Современные иммунохимические методы анализа Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

ОБЗОРЫ

А.И. жебентяев, Е.Н. Каткова

современные иммунохимические методы АНАЛИЗА

Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет

Рассмотрено состояние современных иммунохимических методов анализа: радиоиммунного, иммуноферментного, поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, иммунохроматографических, иммунофильтрационныых тест-методов. Описаны принципы реализации каждого метода, приведены примеры их использования, обсуждены достоинства и недостатки иммунохимических методов анализа и перспективы их развития.

Ключевые слова: иммунохимический анализ, радиоиммунный анализ, гетерогенный твердофазный иммуноферментный анализ, ферментно-мультиплицируе-мый иммунный тест, клонированный ферментно-донорный иммуноанализ, кинетическое взаимодействие микрочастиц в растворе, поляризационный флуоресцентный иммуноанализ, иммунохроматографические стрип-тесты, иммунофильтрацион-ные тесты.

ВВЕДЕНИЕ

Методы иммунохимического анализа основаны на применении высокоактивных специфичных меток - маркеров, позволяющих обнаружить продукт иммунной реакции непосредственно в биологической жидкости.

Иммунохимические методы анализа обладают высокой чувствительностью, специфичностью, используют минимальное количество биоматериала без предварительной пробоподготовки, позволяют получать объективные количественные результаты [1-6].

Классические методы иммунохимического анализа, в которых иммунная реакция обнаруживалась по визуальному изменению состояния реагентов (агглютинация, преципитация, пассивная агглютинация) либо по характерному изменению биообъектов, добавляемых к реакционной смеси для выявления протекания реакции (реакция связывания комплемента), имеют ряд недостатков: для визуальной регистрации аналитического сигнала реакции антиген-антитело (АГ-АТ) необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. Кроме того, результаты такого анализа не всегда могут быть однозначно интерпретированы [7,8].

Современные методы иммунохимического анализа, основанные на применении меченых реагентов, находят широкое применение для количественного определения биологически активных соединений разнообразной структуры - от низкомолекулярных гормонов до высокомолекулярных вирусов и целых клеток [8-10].

В таблице 1 приведена классификация современных методов иммунохимическо-го анализа.

РАДИОИММУННЫЙ АНАЛИЗ (RIA - RADIOIMMUNOASSAY)

Радиоиммунный метод анализа основан на конкурентном связывании определяемого вещества-антигена и меченого радиоактивной меткой антигена со специфическими антителами.

Концентрацию комплекса меченый АГ-АТ определяют посредством измерения радиоактивности. Для этого важно предварительно отделить комплекс от непрореагировавшего избытка меченого АГ

[7].

Концентрация комплекса меченый АГАТ тем выше, чем меньше концентрация определяемого АГ в пробе [9].

Среди большого числа изотопов наиболее подходящими радиохимическими свойствами для синтеза меченых АГ обладают изотопы 32P, 35S, 14C, 57Co, 125I. Чаще

Таблица 1 - Классификация основных иммунохимических методов анализа

Метод анализа Способ детектирования

Радиоиммунный анализ радиоактивность

Иммуноферментный анализ ферментативная активность

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ поляризация флуоресценции

Иммунохроматографический иммуноанализ, иммунофильтрационные тесты образование окрашенного комплекса в тест-зоне

Иммуносенсорные методы электрический сигнал

Рефрактометрический иммуноанализ преломление света

Металлоиммуноанализ атомные спектры поглощения

используют изотоп 1251. Он является чистым у-излучателем, а его препараты легко доступны и могут быть получены в виде веществ со 100%-ной изотопной чистотой

[7].

К достоинствам метода РИА можно отнести низкий предел обнаружения (методы РИА позволяют определять концентрации АГ до нескольких пикограммов в миллилитре), специфичность, малый объем образца, необходимый для анализа [10]. Метод РИА имеет преимущество перед другими технологиями при определении АГ в крови и тканях благодаря независимости получаемых результатов от матричных эффектов [9].

