CC BY
1359
Современные методы гормонального анализа
Проф. Н.П. ГОНЧАРОВ
Modern methods of hormonal analysis
N.P. GONCHAROV
ФГУ Эндокринологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации, Москва
Представлена характеристика основных методов определения гормонов, включая радиоиммунологические и иммуно-ферментные, а также подробно описаны современные методы иммуноанализа третьего поколения, обладающие высокой чувствительностью, что позволяет определять практически весь основной спектр гормонов и биологически активных соединений. Это открывает новые возможности в диагностике субклинических форм эндокринной патологии.
Ключевые слова: гормоны, методы анализа.
Characteristics of the main methods for hormone detection and measurement including radioimmune and immunoenzyme assays are presented along with the detailed description of up-to-date highly sensitive immunoassays of the third generation. These methods are described as allowing determination of virtually the entire range of hormones and biologically active compounds. Their application opens up new opportunities for diagnostics of subclinical forms of endocrine pathology.
Key words: hormones, hormonal assays.
Одним из определяющих достижений современной биологии и медицины является создание во второй половине ХХ века методов радиоиммунологического определения гормонов и других биологически активных соединений в различных средах и тканях организма, позволяющих адекватно оценить функциональное состояние эндокринной или любой другой физиологической системы.
Появление радиоиммунологических методов относится к 1960 г., когда две независимые группы исследователей Yalow и S. Вегеоп в США и R. Ек1п в Великобритании) впервые описали метод определения инсулина и тироксина с помощью са-турационного анализа, основанного на принципе радиоиммуноанализа (РИА). В первом случае в качестве связывающего компонента были использованы антитела к инсулину, во втором — специфический транспортный белок к тироксину. Работа, посвященная РИА-методу определения инсулина, была удостоена Нобелевской премии.
Впоследствии были созданы и другие методы иммуноанализа. В отличие от ранее использовавшихся биологических и химических методов, иммунологические методы обладают значительными преимуществами.
В настоящее время радиоиммунологические и родственные им неизотопные методы образуют в совокупности единую биотехнологическую систему, позволяющую определять практически неограниченный спектр веществ. Доступность и широкое использование этих методов в виде коммерческих стандартизованных наборов приобретают опреде-
ляющее значение в развитии многих направлений в биологии, медицине и ветеринарии. Различные методы иммуноанализа позволяют определять различные биологически активные вещества с чувствительностью в диапазоне концентраций от 10-6 до 10-12 М и выше.
Общие принципы иммуноанализа
Основополагающим компонентом любого метода иммуноанализа являются антитела — поли-клональные и моноклональные, получаемые in vivo. Антитела, присутствующие в антисыворотке, обычно имеют молекулярную массу более 150 кД и принадлежат к классу иммуноглобулинов (Ig). Обычно в антисыворотке доминируют IgG, IgA и IgM. Варианты в структуре аминокислотных остатков Ig определяют различия в местах связывания антигена. Теоретически считается, что таких мест связывания может насчитываться до 1010.
Основной принцип иммуноанализа — это реакция антитела с антигеном. При взаимодействии антитела (АЬ) и антигена (Ag) образуется комплекс (Ab:Ag) по формуле: Ab+Ag^Ab:Ag.
Для методов иммуноанализа биологически активных соединений необходимы следующие составляющие:
—высокоочищенный антиген для иммунизации;
— антисыворотка с высокоспецифичными антителами;
— высокоочищенный меченый антиген с максимально высокой специфической активностью;
© Н.П. Гончаров, 2011 86
e-mail: goncharovN@endocrincentr.ru
— технология разделения свободного антигена от антигена, связанного с антителами.
Краткая характеристика основных компонентов
иммуноанализа
Антитела
Необходимо всегда помнить, что при разработке любых методов иммуноанализа определяющую роль играет оптимальный выбор высокоспецифических антител независимо от системы регистрации сигнала используемого меченого компонента. Нередко в коммерческих наборах выбор антител не оптимален, что может приводить к диагностическим ошибкам.
Поликлональная антисыворотка содержит несколько тысяч различных типов молекул IgG. Принципиальное отличие моноклональных антител — их идентичность. Они предпочтительнее в методе конкурентного иммуноанализа, так как меченый и определяемый антиген (вещество) конкурируют за один и тот же центр связывания. Знание специфичности их эпитопов имеет существенное преимущество при создании «сандвич»-анализа. Моноклональные антитела легко получать в больших количествах с помощью гибридомной технологии, что обеспечивает возможность стандартизации метода и тем самым воспроизводимость полученных результатов в течение длительного отрезка времени. Применение мо-ноклональных антител для иммуноанализа пептидных гормонов требует большой осторожности, так как их высокая специфичность может приводить к связыванию только одной изоформы того или иного гормона. Этот эффект может проявляться также при аффинной очистке пептидов.
