CC BY
103
УДК 547.498
СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ АЗИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ В МЕДИЦИНЕ И БИОЛОГИИ
С.П. АШИХМИН, О.Б. ЖДАНОВА, О.О. ЗАЙЦЕВА, А.Г. МЕШАНДИН*
Введение. В настоящее время современными аспектами медицины и биологии помимо сохранения гельминтов в качестве музейных препаратов, является необходимым и сохранение различных тканей, изъятых из трупов животных и человека, как для проведения дальнейших исследований с диагностической целью, так и для демонстрации изменений в пораженных паразитами органов, используемых в учебном процессе ВУЗов и колледжей. Крайне актуальна фиксация паразитов, полученных при полном гельминтологическом вскрытии диких животных. Учитывая, что их гельминтофауна изучена мало, а на местах убоя и осмотра редко бывает возможность определения вида гельминта, следует в короткие сроки и на длительное время обеспечить сохранение идентификационных признаков данных организмов.
Известно, что после наступления биологической смерти начинаются естественные процессы разложения мягких тканей, которые протекают по типу ранних и поздних трупных изменений. На протяжении всего XIX века было предложено множество различных способов, основанных на бальзамировании сулемой, мышьяком, хлористым цинком, глицерином, карболовой кислотой и, наконец, формалином, который быстро завоевал известность и получил всеобщее признание. Применяемые в настоящее время растворы для фиксации в своем составе имеют формалин в различных концентрациях, который обладает сильной бактерицидной способностью, дубящим эффектом, относительной дешевизной, удобством хранения и транспортировки. Наряду с перечисленными преимуществами формалин имеет и ряд недостатков: угнетает обмен веществ, в первую очередь витамина С и инактивирует ферменты в органах и тканях человека, работающего с данным раствором; летуч, имеет резкий запах, пары которого вызывают раздражение слизистых оболочек, сухость при непосредственном контакте с ним в практике; обладает мутагенным свойством; биологические объекты, зафиксированные формалином, теряют подвижность и эластичность, меняют прижизненную окраску из-за перехода гемоглобина крови в метгемогло-бин; при длительном хранении в растворе, содержащем один формалин, органы покрываются плесенью; токсичен; формалин следует хранить в защищающих от света коричневых склянках и при температуре не ниже 9°, иначе постепенно образуется белый осадок. Через 6 часов после погружения органа в формальдегид-ный раствор возникает изменение окраски тканей, так как гемоглобин крови переходит в метгемоглобин, вследствие чего прижизненный цвет органа становится грязно-бурым, кроме того ткани трупов, зафиксированные формалином, теряют свою подвижность и эластичность, трупы от 1°-15% раствора формалина быстро сохнут и мумифицируются.
Согласно руководству Р 2.2.2°°6 - °5 «По гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда», разработанному ГУ НИИ медицины труда РАМН при участии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека формальдегид относится к веществам с остронаправленным механизмом действия, а также к высоко опасным аллергенам и веществам раздражающего действия, опасным для репродуктивного здоровья человека (СанПиН 2.2.0.555 - 96. Класс опасности - 2, ПДК - °,5 мг/м3).
Помимо формалина применяются:
1. Спирт этиловый (С2Н5ОН) легко проникает в ткани, фиксирует и консервирует их с меньшим уплотнением и обесцвечиванием, нежели формалин, однако, спирт относится к дорогостоящим консервантам и сохраняет цвет недостаточно долго.
2. Метиловый алкоголь (СН3ОН) - 1°-7°% сильно обесцвечивает и сморщивает ткани, едок и токсичен.
3. Глицерин - вязкая гигроскопическая жидкость сладковатого вкуса. Глицерин сам по себе не является бактерицидным средством и не имеет консервирующих качеств, но увеличивает способность др. химических веществ убивать бактерии и является носителем химических веществ, сохраняет влагу в тканях.
* ГОУ ВПО «Кировская госмедакадемия», 610027, Киров, Россия, УЛ. К. Маркса, 112, e-mail: ivc@kirovgma.ru, Тел. (8332) 37-20-19
4. Глутаральдегид, изобретенный в начале 1950-х годов, применяется в виде 2,5% водный прозрачный раствор с мягким запахом. Обладает бактерицидным и дубящим действием, также антисептическими и дезинфицирующими свойствами, способен удалять меньшее количество жидкости из тканей при химической реакции с белками организма.
5. Тимол, хлористый цинк и сулема (Н§СЬ) (1% раствор) имеют сильное бактерицидное свойство, но придают неестественный цвет тканям, токсичны.
6. Карболовая кислота, или фенол (до 1%), имеет слабое бактерицидное свойство, оказывает дубящее действие, токсична.
7. Уксуснокислый калий (натрий) 3-10% раствор умеренно токсичен, имеет слабое бактерицидное свойство, действие на ткани - гигроскопическое.
