CC BY
45
•т
ПРОДОВОЛЬСТВЕННАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ
ТЕМА НОМЕРА КАЧЕСТВО И БЕЗОПАСНОСТЬ ПРОДУКЦИИ
УДК 57.083.18:591.2:597.583.1
Современные методы мониторинга
качества рыбной продукции
Е.В. Суханова, аспирант, Е.В. Дзюба, канд. биол. наук, Н.Н. Деникина, канд. биол. наук Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск
Ю.Ю. Филь, Н.Л. Белькова, канд. биол. наук, доцент, В.П. Саловарова, д-р биол. наук, профессор
Иркутский государственный университет
Россия - крупный субъект в торговле рыбопродуктами. По данным межправительственной международной продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (Роос1 and Agriculture Organization -ФАО), занимающейся вопросами продовольственных ресурсов и развития сельского хозяйства стран мирового сообщества, Российская Федерация числится среди основных рыбодобывающих стран наряду с США, Японией, Перу, Китаем и Таиландом. Объем отечественного ежегодного улова рыбы и морепродуктов составляет 3418,3 тыс. т [1]. Совершенствование потребительских достоинств отечественной рыбопродукции - перспективное направление развития рыбообрабатывающей отрасли, а также актуальная научно-техническая задача товароведения и экспертизы товаров, вырабатываемых из гидробионтов [2].
Сведения о составе микрофлоры промысловых рыб необходимы для научного обеспечения контроля показателей качества и безопасности рыбного сырья и готовой продукции. Производство рыбных продуктов требует соблюдения высокой санитарной культуры на всех этапах технологического процесса. Рыба и продукты ее переработки имеют ограниченные сроки хранения, поэтому их микробиологический контроль носит профилактический характер и должен способствовать улучшению санитарного состояния производства, а следовательно, сохранению качества готовой продукции и профилактике пищевых заболеваний.
В настоящее время технология разведения гидробионтов в мари- и аквакультуре превратилась в динамично развивающийся сектор на
Ключевые слова: молекулярно-гене-тическая идентификация; мониторинг качества рыбной продукции; безопасность продуктов питания.
Key words: molecular identification; monitoring the quality of fish products: food security.
международном рынке, занимающий около 25 % всего мирового потребления рыбы. При разведении рыб, как в естественных, так и в искусственных водоемах, одну из серьезных проблем составляет изменение трофности водной среды и образование токсичных соединений, вызванных увеличением концентраций продуктов животного метаболизма [3]. В этих условиях преимущество для роста и развития получают сапрофитные микроорганизмы, и происходит распространение различных инфекций, что, в свою очередь, ведет к повышенной смертности объектов культивирования и серьезным экономическим потерям [4]. С другой стороны, обсеменен-ность рыбы и рыбной продукции микроорганизмами может влиять как на ее внешний вид и качество, так и на безопасность для человека [5, 6]. Развитие таких микроорганизмов, как Aeromonas, Flavobacterium, Pseudomonas и др., приводит к порче рыбной продукции и, как следствие, к большим товарным потерям [7]. Рыба - носитель целого ряда патогенных микроорганизмов, опасных для человека, таких как Erysipelothrix rhusiopathiae,
Clostridium botulinum, Streptococcus iniae, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Aeromonas spp., Salmonella spp.,
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Edwardsiella tarda, Legionella pneumophila, Plesiomonas shigelloides и др. [6, 8, 9, 10, 11]. Присутствие и размножение анаэробной микрофлоры в рыбной продукции, не приводящее к существенным внешним изменениям, служит причиной возникновения кишечных пищевых инфекций и отравлений.
В Иркутской области байкальский омуль Coregonus migratorius- наиболее ценный объект рыбного промысла, а его переработка и реализация - важные виды хозяйственной деятельности региона. В связи с этим важной проблемой является разработка адекватных подходов для детекции определенных видов микроорганизмов в обеспечении контроля качества и безопасности рыбной продукции. Цель настоящей работы заключается в ПЦР-диагностике некоторых потенциально опасных микроорганизмов в продуктах из байкальского омуля и в обсуждении преимуществ использования данного подхода в комплексной системе мониторинга качества рыбной продукции.
В качестве объектов исследования использовали образцы рыбной продукции (байкальский омуль) основных производителей: ООО «Байкал Продукт» и ЧП «Воронина». Микрофлору байкальского омуля исследовали в образцах после замораживания и соления «культурным» или «заводским» способом (вместе с внутренностями).