Стандарты
Для пептидных и гликопротеиновых гормонов используются международные стандарты ВОЗ. Работу по их созданию и обновлению координирует отдел биологических стандартов Национального института медицинских исследований в Лондоне. Систематическая информация о стандартах публикуется в докладах ВОЗ. Высокоочищенные стандарты для низкомолекулярных соединений, например для стероидов, можно приобретать у коммерческих фирм или из международной коллекции стандартов стероидов в Национальном институте здоровья США.
Одной из причин несоответствия между стандартами является природная гетерогенность их молекулярной структуры, которая наблюдается в случае гликопротеиновых гормонов (тиреотроп-ный гормон — ТТГ, лютеинизирующий гормон — ЛГ, фолликулостимулирующий гормон — ФСГ), а также пролактина (Прл) и гормона роста (ГР). Содержание изоформ гормонов и их соотношение изменяется в зависимости от источника и технологии
получения гипофизарных гормонов. Другими причинами, влияющими на качество стандартов, могут быть процесс лиофилизации, а также условия и продолжительность их хранения.
Матрикс
Для разбавления стандарта часто используют сыворотки, буферные и белковые растворы. Состав этих растворов или «матриксов» может влиять на реакцию антиген—антитело, в результате чего возникают серьезные систематические ошибки, которые сопровождаются нарушением воспроизводимости результатов анализа. Это довольно распространенное в иммуноанализе явление обозначают «эффектом матрикса». Принцип сопоставимости анализов заключается в том, чтобы анализируемое вещество в пробе взаимодействовало в тех же условиях, что и в стандартном растворе. Матриксные эффекты чаще всего влияют на определение ТТГ, общих трийод-тиронина — ТЗ, тироксина — Т4, Прл, ФСГ, ЛГ и стероидов, если они предварительно не выделены из пробы экстракцией.
Для диагностического мониторинга и проведения научных исследований используются следующие основные методы гормонального иммуноана-лиза: метод радиоиммунного анализа, иммунофер-ментный метод (ИФА), сверхчувствительные методы третьего поколения, основанные на измерении усиленного люминесцентного сигнала или регистрации вычлененного во времени флюоресцентного сигнала и электрохимический метод иммуноанализа с использованием высокопроизводительных автоматических анализаторов ряда зарубежных фирм.
Методы радиоиммуноанализа
Неотъемлемым компонентом радиоиммунологического метода является применение радиоактивной метки (трития — 3Н или 1251) с высокой удельной активностью. Регистрация сигнала осуществляется с помощью специальных гамма- (для 1251) или бета-(для 3Н) счетчиков.
Наряду с достоинствами, общими для всех иммунологических методов, РИА-методы имеют и ряд недостатков. К ним в первую очередь относится использование радиоактивного материала (3Н или 1251). Для персонала лаборатории наличие в наборе радиоактивности не представляет опасности. Короткий период полураспада 1251 (4—5 нед) также ограничивает время использования РИА-наборов и тем самым снижает их диагностическую эффективность.
Неизотопные методы исследования
Создание 30 лет назад метода включения фермента в антитело или определяемый антиген обеспечило быстрое развитие иммуноферментных методов иммуноанализа. Наиболее широко в качестве
меченого компонента используются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). ELISA получил наиболее широкое распространение при определении гормонов в эндокринологии. В качестве твердофазных носителей наиболее широко используются полистироловые микропланшеты. В ELISA используются конъюгаты антител с ферментом, которые, реагируя с соответствующими «хромогенными» субстратами, образуют окрашенные соединения с определенными оптическими характеристиками. Этот метод более производителен по сравнению с классическими жидкофазными методами РИА и ИФА. Однако необходимо помнить о недостатках метода. В частности, высокую точность измерений могут обеспечить только специальные анализаторы. Кроме того, свойства и качество полистироловых микропланшет, используемых в ELISA, при недостаточно оптимальной технологии их производства могут изменяться от партии к партии и даже от лунки к лунке, что драматически влияет на качество и воспроизводимость гормонального анализа.