8. Перекись водорода (Н2О2) - 5% раствор обесцвечивает ткани, токсична, вызывает ожоги, обладает сильным бактерицидным свойством.
9. Уксусная кислота 10% восстанавливает естественный цвет ткани, имеет сильное бактерицидное свойство.
10. Ацетон (до 50% раствора) обладает умеренным бактерицидным действием, токсичен, сморщивает ткани.
11. Хлорамин (5%) не сморщивает ткани, не обладает запахом, но плохо сохраняет ткани в летнее время.
12. Соли тяжелых металлов (Си, Н§) вызывают коагуляцию белков клетки.
13. Тромболитик СОМРЬиСДЭ полностью исключает применение формалина, превосходит по своим действиям его 10%-ный раствор, повышает качество биологического материала, является экологически чистым продуктом, но является чрезвычайно дорогостоящим консервантом и не может быть использован на данном этапе в паразитологических музеях.
Цель исследования - разработать новые способы консервации биологического материала для медицинских и биологических исследований.
Материал и методы. В работе использован трупный секционный материал человеческих органов - печени, сердца, легких, почек (всего исследованных единиц 1440), консервирующие растворы (2 варианта), мыши лабораторные белые (15 особей) -опыт №1, крысы лабораторные белые (20 особей) - опыт №2, стандартные микробиологические питательные среды (Эндо, Плоскирева, ЖСА, МПА) и культуры кишечной палочки, протея, стафилококка золотистого. Для проведения исследования применены следующие методы: фиксация биообъектов в консервирующих растворах с последующим описанием их макроструктуры через каждые 30 суток, определение наличия или отсутствия роста микроорганизмов в консерванте и на образцах на протяжении всего срока фиксации (550 суток), исследование на опытных животных токсичности (летучести) консервирующих растворов, гистологическое описание органов экспериментальных особей.
Материалы исследования (всего 4145), статистически обработаны. Различия результатов считали достоверными при р<0,05. В целом проведено 1269 экспериментов по изучению консервирующих свойств растворов азида натрия.
Собственные результаты. В результате проведенных исследований установлено, что азидные производные обладают достаточными антибактериальными и консервирующими свойствами (приоритетная справка на патент «Фиксатор биологического материала» №2006103522/15 (003850) от 06.02.2006 г.). В растворе азид натрия прозрачный. Он может храниться и транспортироваться и в сухом виде, в пластиковой, полиэтиленовой или стеклянной таре без температурных ограничений. Температура разложения сухого азида натрия 2750 - 3300С без плавления, молекулярная масса 65, 01, плотность сухого вещества 1, 8460 г/м3.
Таблица 1
Сравнительный анализ экономической составляющей некоторых консервирующих растворов
Фиксаторы Стоимость 1 л в руб.
глицерин 180
спирт 7°° 50
формалин 37% 32,2
раствор °,3% азида натрия 2,4
Его формула проста: Ка - N = N = К-. Растворы азидных производных не летучи, при контакте с кожей рук не оказывают
дубящего эффекта, в отличие от формалина. Азидные производные экономически выгоднее в несколько раз применяемых в настоящее время консервирующих растворов (табл. 1).
Сохранение биологических образцов осуществлялось следующим образом: фиксировался трупный секционный материал органов человека и животных (не позднее суток после наступления смерти), в которых обнаружены паразиты (печень, почка, сердце, легкое). При консервации использовались следующие растворы: физиологический раствор с содержанием азидных производных в процентном содержании 0,3% и 0,5% (при фиксации крупных органов). Способ изготовления анатомических препаратов для длительного пользования и среда для их хранения предусматривал следующие этапы работы: забранные кусочки органов или целые органы после промывания под проточной холодной водой сразу помещались в физиологический раствор с содержанием азидных производных (0,3% и 0,5%); тщательная промывка органа через питающую артерию раствором глицерина 1:1000 в объеме 1:5-10 по отношению к объему органа; последующая наливка через этот же сосуд органа раствором азида натрия в физиологическом разбавлении; фиксация в консерванте того же состава минимум 7-10 суток; препаровка органа (изготовление наглядного фрагмента).
При оценке демонстративности будущего препарата учитывались изменения консистенции, прочности и цвета тканей, рост микроорганизмов в консерванте. В результате эксперимента на протяжении 18 месяцев органы в физрастворе с азидными производными сохраняют прижизненную окраску, форму и консистенцию, а консервирующий раствор остается прозрачным и в первоначальном объеме. Испытание на токсичность (летучесть) консервирующих растворов азида натрия и формалина изучали на 15 лабораторных мышах и 20 крысах в двух опытах.