Вместе с тем, метод РИА обладает рядом недостатков. Ограниченный срок жизни радиоактивной метки (например, период полураспада изотопа 1251 составляет 60 суток) требует постоянной замены реактивов. Кроме того, существует возможность радиоактивного загрязнения окружающей среды при проведении большого числа анализов. Метод РИА требует высокой квалификации обслуживающего персона-

ла, так как необходимо соблюдать специальные меры предосторожности [7,9].

Трудности в использовании методов РИА побуждают к поиску альтернативных методов, сохраняющих высокую чувствительность и специфичность анализа.

ГЕТЕРОГЕННЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ELISA - ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)

К настоящему времени разработаны различные технологии иммуноферментно-го анализа, которые объединяет использование ферментов в качестве меток и возможность их детектирования с помощью соответствующих ферментных систем.

Сущность метода ELISA представлена на рисунке 1.

Связанные и не связанные с ферментной меткой (чаще - пероксидаза хрена) антигены вступают в конкурентное взаимодействие с антителами, иммобилизированными на твердом носителе. После инкубации избыток несвязавшихся компонентов отмывают и твердый носитель с иммунными

^ ( Р

субстрат \ / продукт

меченый ферментом АГ

сн^

высокая низкая

концентрация концентрация

АГ в пробе АГ в пробе

*

О б

комплекс комплекс

АГ-АТ меченый АГ-АТ

Рисунок 1 - Схема гетерогенного твердофазного иммуноферментного анализа

комплексами помещают в соответствующий субстрат (о-фенилендиамин) фермента. В результате ферментативной реакции в раствор выделяется продукт окисления о-фенилендиамина и раствор приобретает желтый цвет.

Чем больше определяемого АГ содержится в исследуемом объекте, тем меньше конъюгата АГ-фермент свяжется с антителами и тем меньше продукта ферментативной реакции образуется. Концентрация АГ в пробе обратно пропорциональна поглощению.

Поскольку метод является гетерогенным, то матричные эффекты при определении менее выражены.

Недостатки метода связаны с тем, что для гетерогенного анализа требуются специальные анализаторы. Другая проблема связана с использованием консервантов -азида или бензоата натрия, которые добавляют для сохранности проб мочи. Исполь-

зуемые консерванты блокируют активность фермента пероксидазы хрена, что не позволяет получать точные результаты анализа [9, 11-15].

ФЕРMЕHТHО-MУЛЬТИПЛИЦИРУЕMЫЙ ИMMУHHЫЙ ТЕСТ (EMIT - ENZYME MULTIPLIED IMMUNOTESTS) Меткой, присоединенной к АГ в фер-ментно-мультиплицируемом иммун-

ном тесте, является фермент глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, который окисляет субстрат глюкозо-6-фосфат до 6-фосфо-глюконолактона и также восстанавливает кофактор никотинамидадениндинукле-отидфосфат NADP+ до NADPH. Активность фермента подтверждается спектрофотометрически измерением продукции NADP+ (максимальное поглощение при 340 нм). Измерение поглощения связано с концентрацией АГ в биосубстрате (рисунок 2).

О.

-0^

высокий уровень превращения NADP+ в NADPH

высокая концентрация АГ в пробе

NADP+

низкий уровень превращения NADP+ в NADPH

низкая концентрация АГ в пробе

Рисунок 2 - Схема ферментно-мультиплицируемого иммунного теста

Преимущества данного гомогенного теста: длительный (более 1 года) срок хранения наборов, кроме того, количество связанного АГ может быть измерено без отделения свободного.

На результаты анализа могут влиять матричный эффект и кросс-реактивность. Так, например, определение ЛСД в больших концентрациях (больше пг/мл) дает ложноположительный результат; присутствие в моче метаболита аспирина салициловой кислоты приводит к ложноотрица-

тельному результату [9,16,17].