Высокочувствительные методы третьего
поколения
Флюоресцентный иммуноанализ. Существует несколько разновидностей данного метода. В последние 30 лет большое распространение в гормональной диагностике получил иммуноанализ с флюоресценцией, отсроченной во времени (Delfia), где в качестве метки используется редкоземельный элемент европий. Это принципиально новый тип иммуноанализа. Дельфия позволяет определять стероидные гормоны в пикограммовых количествах, а гипофизарные — в концентрациях от 0,03 мЕд/л (для ТТГ) до 0,15 мЕд/л (для Прл). Дельфия является технологией выбора при проведении скрининга на врожденный гипотиреоз и ВДКН.
Люминесцентный иммуноанализ. Наиболее оптимальными методами иммуноанализа являются фотоэмиссионные или люминесцентные методы. Наибольшее применение в иммуноанализе получил метод с усилением люминесцентного свечения.
Метод усиленной люминесценции
Усиление реакции люминесценции достигается добавлением люминогенного субстрата, люми-нола или изолюминола и специального усилителя. Последний резко усиливает интенсивность и продолжительность свечения, что и обеспечивает высокую чувствительность и воспроизводимость метода. Световой сигнал регистрируется специальным анализатором (люминометры). Метод высокопроизводителен, обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Он наиболее оптимален при обследовании населения на гипотиреоз, так как по-
зволяет определять свободный тироксин в концентрации 8 пмоль/л. Высокая чувствительность определения низкого уровня ТТГ (<0,1 мЕд/л) позволяет использовать его для диагностики субклинических форм гипертиреоза, а также для панели гормонов репродуктивной системы и ряда других гормонов в микрообъемах сыворотки.
Электрохимический метод иммуноанализа как
прообраз биосенсорной технологии
Почти одновременно с разработкой ИФА-методов были созданы и применены электроды для определения биологических молекул. Первые электроды конструировались на основе ферментов в силу их высокой специфичности с субстратами. На этом принципе были разработаны ферментные электроды для определения глюкозы, мочевины и других соединений, присутствующих в биологических жидкостях. Электрохимические методы имму-ноанализа создавались для объединения чувствительности электрохимического детектора и специфичности, присущей реакции взаимодействия антиген—антитело.
В настоящее время в амперометрическом варианте метода наряду с ферментными метками получили многообещающее развитие неферментные электроактивные метки в виде металлоорганиче-ских соединений. Электрохимический гормональный иммуноанализ используется в диагностике эндокринных нарушений, позволяя определить широкий спектр стероидных, гипофизарных гормонов и гормонов щитовидной железы. Эти методы лишены многих недостатков, свойственных спектроскопическим методам регистрации сигнала.
Всегда необходимо помнить, что способ лечения больного определяется клиническим диагнозом, поэтому аналитические методы в первую очередь должны отвечать требованиям правильной диагностики. Не следует полагать, что неизотопные методы иммуноанализа надо использовать только потому, что они являются более современными. Зачастую по точности полученных результатов они уступают РИА-методам, а для определения ряда ключевых гормонов (АКТГ, альдостерон, ренин и др.) их не удалось адаптировать.
Биосенсорные методы
В настоящее время созданы сенсоры для определения пикограммовых количеств как для низкомолекулярных, так и высокомолекулярных гормонов. Для определения требуемого уровня специфичности в определении гормона в ряде случаев используются в сенсоре белки рецептора конкретного гормона. Это требует высокого уровня специалистов в области молекулярной биологии. В РФ созданы надежные сенсорные технологии быстрого определения сахара в крови, что разительно изменило ситуацию
в выявлении больных сахарным диабетом 2-го типа на ранних этапах его развития.
Методы тандем-масс-спектрометрии и их
возможности
Появление и развитие современной технологии масс-спектрометрии в тандеме с высокоразрешающим жидкостным хроматографом, обеспечивающее высокую производительность, практически 100% специфичность, необходимую чувствительность и воспроизводимость, открывает новую эру в биохимии стероидов. В отличие от прежнего технологически трудоемкого комплекса газовый хроматограф/масс-спектрометр (GCMS) современная тандем-масс-спектрометрия (MS/MS) не требует трудоемкой процедуры подготовки исследуемого биологического материала. При наличии подготовленного специалиста MS/MS может быть использован и уже используется в развитых странах для рутинной диагностики в эндокринологических лабораториях.