При выборе образцов (органов и тканей рыб) для проведения анализа руководствовались имеющимися в литературе данными об их характеристиках при наличии бактериального загрязнения. Известно, что жабры выполняют важную барьерную функцию для организма рыб. При поражении жабр увеличивается доступ к внутренним органам не только токсичных веществ, но и различных микроорганизмов из водной среды. Так, высокая степень бактериального загрязнения жабр вызвала изменения органолептических свойств рыб, выловленных в основном русле Амура, употребление которых стало представлять реальную угрозу для здоровья человека [12]. Изменение качества рыбы происходит и при нарушении барьерных функций кожного покрова с последующей интродукцией бактерий в мышечные ткани, что сопровождает-
FOOD PROVISION SECURITY
QUALITY AND SAFETY FOODSTAFFS
ся изменением их консистенции и появлением неспецифических запахов [13].
В связи с этим, для выделения суммарной ДНК были использованы жабры, соскобы с внешних покровов, слизь с внутренней полости и почки байкальского омуля. Фрагменты органов и тканей рыб отбирали в стерильных условиях, материал сразу же обрабатывали лизирующи-ми буферами. Выделение суммарной ДНК проводили, используя коммерческие наборы «РИБО-сорб», «ДНК-сорб А» и «ДНК-сорб Б» («Ам-плиСенс», Москва) по прилагаемой инструкции с небольшими модификациями. Пробы прогревали 5-10 мин при 60 °С, центрифугировали 15 мин при 12000 мин-1, надосадочную жидкость переносили в новую пробирку. К прозрачному лизату добавляли 25 мкл сорбента, тщательно перемешивали, выдерживали при комнатной температуре 5 мин, периодически взбалтывая. Дальнейшую обработку вели, как рекомендовано в инструкциях фирмы-производителя. Нуклеиновые кислоты элюирова-ли в 25 мкл ТЕ буфера: осадок тщательно суспендировали, прогревали в термостате 5 мин при 60°С и центрифугировали 5 мин при 12000 мин-1. Надосадочную жидкость тщательно отбирали в новую пробирку и использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В работе использовали праймеры, комплементарные наиболее консервативным участкам гена 16S рРНК бактерий (в скобках дана нумерация нуклеотидов по Escherichia coli или по соответствующему типовому штамму) 500L (514-533) и 1350R (1389-1407), групп-специфичные для филогенетической линии Firmi-cutes BLS (342-360) и видоспеци-фичные праймеры на Acinetobacter calcoaceticus (652-669), Pseudomonas aeruginosa (178-193 и 600617), Aeromonas hydrophyla (424-451 и 1090-1111) и Bacillus sp. (275-294 и 1370-1388) («БиоСан», Новосибирск) [14]. В амплификации подбирали режим, обеспечивающий высокое качество ПЦР-продукта нужной длины. Для этого ПЦР проводили в разных условиях, в том числе проверяя температуру отжига в градиенте температур от 44 до 72°С в амплификаторе DNA Engine DYADTM. Анализ продуктов амплификации проводили фракционированием смесей в 1,5 %-ном
агарозном геле с бромистым этиди-ем. Результаты анализа визуализировали на трансиллюминаторе в УФ-свете.
Для оценки микробиологической безопасности мороженого и соленого омуля с применением ПЦР на первом этапе исследования использованы пары консервативных праймеров на все бактерии и филогенетическую группу грамположительных споро-образующих бактерий. Внешние покровы рыб значительно обсеменены микроорганизмами, в отличие от жабр и внутренней полости (рис. 1). Наличие ПЦР-продуктов бактериального происхождения свидетельствует об эффективности применения молекулярно-генетического анализа и в дальнейшем служит положительным контролем.
На следующем этапе были выбраны праймеры, специфичные на определенные виды микроорганизмов, вызывающие порчу рыбной продукции - P. aeruginosa, A. hydrophyla и Bacillus sp., а также широко распространенные в окружающей среде (A. calcoaceticus) [15]. Во всех проанализированных образцах детектируется специфичный ампликон для A. calcoaceticus, что служит очевидным показателем распространения этого вида бактерий (рис. 2). Развитие других видов микроорганизмов A. hydrophyla и P. aeruginosa связано с заболеваниями рыб в естественных местах обитания. Положительный продукт детектируется во всех образцах, полученных из соленого омуля, что может свидетельствовать о развитии и размножении этого вида микроорганизма при консервировании и хранении рыбной продукции. В образцах мороженого омуля положительный ампликон детектируется только на внутренней полости рыбы, что подтверждает преимущества быстрой и глубокой заморозки рыбной продукции для сохранения качества рыбы. Известно, что грам-положительные спорообразующие бактерии Bacillus sp. имеют более высокий потенциал для сохранения в виде спор и последующего размножения. Полное отсутствие положительного продукта для этого вида микроорганизмов может свидетельствовать о безопасности проанализированных образцов омуля.