КЛОНИРОВАННЫЙ ФЕРMЕHТHО-ДОНОРНЫЙ ИMMУHОАHАЛИЗ (CEDIA - CLONED ENZYME DONOR IMMUNOSORBENT ASSAY)

В качестве ферментной метки в клонированном ферментно-донорном иммуноанализе используются обычно генноинженерные фрагменты Р-галактозидазы E.coli. Активность фермента проявляется при сочетании 2 фрагментов: ферментно-

донорного (ED) и ферментно-акцепторного (ЕА).

При ферментном гидролизе хлорфено-ловый красный-Р-галактозид расщепляется на хлорфеноловый красный и галактозу. Максимальное поглощение для хлорфено-лового красного наблюдается при Х= 570 нм.

Ферментно-донорный фрагмент связан с АГ и не реассоциирует, если нахо-

дится в комплексе с АТ. Определяемый АГ, содержащийся в пробе, вытесняет меченый АГ из АТ, происходит реассоциация ферментно-донорного и ферментно-акцепторного фрагментов фермента, в результате возрастает ферментативная активность и поглощение (рисунок 3). Концентрация АГ в биожидкости прямо пропорциональна изменению поглощения.

I. ЛГ в пробе отсутствует

GCPRG

_ - ^=:> ЛТ ЛТ с ED-меткой ЛТ

4- CPRG

/

г ________ СР^ ^ G

хлорфеноловый ► хлорфеноловый + галактоза

красный-Р-галактозит красный

II. АГ в пробе присутствует

с+Ч+о{

АТ в АТ АТ с ED-меткой

пробе

■=> С + О! I + “

Рисунок 3 - Схема клонированного ферментно-донорного иммуноанализа

CPRG

+

ЕЛ-фрагмант

фермента

+

CPRG В-галактозидаза

Технология CEDIA достаточно новая, имеющихся разработанных методик недостаточно. Кроме того, наблюдается большой процент ложноположительных результатов из-за влияния примесей в моче и матричного эффекта [9, 18,19].

КИНЕТИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКРОЧАСТИЦ В РАСТВОРЕ (KIMS - KINETIC INTERACTION OF MICROPARTICLES IN SOLUTION)

Для измерения исследуемых объектов

технология иммуноферментного анализа на микрочастицах использует раствор взвешенных латексных частиц размером меньше микрона. Частицы покрыты связанными молекулами, специфическими для измеряемого вещества. Активная зона поверхности микрочастиц увеличивает кинетику исследования и уменьшает время инкубации. Это позволяет выполнить исследование за меньшее время, чем при использовании других иммунологических методов.

В отсутствие определяемого АГ, конъюгат микрочастицы и молекулы АГ связывает несколько молекул антител, образуя крупные агрегаты, которые рассеивают направленный свет. Пока продолжается реакция агрегации, возрастает абсорбция. Добавленный АГ конкурирует за связь с микрочастицами и ингибирует таким образом образование агрегатов, что в свою очередь уменьшает поглощение пропорционально концентрации АГ.

Конъюгаты микрочастица-АГ более стабильны, чем конъюгат фермент-АГ. Недостаток метода связан с тем, что микрочастицы раствора, используемого в KIMS-тестах, могут покрывать части аппарата и требуют специального обслуживания [9,20].

ПОЛЯРИЗАЦИОННЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ (PFIA - POLARIZATION FLUORESCENCE IMMUNOASSAY)

Метод PFIA основан на конкурентном связывании анализируемого АГ и АГ, ме-

ченого флуоресцентной меткой (трейсера), со специфическими АТ.