В качестве примера приведем современные возможности метода для анализа стероидных гормонов. Сравнительно недавно группа авторов из США опубликовала работу, в которой продемонстрировано, что технология MS/MS с использованием масс-спектрометра API-3000 обеспечивает возможность одновременного определения за 11 мин в 0,2 мл сыворотки 12 основных стероидных гормонов. Продемонстрирована высокая надежность метода. Технология MS/MS высокопроизводительна и экономична по сравнению с современными автоматическими анализаторами, которые требуют больших затрат на постоянное приобретение дополнительных расходных материалов (коммерческих наборов). В методе MS/MS расходные материалы сведены к минимуму. По всем указанным параметрам MS/MS — технология ближайшего будущего в гормональном анализе. Один подготовленный оператор может выполнять до 200 тестов в день. В настоящее время тандем MS/MS получает широкое распространение для рутинной диагностики в эндокринологических лабораториях и прежде всего для определения основного спектра стероидов С21, С19 и С18 ряда, а также их многочисленных метаболитов. Уже в настоящее время при выполнении скрининг-программ в развитых странах на выявление ВДКН у новорожденных с использованием в качестве маркера 17а-гидроксипрогестерона метод MS/MS (API-3000) незаменим. Он выступает в качестве «арбитра» при наличии ложноположи-тельных результатов, неизбежных при определении в кровяном пятне 17а-гидроксипрогестерона методом флюоресцентного иммуноанализа (Delfia). При скрининге на каждый истинный случай ВДКН приходится до 200 ложноположительных результатов, которые требуют внесения ясности с использованием MS/MS — ABI-3000.
Технология MS/MS может быть использована и уже используется для определения различных по химической структуре гормонов, включая ТТГ, свободный Т4, свободный Т3, метанефрины, эстрадиол и его метаболиты, а также ряд других гормонально-активных соединений.
Ошибки при использовании методов
гормонального анализа
Ошибки в процессе выполнения анализа могут произойти на трех его этапах: преаналитическом, аналитическом и постаналитическом. По данным мировой литературы, ошибки, возникающие на преаналитическом, внелабораторном этапе, достигают 90% от общего числа.
Преаналитический этап. На этапе получения образцов и доставки их в лабораторию необходимо знать и учитывать следующие биологические параметры: возраст пациентов, пол, биологический ритм для каждого гормона, фазу менструального цикла, срок беременности, диагностические и лечебные процедуры, прием лекарственных препаратов, соблюдение диеты, стрессорные ситуации до и во время взятия крови и ряд других.
Аналитический этап. Аналитический этап заключается в правильной организации работы в лаборатории, включая конструкцию помещения, соблюдение температурного режима (18—25оС). Абсолютным требованием к работе лаборатории является организация внутреннего и внешнего контроля качества, что позволяет обеспечить оптимальную работу диагностической лаборатории.
В последние 5 лет опубликована серия оригинальных работ, в которых доказана неадекватность определения в крови общей циркуляции эстрадио-ла, тестостерона и других стероидов прямыми неэкстракционными методами, включая практически все используемые автоматические анализаторы. Как правило, они принципиально завышают концентрацию гормона, что входит в противоречие с клиническими проявлениями заболевания.
Количественные параметры содержания общего эстрадиола определяемые любым современным методом иммуноанализа, не отвечают требованиям лабораторной диагностики и требуют разработки альтернативных подходов для определения свободной формы эстрадиола, чем сейчас занимается лаборатория гормонального анализа ЭНЦ.
Колебания в содержании тестостерона и эстра-диола при использовании различных тест-систем требуют продуманного выбора нужного метода, что в свою очередь определяется диагностической и/или научной клинической задачей и ожидаемым диапазоном содержания тестостерона и эстрадиола в биологическом материале.
Неудовлетворительные результаты определения общего тестостерона автоматизированными систе-
мами послужили основанием для разработки альтернативных технологий и прежде всего прямого и доступного метода определения свободной формы тестостерона как наиболее адекватного маркера ан-дрогенного статуса у мужчин и женщин.
Клеточные мембраны слюнных желез являются природными разделительными фильтрами, и в слюнной проток проникают соединения только с низкой молекулярной массой (<400 Д), к которым относятся и тестостерон, и все другие стероиды, не связанные с альбумином и специфическим глобулином. Концентрация жирорастворимых свободных стероидов, таких как тестостерон, не зависит от скорости выделения слюны и соответствует уровню несвязанной формы стероида в сыворотке крови.
В лаборатории ЭНЦ был отработан такой метод определения свободного тестостерона в слюне с использованием высокоразрешающей технологии люминесцентного иммуноанализа (фирма 1ВЬ, Гамбург, Германия). Высокая аналитическая (6,2 пмоль/л) и функциональная (17,3 пмоль/л) чувствительность позволяет количественно определять очень низкие (3—5 пг/мл) концентрации тестостерона в слюне, что особенно важно для диагностики андрогенного статуса у женщин и детей.
