярная спектроскопия биологических сред : учебное пособие - М. : Высш. шк., 2004. - С. 53.
17. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. - М. : Наука, 1989. -123 с.
18. Скулачёв В.П. Фенoптoз: запрoграммирoванная смерть // Биoхимия. - 1999. - Т. 64, № 6. - С. 1679-1688.
19. Тодоров И.И. Митохондрии: окислительный стресс и мутации митохондриальной ДНК в развитии патологий, процессе старения и апоптозе // Российский химический журнал. - 2007. - Т. 51, № 1. - С. 93-106.
20. Фильчак О.С., Кавок Н.С., Степаненко А.М. и др. Оценка трансмембранного потенциала митохондрий одиночных гепатоцитов методом флуоресцентных зондов // Бiофiзичний Вкник Вип. Методи Бiофiзичних Дослщжень.
- 2009. - Т. 23, № 2. - С. 140-147.
21. Фокин В.Ф., Пономарева Н.В. Энергетическая физиология мозга // Энергетическая физиология мозга - М. : Издательство, 2002. - 249 с.
22. Amero K.K., Bosley T.M. Detection of mitochondrial respiratory dysfunction in circulating lymphocytes using resazurin // Arch. Pathol. Lab. Med. - 2005. - Vol. 129. - P. 1295-1298.
23. Barrientos A., Fontanesi F., Diaz F. Evaluation of the mitochondrial respiratory chain and oxidative phosphorylation system using polarography and spectrophotometric enzyme assays // Current Protocols in Human Genetics. - 2009. - Ch. 19, unit 19.3. - P. 1-13.
24. Befroy D.E., Petersen K.F., Rothman D.L. et al. Assessment of in vivo mitochondrial metabolism by magnetic resonance spectroscopy // Methods in Enzymology. - 2009. - Vol. 457. -P. 373-393.
25. Benit P., Goncalves S., Dassa E.P. et al. Three spectrophotometric assays for the measurement of the five respiratory chain complexes in minuscule biological samples // Clinica Chimica Acta. - 2006. - Vol. 374, No. 1-2. - P. 81-86.
26. Birket M.J., Orr A.L., Gerencser A.A. et al. A reduction in ATP demand and mitochondrial activity with neural differentiation of human embryonic stem cells // Journal of Cell Science. -2011. - Vol. 124. - P. 348-358.
27. Brand M.D., Nicholls D.G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells // Biochemical Journal. - 2011. - Vol. 435. - P. 297312.
28. Chance B., Williams G.R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization // Journal of Biological Chemistry. - 1955. - Vol. 217. - P. 383-393.
29. Dykens J.A., Will Y. The significance of mitochondrial toxicity testing in drug development // Drug Discovery Today. - 2007. - Vol. 12, No. 17-18. - P. 777-785.
30. Degli Esposti M. Assessing Functional Integrity of Mitochondria in Vitro and in Vivo // Methods in cell biology. - 2001. - Vol. 65. - P. 75-96.
31. Fernandez-Silva P. In vivo and in organello analyses of mitochondrial translation // Mitochondria. - 2nd edition (Methods in cell biology) / edited by L.A. Pon, E.A. Schon. -2007. - Vol. 80. - P. 571-588.
32. Foster K.A., Galeffi F., Gerich F.J. et al. Optical and pharmacological tools to investigate the role of mitochondria during oxidative stress and neurodegeneration // Progress in Neurobiology. - 2006. - Vol. 79, No. 3. - P. 136-171.
33. Gellerich F.N., Mayr J.A., Reuter S. et al. The problem of interlab variation in methods for mitochondrial disease diagnosis: enzymatic measurement of respiratory chain complexes // Mitochondrion. - 2004. - Vol. 4, No. 5-6. - P. 427-439.
34. Gnaiger E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function / edited by J. Dykens and Y. Will // Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. - New Jersey : John Wiley & Sons, 2008. - P. 327352.
35. Golub A.S., Pittman R.N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification // American Journal of Physiology. Heart Circulation Physiology. - 2008. - Vol. 294, No. 6. - P. H2905-H2916.
36. Harms F.A., Voorbeijtel W.J., Bodmer S.I.A. et al. Cutaneous respirometry by dynamic measurement of mitochondrial oxygen tension for monitoring mitochondrial function in vivo // Mitochondrion. - 2012. - (In Press).
37. Jonckheere A.I., Huigsloot M., Janssen A.J.M. et al. High-throughput assay to measure oxygen consumption in digitonin-permeabilized cells of patients with mitochondrial disorders // Clinical Chemistry. - 2010. - Vol. 56, No. 3. - P. 424-431.
38. Kawamata H., Starkov A.A., Manfredi G. et al. A kinetic assay of mitochondrial ADP-ATP exchange rate in permeabilized cells
// Analytical Biochemistry. - 2010. - Vol. 407, No. 1. - P. 5257.
39. Kirby D.M., Thorburn D.R., Turnbull D.M., Taylor R.W. Biochemical assays of resoiratory complex activity // Mitochondria, 2nd edition (Methods in cell biology) / edited by L.A. Pon, E.A. Schon. - 2007. - Vol. 80. - P. 93-119.
40. Kovacs R., Kardos J., Heinemann U. et al. Mitochondrial calcium ion and membrane potential transients follow the pattern of epileptiform discharges in hippocampal slice cultures // Journal of Neuroscience. - 2005. - Vol. 25, No. 17. - P. 4260-4269.