На степень поляризации флуоресценции влияют различные факторы, основными из которых являются размер или масса флуоресцирующей частицы, температура и вязкость раствора. При постоянных температуре и вязкости раствора поляризация флуоресценции будет определяться только размером флуоресцирующей молекулы. Меченый флуоресцентной меткой АГ (трейсер) при возбуждении линейно-поляризованным светом будет флуоресцировать деполяризованным светом, так как молекулы трейсера в растворе ориентированы хаотично, обладают достаточно большой скоростью вращения, в результате поляризация флуоресценции свободного трейсе-ра в растворе имеет низкое значение. При связывании трейсера со специфическими АТ вращение иммунного комплекса значительно замедляется и возрастает степень поляризации флуоресценции (рисунок 4).

Таким образом, величина поляризации флуоресценции реакционной си-

I. Высокая концентрация АГ в пробе

*

с т

G

G

G

(•

G

но

*« qg. !> ЧВ с

G G Qf

флуоресцеин

соон

Низкая

поляризация

флуоресции

II. Низкая концентрация АГ в пробе

-CG°*Gf

' G Gf Ч О» Gf

G

ОН Gf

G

Высокая

поляризация

флуоресции

Gf

Рисунок 4 - Схема поляризационного флуоресцентного иммуноанализа

стемы отражает отношение связанной и свободной фракций трейсера и обратно пропорциональна концентрации анализируемого АГ. Чаще всего в качестве метки для PFIA используют флуоресцеин и его производные. АГ, меченый флуоресце-ином, более стабильный, чем конъюгат АГ-фермент.

Матричный эффект имеет меньшее влияние на изменение поляризации флуоресценции, чем на изменение прямой интенсивности света. Поэтому технологии PFIA при определении наркотических веществ в крови или образцах мочи, хранившихся в течение нескольких дней, являются более точными, чем технологии иммуноферментного анализа. Ложноположительные результаты могут быть обусловлены флуоресценцией солей желчи [9, 21-24].

ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ СТРИП-ТЕСТЫ (IMMUNOCHROMA TOGRAPHIC STRIP TESTS) Перспективным вариантом иммуноанализа является иммунохроматография (стрип-тест). Метод основан на протекании иммунной реакции АГ-АТ при движении тестируемого образца жидкости по полоске за счет капиллярных сил и визуальной детекции окрашенных зон в различных участках полосок с иммобилизованными реагентами.

На верхний участок тест-полоски в

тест-зоне иммобилизуют конъюгат АГ с белком-носителем, в контрольной зоне иммобилизуют антивидовые АТ. На нижний участок тест-полоски сорбируют конъюгат специфических АТ на определяемый АГ с меткой. При погружении тест-полоски в пробу жидкость начинает подниматься под действием капиллярных сил по полоске. Формирование на тест-полоске одной окрашенной зоны свидетельствует о положительном результате анализа (рисунок 5).

Для иммунохроматографических тест-полосок в качестве меток используются ферменты или окрашенные мелкодисперсные вещества (например, коллоидное золото). Для детекции ферментной метки необходимо дополнительно добавлять раствор субстрата, при этом определение метки коллоидного золота происходит визуально без дополнительной обработки [9, 25-28].

ИMMУHОФИЛЬTРAЦИОHHЫE METОДЫ (JFA - JMMUNOFJLTRATJON ASSAY)

Традиционные иммунофильтрацион-ные тест-методы основаны на использовании полимерных мембран с привитыми специфическими антителами. Мембрану помещают на слой адсорбента, поглощающий проходящую через мембрану жидкость. При прохождении анализируемого раствора сквозь мембрану присутствующий в растворе АГ образует иммунокомплекс с антителами, нанесенными на тест-зону мембраны. Затем добавляют раствор

Зона ввода пробы

Тест-зона

Контрольная

зона

Меченые АТ

Антивидовые АТ

АГ в пробе

Фиксированный АГ

Рисунок 5 - Схема иммунохроматографического теста

S6

конъюгата АГ-фермент, вводят хромогенный субстрат, который в присутствии ферментных меток вызывает развитие окраски.