В опыте №1 наблюдали здоровых мышей обоего пола массой 19-21 г, на которых ранее не проводили никаких испытаний согласно методике ХІ-ой ГФ (1990). За 24 часа до эксперимента и во время его проведения животные находились в помещении с постоянной температурой (20-210С). Каждую серию препарата испытывали на 5 мышах: опытная группа животных №1 находилась под воздействием паров 10% формалина, другая опытная группа животных №2 - под воздействием 0, 5% солевого раствора азида натрия, а контрольная группа животных - под воздействием дистиллированной воды.
Опытный раствор №1 - 10% раствор формалина объемом 100 мл, опытный раствор №2 - 0,5% солевой раствор азида натрия объемом 100 мл, контрольный раствор - дистиллированная вода объемом 100 мл. Срок наблюдения за животными после изоляции их в переносную камеру, площадью 100x60x20 см составил 5 суток, что примерно соответствует 120 - часовому временному интервалу взаимодействия студентов и персонала мед ВУЗов с парами формалина в течение учебного года. Ежедневно оценивали поведенческие реакции, наличие или отсутствие анорексии, цвет кожи, лишенной волосяного покрова, выпадение и изменение цвета шерсти. По окончанию опыта были проведены эвтаназия (парами эфира) и забор органов (печень, почка, сердце, легкое) для гистологического исследования. Причем шерсть и внутренние органы опытной группы животных №1 издавали резкий запах формалина, у всех особей печень и почки отличались более бледной окраской, чем прижизненная, и «дряблой» консистенции. Одновременно наблюдалось массивное выпадение пожелтевшей шерсти сразу после эвтаназии у мышей, находившихся под влиянием паров формалина.
Органы опытной группы №2 и контрольных особей имели первоначальный прижизненный цвет, выпадения шерсти у них не было, при этом запах какого-либо химического вещества отсутствовал.
Данные, полученные при исследовании опытного раствора №1, говорят о том, что 10% раствор формалина оказывает токсическое воздействие на состояние животных, снижает иммунный ответ, что ведет к возникновению вторичной инфекции, вызывает анорексию с изменением массы тела, что характерно для токсичности (летучести). На следующем этапе мы предприняли гистологическое исследование и составили описание структуры органов после действия консервантов (табл..2).
Еще две серии экспериментов нам удалось произвести на здоровых белых крысах обоего пола массой 150-170 г, на которых ранее не проводили никаких испытаний согласно методике ГФ XI (1990). За 24 часа до эксперимента и во время его проведения животные находились в помещении с постоянной температурой (20-210С). Каждую серию препарата испытывали на 10 крысах: опытная группа находилась под воздействием паров 10% формалина, контрольная группа животных - под влиянием нелетучего 0,5% солевого раствора азида натрия.
Таблица 2
Перечень патологических процессов в органах мышей, установленный при микроскопическом исследовании после 5-дневного взаимодействия животных с растворами 10% формалина, 0,5% азида натрия и дистиллированной воды
Группа Органы Патологические изменения
Опытная №1 почка Тотальная белковая дистрофия и очаговый некробиоз эпителия канальцев
легкое Очаговая интерстициальная пневмония, острый бронхит, васкулит
печень Холестаз, гепатит, очаговый гепатоз
сердце Атрофия кардиомиоцитов и отек межмы-шечных пространств
Опытная №2 почка Отсутствуют
легкое Отсутствуют
печень Отсутствуют
сердце Отсутствуют
Контрольная почка Отсутствуют
легкое Отсутствуют
печень Отсутствуют
сердце Отсутствуют
Опытный раствор - 10% раствор формалина объемом 250 мл, контрольный раствор - 0,5% солевой раствор азида натрия объемом тоже 250 мл. Срок наблюдения за животными после изоляции их в переносную камеру, площадью 100x60x20 см составил 30 дней с экспозицией по 4 часа в сутки (итого 120 часов). По окончанию предпринятого эксперимента были проведены эвтаназия (парами эфира) и забор органов (печень, почка, сердце, легкое) для гистологического исследования. Шерсть и внутренние органы опытной группы животных имели резкий запах формалина, у всех особей печень и почки имели окраску бледнее прижизненной и «дряблую» консистенцию. Наблюдалось массивное выпадение пожелтевшей шерсти сразу после эвтаназии крыс, находившихся под влиянием паров формалина. Органы контрольной группы особей никак не реагировали на присутствие 0,5% раствора азида натрия, они имели прижизненный цвет, у крыс выпадение шести не происходило, запах каким -либо химическим веществом отсутствовал (табл.2).