Промышленная стерильность рыбной продукции означает отсутствие в ней микроорганизмов, способных развиваться при температурах хра-
М JTJ jr_ гр;. JFL'I JFEJ IT Л JF1MF2D I'll íj/.Vl /PI JFÏ JTÏ JFIF ÍFIL rTJJ JÏÛ I KM IF1J Huctcriu I K in ru: г -
1GGG п 5GG п.н.-=
н. н..
Рис. 1. Результаты электрофоретического анализа обсемененности мороженного (JF1-3) и соленого (JF10-12, 19-21) байкальского омуля на групп-специфичных парах праймеров на Bacteria и Firmicutes: стрелками обозначены позиции специфичных ПЦР-продуктов; М -маркер молекулярной массы; цифрами обозначен размер фрагментов ДНК в парах нуклеотидов (п.н.); JF1, JF10, JF19 - соскоб с внешних покровов рыб; JF2, JF11, JF20 - жабры со слизью; JF3, JF12, JF21 - слизь с внутренней полости и почки
А дай эчшЛ\tirophi h
1GGG п.н 5GG п.н.
.
M JFI ДТ IF: If I ни Jn : 1Г ч inn Е- f. г J щ 1Г. JFJ FF I in 4FH ЯП im I
1GGG п.н. 5GG п.н.
Рис. 2. Результаты электрофоретического анализа обсемененности мороженного (JF1-3) и соленого (JF10-12, 19-21) байкальского омуля на видо-специфичных парах праймеров на A. calcoaceticus, P. aeruginosa, A. hydrophyla и Bacillus sp: грелками обозначены позиции специфичных ПЦР-продуктов; М - маркер молекулярной массы; цифрами обозначен размер фрагментов ДНК в парах нуклеотидов (п.н.)
нения, установленных для данного вида продуктов, и отсутствие микроорганизмов, опасных для здоровья потребителя [16].
Для бактериологического исследования используют традиционный (классический) микробиологический подход, который предполагает культивирование на селективных средах отдельных физиологических групп органотрофных бактерий. Эта методология имеет два существенных ограничения: во-первых, результаты, получаемые после культивирования, очень трудно оценить и перевести в количественные характеристики микробного разнообразия. Подсчет числа колоний, выросших на питательных средах, недоучитывает общую численность микроорганизмов, а одновременное использование различных селективных сред приводит к переоценке результата. Ошибка метода культивирования может достигать 50% [17]. При этом отдельные группы культивируемых микроорганизмов оказываются неучтенными.
•т
ПРОДОВОЛЬСТВЕННАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ
ТЕМА НОМЕРА КАЧЕСТВО И БЕЗОПАСНОСТЬ ПРОДУКЦИИ
Во-вторых, в состав любого микробного сообщества входит большое число микроорганизмов, культивирование которых затруднено по тем или иным причинам. Это бактерии, которые при посеве на питательные среды переходят в некуль-тивируемое состояние ввиду каких-то собственных физиологических причин, или бактерии, которые в природной среде находились в не-культивируемом состоянии на момент взятия проб. Последним требуется определенное время для адаптации к изменившимся условиями среды обитания. В результате все эти организмы, так или иначе, остаются неизученными. Для их исследования необходимы альтернативные методы и специальные подходы [18].
Преодолеть эти недостатки помогает использование других методических подходов. Так, для количественной характеристики микробного разнообразия применяют методы микроскопии, а для идентификации некультивируемых микроорганизмов - современные молекулярно-ге-нетические подходы. С помощью методов оптической микроскопии проводят прямой подсчет бактериальных клеток. В настоящее время разработаны системы автоматического подсчета численности микроорганизмов с использованием флуоресцентной микроскопии [19].
Современные методы молекуляр-но-генетического анализа, включающие секвенирование рибосомных генов посредством выделения ДНК и амплификации, а также групп- и ви-доспецифичную гибридизацию, становятся мощным инструментом для изучения микрофлоры рыб. Первоначально эти методы широко использовали для уточнения видовой принадлежности культивируемых штаммов и для эффективной видо-специфич-ной диагностики бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний рыб [20]. В настоящее время внедрение методов молекулярной диагностики (ПЦР-диагностики) в систему комплексного мониторинга контроля качества продукции и продуктов актуально и перспективно, учитывая необходимость разработки современных норм и требований товароведческой экспертизы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Одинцов, М.В. Аналитическая записка «Эффективность государ-
ственного управления рыбохозяй-ственным комплексом Российской Федерации, в том числе контроля в области рыболовства и сохранения водных биоресурсов»/М.В. Один-цов//Бюллетень Счетной палаты Российской Федерации. - 2008. -№ 1. - C. 184-215.
2. Подсосонная, М.А. Потребительские свойства консервов из нетрадиционного сырья водного промысла с применением коптильно-пряных ароматизаторов: дисс. на канд. техн. наук/М.А. Подсосонная. - М., 2007. - 24 с.