Иммунофильтрационные тесты с использованием мембран имеют такие достоинства, как простота и экспрессность (время анализа составляет 5-25 мин), однако они не всегда обеспечивают достаточную чувствительность. Помимо этого, на получаемые результаты часто влияет матричный эффект образца [28, 29].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Иммунохимические методы анализа являются удобным инструментом для первичного скрининга больших партий образцов, содержащих токсические вещества, благодаря своей простоте, экспрессности и относительно невысокой стоимости. В настоящее время основными направлениями в совершенствовании методов иммуноанализа являются сокращение метода проведения анализа, возможность проведения анализа вне лаборатории, удешевление метода, миниатюризация анализа, автоматизация определения, возможность одновременного определения нескольких аналитов.

SUMMARY

A.I. Zhebentyaev, E.N. Katkova MODERN IMMUNOCHEMICAL METHODS OF ANALYSIS

The state of modern immunochemical methods of analysis: radioimmunoassay, enzyme immunoassay, polarization fluorescence immunoassay, immunochromatographic, im-munofiltrational tests is considered. The principles of the implementation of each method, and examples of their use, the advantages and disadvantages of immunochemical methods of analysis and their prospects of development are described and discussed.

Keywords: immunochemical analysis, radioimmunoassay, enzyme linked immunosorbent assay, enzyme multiplied immunoassay, cloned enzyme donor immunosorbent assay, kinetic interaction of microparticles in solution, polarization fluorescence immunoassay, immunochromatographic strip tests, immuno-filtrational tests.

Научные публикации ЛИТЕРАТУРА

1. Darwish, I. Immunoassay methods and their applications in pharmaceutical analysis: basic methodology and recent advances / I. Darwish // International journal of biomedical science. - September 2006. - Vol. 2, № 3. - P. 217-235.

2. Immunoassay technologies for drugs of abuse testing / Pouliopoulos A. [et all] // Aristotle university medical journal. - 2007.

- Vol. 34, Issue 2. - P. 19-24.

3. Koivunen, M.E. Principles of immunochemical techniques used in clinical laboratories / M.E. Koivunen, R.L. Krogsrud // Lab-medicine. - 2006. - Vol.37, № 8. - P. 490-497.

4. Labat, L. Immunoanalysis and toxicology / L. Labat, M. Deveaux // Annales toxicology Analytique. - 2009. - Vol. 21, № 1.

- P.1-2.

5. Twyman, R.M. Immunoassays, applications: Clinical. In: Worsfold P., Townshend A, Poole C. Encyclopedia of Analytical Science (2nd edn). - Elsevier Science, London, 2005. - Vol. 4. - P. 317-324.

6. Twyman, R.M. Immunoassays: Overview. In: Worsfold P., Townshend A, Poole C. Encyclopedia of Analytical Science (2nd edn).

- Elsevier Science, London, 2005. - Vol. 4. -P. 299-306.

7. Отто, М. Современные методы аналитической химии. 3-е издание / М. Отто.

- Москва: Техносфера, 2008. - 544 с.

8. Ройт, А. Иммунология. Пер. с англ. / А.Ройт, Дж. Бростофф, Д.Мейл. - М.: Мир, 2000. - 592 с.

9. Токсикологическая химия: метаболизм и анализ токсикантов / Под ред. проф. НИ. Калетиной. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 1008 с.

10. Токсикологическая химия / Под ред. проф. Т.В. Плетеневой. - М: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 512 с.

11. Garber, E. Detection of melamine using commercial enzyme linked immunosorbent assay technology / E. Garber // Journal of food protection. - 2008. - Vol. 71, № 3. - P. 590-594.

12. Amphetamines in hair by enzyme linked immunosorbent assay / Sweeney S.A. [et all] // Journal of analytical toxicology. -1998. - Vol. 22. - P. 418-424.