Отработан также метод прямого определения свободного тестостерона в сыворотке. Для этой цели был использован метод ультрафильтрации (УФ) с помощью разделительных фильтров Ашюоп иИга-4 («МИНроге») с порогом отсечения 30К-30,000
кмт.
Наши результаты сравнительного анализа определения свободного тестостерона с использованием технологий, отработанных в лаборатории гормонального анализа, и общепринятого расчетного метода, предложенного А. Уегшеи1еп и соавт., представлены в таблице.
Если при анализе результатов в качестве пограничного критерия норма/андрогенный дефицит использовать нижний предел референсных значений, то, по данным расчетного метода А. Уегшеи1еп, сниженная концентрация свободного тестостерона определялась в 15% случаев; по результатам определения в слюне — в 18% случаев, при определении общего тестостерона в сыворотке и свободного тестостерона в сыворотке с предварительной ультрафильтрацией — в 20 и 38% случаев. Иными словами
УФ-метод более чувствителен для диагностики ан-дрогенного дефицита.
Постаналитический этап. Полученные результаты проверяются и анализируются высококвалифицированным сотрудником лаборатории и поступают к врачам клиники или поликлиники. По данным зарубежных авторов, до 30—40% назначений для выполнения гормональных анализов не имеют оснований и могут дезинформировать врача в постановке диагноза. Для исключения таких ошибок необходимо тесное ежедневное взаимодействие сотрудников лаборатории и клиники при обсуждении и трактовке полученных результатов.
Определяющие факторы при выборе метода
анализа
Выбор метода анализа прежде всего зависит от аналитической характеристики метода. Основные из них следующие:
— чувствительность тест-системы, которая детерминирована аффинностью антител, а также технологической конструкцией системы и разрешающей способностью прибора при регистрации сигнала;
— диапазон определяемых концентраций соединений, который определяется калибровочной кривой;
— специфичность тест-системы, которая определяется процентом перекрестных реакций с близкородственными соединениями;
— степень линейности и процент открытия внесенного в пробу стандарта (она должна быть в пределах 90—104%);
— воспроизводимость получаемых результатов (допустимые значения — до 15% между постановками в разные дни);
— трудоемкость в проведении анализа;
— стоимость тест-системы (к сожалению, этот фактор часто доминирует). Как правило, низкая стоимость набора не может обеспечить необходимое качество, которое определяется сбалансированными вышеперечисленными параметрами.
В заключение необходимо отметить поступательное развитие эндокринологии как общебиологической науки за последние 50 лет. Успехи во многом определились достижениями в области фундаментальной науки — химии, физики и биологии. Клю-
Количественная характеристика (Ме, 10-90 процентилей) свободной формы тестостерона (Т) у взрослых мужчин в зависимости от метода определения
Метод Здоровые мужчины (25—52 года) Мужчины с андрогенным дефицитом (21—54 года)
Общий Т, нмоль/л 18,8 (12,4—26,1) 6,7 (1,2—10,8)
Свободный Т в крови (расчетный), пмоль/л 374 (225—544) 135 (9,3—215)
Свободный Т в слюне, пмоль/л 380 (270—544) 215 (55—250)
Свободный Т в крови (УФ-метод), пмоль/л 230 (110—370) 85 (12—197)
чевым моментом в развитии послужили работы о гуморальной природе передачи нервного сигнала и открытие биологическими методами активных соединений, выделяемых эндокринными железами. Ученые в разных странах буквально начали «атаку» по расшифровке их химической структуры. На этом этапе большую роль сыграли физико-химические методы в комбинации с биологическим тестированием выделенных гормонов. Параллельно шли работы по их синтезу, которые увенчались созданием целого ряда гормональных препаратов, обеспечивающих прогресс в клинической эндокринологии. Дальнейший прорыв в развитии эндокринологии обеспечило открытие в 1960 г. метода гормонального иммуноанализа, который обеспечил новые возможности определения гормонов в различных биологических средах в пикограммовых количествах, недоступные для клас-
сических физико-химических методов. Параллельно шло создание и развитие методологии и технологии методов молекулярной эндокринологии с генетикой, которые позволили расшифровать взаимодействие рецепторного аппарата тканей-мишеней с гормоном, идентифицировать генетический контроль этого ключевого процесса, а также установить структуру многих рецепторов и контролирующих генов. Появление более чувствительных методов определения гормонов и их широкая доступность открыли новые возможности в диагностике субклинических форм эндокринной патологии. Однако всегда необходимо помнить неизменное правило — окончательный диагноз определяется клиническими параметрами болезни, опытом и знаниями лечащего врача, а все используемые методы важны, но они имеют вспомогательный характер.