41. Lanza I.R., Nair S.K. Mitochondrial metabolic function assessed in vivo and in vitro // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. -2010. - Vol. 13, No. 5. - P. 511-517.
42. Lemasters J.J. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores // Mitochondria, 2nd edition (Methods in cell biology) / edited by L.A. Pon, E.A. Schon.
- 2007. - Vol. 80. - P. 283-295.
43. Mayevsky A., Chance B. Oxidation-reduction states of NADH in vivo: from animals to clinical use // Mitochondrion. - 2007. -Vol. 7, No. 5. - P. 330-339.
44. Mayevsky A., Rogatsky G.G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: from animal models to human studies // American Journal of Cell Physiology. Cell Physiology.
- 2007. - Vol. 292, No. 2. - P. C615-C640.
45. Meldolesi J., Grohovaz F. Total calcium ultrastructure: advances in excitable cellsl// Cell Calcium. - 2001. - Vol. 30, No. 1. -P. 1-8.
46. Merlo-Pich M., Deleonardi G., Biondi A. et al. Methods to detect mitochondrial function // Experimental Gerontology. - 2004.
- Vol. 39, No. 3. - P. 277-281.
47. Mik E.G., Johannes T., Zuurbier C.J. et al. In Vivo Mitochondrial Oxygen Tension Measured by a Delayed Fluorescence Lifetime Technique // Biophysical Journal. - 2008. - Vol. 95, No. 8. -P. 3977-3990.
48. Mitochondria and the heart // Developments in Cardiovascular Medicine / edited by J. Marin-Garcia. - New Jersey: Springer, 2005. - 400 p.
49. Oliveira J.M., Jekabsons M.B., Chen S. et al. Mitochondrial dysfunction in Huntington's disease: the bioenergetics of isolated and in situ mitochondria from transgenic mice // Journal of Neurochemistry. - 2007 - Vol. 101, No. 1. - P. 241249.
50. Pesta D. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle // Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology / edited by C.M. Palmeira, A.J. Moreno. - 2012. - Vol. 810. - P. 25-58.
51. Pinton P. Biosensors for the Detection of Calcium and pH // Mitochondria. - 2nd edition (Methods in cell biology) / edited by L.A. Pon, E.A. Schon. - 2007. - Vol. 80. - P. 297-325.
52. Porterfield D.M. Non-Invasive approaches to measuring respiratory patterns using a PtTFPP based, phase-lifetime, self-referensing oxygen optrode // Proc. SPIE 6380 / edited by B.M. Cullum, J.C. Carter. - 2006. - Vol. 6380. - 63800S1-63800S8.
53. Quarato G., Piccoli C., Scrima R. et al. Functional imaging of membrane potential at the single mitochondrion level: Possible application for diagnosis of human diseases // Mitochondrion.
- 2011. - Vol. 11, No. 5. - P. 764-773.
54. Rodenburg R.J.T. Biochemical diagnosis of mitochondrial disorders // Journal of Inherited Metabolic Disease. - 2011. -Vol. 34, No. 2. - P. 283-292.
55. Springett R., Swartz H.M. Measurements of oxygen in vivo: overview and perspectives on methods to measure oxygen within cells and tissues // Antioxidants & Redox Signaling. -2007. - Vol. 9, No. 8. - P. 1295-1302.
56. Takahashi A., Zhang Y., Centonze V.E. et al. Measurement of Mitochondrial pH In Situ // BioTechniques. - 2001. - Vol. 30. -
P. 804-815.
57. Vives Bauza C. Assay of mitochondrial ATP synthesis in animal cells and tissues // Mitochondria, 2nd edition (Methods in Cell Biology) / edited by L.A. Pon, E.A. Schon. - 2007. - Vol. 80. -P. 155-171.
58. Will Y., Hynes J., Ogurtsov V.I. et al. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes // Nature Protocols. - 2007. - Vol. 1. - P. 2563-2572.
59. Yadava N., Nicholls D.G. Spare respiratory capacity rather than oxidative stress regulates glutamate excitotoxicity after partial respiratory inhibition of mitochondrial complex I with rotenone // The Journal of Neuroscience. - 2007. - Vol. 27, No. 27. -P. 7310-7317.
60. Yotter R.A., Lee L.A., Wilson D.M. sensor technologies for monitoring metabolic activity in single cells part I: optical methods // IEEE Sensors Journal. - 2004. - Vol. 4, No. 4. -P 395-411.
Поступила 08.05.2013
Сведения об авторах
Фрелих Галина Андреевна, аспирантка ФГБУ "НИИ фармакологии" СО РАМН. Адрес: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3. E-mail: galina.frelikh@ pharmso.ru. Поломеева Наталья Юрьевна, канд. биол. наук, младший научный сотрудник ФГБУ "НИИ фармакологии" СО РАМН.
Адрес: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3. E-mail: natalia.polomeeva@pharmso.ru. Васильев Александр Сергеевич, канд. биол. наук, старший научный сотрудник ФГБУ "НИИ фармакологии" СО РАМН.
Адрес: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3. E-mail: alexander.vasilev@pharmso.ru. Удут Владимир Васильевич, докт. мед. наук, профессор, чл.-корр. РАМН, заслуженный деятель науки РФ. Адрес: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3. E-mail: udutv@mail.ru.