13. Specific, sensitive and quantitative enzyme linked immunosorbent assay for hu-

man immunoglobulin G antibodies to anthrax toxin protective antigen / Quinn C. [et all] // Emerging infections disease. - 2002. - Vol. 8, № 10. - P. 1103-1110.

14. Enzyme linked immunosorbent assay screening then indirect immunofluorescence conformation of antinuclear antibodies / Cop-ple S.S. [et all] // American society for clinical pathology. - 2011. - Vol. 135. - P. 678-684.

15. Development of an enzyme linked immunosorbent assay for direct determinations of anticancer drug vitamin K3 in serum / Sakamoto S. [et all] // Journal of health science. - 2008. - Vol. 54, № 4. - P. 508-511.

16. Applications of EMIT d.a.u. for the Semiquantitative screaning of methamphet-amine incorporated in hair/ Miki A. [et all] / Journal of analytical toxicology. - 2002. -Vol. 26. - P. 274-279.

17. Cocaine and opiate use in pregnancy: detections of drugs in neonatal meconium and urine / Lopez P. [et all] // Journal of analytical toxicology. - 2009. - Vol. 33. - P. 351-355.

18. Cloned enzyme donor immunoassay (CEDIA) for drugs-of-abuse screening / Armbruster D. [et all] // Drug monitoring and toxicology. - 1995. - Vol. 41, № 1. - P. 92-98.

19. Modeling of homogeneous cloned enzyme donor immunoassay / Jeon S.I. [et all] // Analytical biochemistry. - 2004. - Vol. 33, №

3. - P. 136-147.

20. Microkinetic exclusion assay for cadmium analysis / Aota A. [et all] // 16th International conference on miniaturized systems for chemistry and life sciences, Okinawa, Japan.

- 2012. - P. 1990-1992.

21. Eremin, S.A. Fluorescence polarizations immunoassays for determination of pesticides and biologically active compounds in food safety and environmental monitoring /

S.A. Eremin // Food technology and biotechnology. - 1998. - Vol. 36, № 3. - P. 235-243.

22. Cross-reactivity of stimulations found in sports drug testing by two fluorescence polarizations immunoassay / R. Torre [et all] // Journal of analytical toxicology. - 1996. -Vol. 20. - P. 165-170.

23. Maragos, C. Fluorescence polarization immunoassay of mycotoxins: a review / C. Maragos // Toxins. - 2009. - № 1. - P. 196-207.

24. New fluorescence polarization immunoassays for analysis of barbiturates and benzodiazepines in serum and urine: performance characteristics / Schwenzer K.S. [et all] // Journal of analytical toxicology. - 2000.

- Vol. 24. - P. 726-732.

25. Lateral flow immunochromatograph-ic assay for sensitive pesticide detection by using Fe3O4 nanoparticle aggregates as color reagents / Liu C. [et all] // Americal chemical society. - 2011. - Vol. 83. - P. 6778-6784.

26. Development of rapid one-step im-munochromatographic assay / Paek S. [et all] // Methods. - 2000. - Vol. 22. - P. 53-60.

27. Development of three-step consolidating microchip for therapeutic drug monitoring / Sugiura K. [et all] // 14th International Conference on miniaturized systems for chemistry and life sciences, Groningen, the Netherlands. - 2010. - P. 806-808.

28. Иммунохимические методы определения микотоксинов / И.Ю. Горячева [и др.] // Журнал аналитической химии. -2009. - Т. 64, № 8. - С. 788-806.

29. Enzyme linked immunofiltration assay used in the screening of solid supports and immunoreagents for the development of an azinphos-methyl flow immunosensor / Sardinha J.P.M. [et all] // Journal of immunological methods. - 2002. - Vol. 26. - P. 173-182.

Адрес для корреспонденции:

210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27,

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра токсикологической и аналитической химии, тел. раб. 8(0212) 37-00-06,

Жебентяев А.И.

Поступила 26.03.2013 г.