3. Ведемейер, Г.А. Стресс и болезни рыб/Г.А. Ведемейер, Ф.П. Мейер, Л. Смит. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. - 128 с.
4. Павлович, Г.М. Эпизоотическая обстановка в рыбоводных хозяйствах Росрыбхоза//Состояние и перспективы развития фермерского рыбоводства аридной зоны/Г.М. Павлович. - Ростов-на-Дону, 2006. - С. 68-69.
5. Промышленная дезинфекция и антисептика: Учеб. пос./В.А. Галын-кин [и др.]. - СПб, 2008. - 232 с.
6. Fish: a potential source of bacterial pathogens for human beings/ Novotny L. [et al.]//Vet. Med. -Czech. - 2004. - Vol. 49. - № 9. - P. 343-358.
7. Ларцева, Л.В. Персистирование условно-патогенной микрофлоры в различных гидробионтах Волго-Кас-пийского региона//Современные аспекты экологии и экологического образования/Л.В. Ларцева, А.А. Земский, И.А. Лисицкая, О.В. Обухова. - Назрань, 2007. - С. 139-145.
8. Brooke, C.J. Erysipelothrix rhusiopathiae: bacteriology, epidemiology and clinical manifestations of an occupational pathogen/C.J. Brooke, T.V. Riley//J. Med. Microbiol. - 1999. - Vol. 48. - P. 789-799.
9. Hyytia, E. Biodiversity of Clostridium botulinum Type E Strains Isolated from Fish and Fishery Products/E. Hyytia, S. Hielm, J. Bjorkroth, H. Korkeala//Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - Vol. 65. - № 5. -P. 2057-2064.
10. Romney, M. Erysipelothrix rhusiopathiae endocarditis and presumed osteomyelitis/M. Romney, S. Cheung, V. Montessori V.//Can. J. Infect. Dis. - 2001 - Vol. 12. - № 4. -P. 254-256.
11. Lalitha, K.V. Occurrence of Clostridium botulinum in fresh and
cured fish in retail trade in Cochin (India)/K.V. Lalitha, P.K Surendran// Int. J. of Food Microbiol. - 2002. -Vol. 72. - № 1-2. - P. 169-174.
12. Кондратьева, Л.М. Экологические аспекты изменения органолепти-ческих показателей ихтиофауны р. Амур в зимний период/Л.М. Кондратьева, Л.М. Чухлебова, В.Л. Рапо-порт//Чтения памяти Владимира Яковлевича Леванидова.- 2003.-Вып. 2. - С. 311-318.
13. Антонов, Н.А. Экспертиза мяса убойных животных, птицы, рыбы/ Н.А. Антонов, С.А. Денисова, В.В. Шевченко. - СПб., 1994. - С. 29-42.
14. Белькова, Н.Л. Введение в молекулярную экологию микроорганизмов: Учебно-метод. пос./Н.Л. Белькова, А.М. Андреева.- Ярославль: Изд-во ООО «Принтхаус», 2009. - 91 с.
15. Buller, N.B. Bacteria from fish and other aquatic animals: a practical identification manual/N.B Buller. -Oxfordshire: CABI publishing, 2004. -361 p.
16. Блинникова, О.М. Методические указания для выполнения лабораторных работ на тему «Экспертиза рыбы и рыбных продуктов»/О.М. Блинникова. - Мичуринск, 2007. -24 с.
17. Austin, B. The bacterial microflora of fish/В. Austin//The ScientificWorldJournal. - 2002. - Vol. 2. - P. 558-572.
18. Белькова, Н.Л. Молекулярно-генетическая идентификация кишечной микрофлоры и протистов байкальских рыб//Аннотирован-ный список фауны озера Байкал и его водосборного бассейна: в 2 т./ Н.Л. Белькова, Е.В. Дзюба, Е.В. Суханова.- Новосибирск: Наука, 2009.- T.II: Водоемы и водотоки юга Восточной Сибири и Северной Монголии/О.А. Тимошкин, В.И. Провиз, Т.Я. Ситникова и др. -(Справочники и определители по фауне и флоре озера Байкал). - С. 957-980.
19. Pettipher, G.L. Preliminary evaluation of COBRA, an automated Deft instrument, for the rapid enumeration of microorganisms in cultures, raw-milk, meat and fish/G.L. Pettipher, Y.B. Watts, S.A. Langford, R.G. Kroll//Lett. Appl. Microbiol., 1992. - Vol. 14. - P. 206-209.
20. Кузьмина, В.В. Физиолого-биохимические основы экзотрофии рыб/В.В. Кузьмина. - М.: Наука, 2005. - 300 с.