Таблица 3
Результаты количественного учета роста стандартной культуры кишечной палочки на среду Эндо
Таким образом, есть основания подтвердить токсическое воздействие 10% раствора формалина на общее состояние животных опытной группы. Выраженные явления анорексии и изменение окраски шерсти и агрессивность поведения свидетельствуют о развитии токсичности у лабораторных животных в
Разведе- ния культур 102 103 104 105 106 101 108 109
0,05% азид натрия нет роста 3 19 104 418 БКМИКНС СР СР
0,5% азид натрия нет роста нет роста нет роста нет роста Нет роста 2 1 22
сте- риль- ный физра- створ 3* 45* 413* БКМИКНС* БКМИКНС* СР* СР* СР*
Примечание: * - различие в количестве выросших колоний на стерильном физрастворе от растворов 0,05% и 0,5% азида натрия достоверно ( р<0,05). БКМИКНС - большое число мелких изолированных колоний, не поддающихся счету; СР - сплошной рост.
эксперименте. Фактом служит еще и то, что объем опытного 10% раствора формалина за период эксперимента уменьшился со 250 до 100 мл (испарился), а объем контрольного 0,5% раствора азида натрия остался прежним (250 мл). На основании изучения влияния растворов азидных производных и паров формалина на биоорганизм в эксперименте на животных нами достоверно доказано, что предлагаемый солевой раствор азида натрия не оказывает токсического респираторного воздействия на животных, так как является не летучим, в отличие от токсичного раствора формальдегида (формалина). При проведении микробиологического анализа подтверждено, что антибактериальные свойства выражены в меньшей степени у 0,05% раствора азида натрия, чем у его растворов с большим процентным содержанием, а достоверность (p<0,05) количества выросших колоний кишечной палочки на стерильном физрастворе в отличие от таковых на растворах азида натрия наблюдалась уже через сутки (табл. 3). В качестве жидкой фазы питательных сред использовали 0,3% и 0,5% солевые растворы азида натрия. Чашки с посевами помещали в термостат при температуре 370С на 144 часа. Учет числа выросших колоний вели ежедневно (всего 320 подобных опытов).
Аналогичные данные присутствуют при посевах протея на среды Плоскирева и МПА, и золотистого стафилококка на ЖСА. Мы полагаем, что выраженные антибактериальные свойства азидных производных обусловлены способностью ингибировать ферментную активность протеаз не только клеток консервируемых объектов для предотвращения аутолиза, но и ферментных систем микроорганизмов для предупреждения бактериальной инвазии. С химических позиций противомикробное действие формалина объясняется тем, что он присоединяется к концевым аминогруппам белков и вызывает их денатурацию. Белок становится чужеродным по отношению к данному организму. Таким образом, сравниваемые консервирующие растворы обладают выраженными антибактериальными свойствами, при этом различно взаимодействуя с белковыми структурами клеток.
Выводы. Растворы азидных производных обладают достаточными консервирующими способностями и антибактериальной активностью, позволяющей использовать данный химический продукт в музейных и лабораторных целях. При изучении токсического влияния азида натрия выявлено отсутствие летучести препарата, что является основой для значительного уменьшения вредных производственных факторов на организм персонала, участвующем в процессе изготовления консервирующих растворов. В результате исследований установлены оптимальные сроки хранения биоматериала, составляющие 18 месяцев. В эксперименте доказана экономическая эффективность использования предложенного консерванта в сравнении с имеющимися аналогами, применяемыми в настоящее время.
MODERN ASPECTS USING OF AZID DERIVATIONS IN MEDICINE AND BIOLOGY
S.P. ASHIKMIN, O.V. ZHDANIVA, O.O. ZA’TSEVA, A.G. MESHANDIN Summary
Currently, there are various solutions and preparations for conservation of biological materials. They have many side effects such as toxic influence upon the organisms of personnel, insufficient quality of storage of biological objects, frequent replacement of their components and high economic expenditures of state institutions. This area of medical biology is perspective and has obvious topicality.
Key words: conservation of biological materials
Литература
1. Ашихмин С.П. и др. // Мат-лы 3-ей Всерос. научно-метод. конф.- Воронеж, 2007.- С. 64-65.
2. Воробьев А.А. // Вест. РАМН.- 2000.- № 11.- С. 11-14.
5. Воробьев В.П. // Ж. rEO\GEO.- 2003.- № 10.- С. 100-139.
4. Зайцева О.О. и др. // Морфологические ведомости.- Москва - Берлин, 2006.- № 1-2.- С. 98-100.
5. Зайцева О.О. и др. // Успехи современного естествознания.- 2007.- № 1.- С. 65.
6. ЗеленинЮ.В. // Провизор.- 2006.- № 3.- С. 36-38.
7. Пальцев М.А. и др. // Руководство по биопсийносекционному курсу.- М., 2002.- 256 с.
8. Платонов В.А. и др. // Мат-лы VI Респ. научно-практ. конф.- Йошкар-Ола, 2006.- С. 57-58.
9. Поздеев О.К. ./ Мед. микробиология.- М., 2005.- 768 с.
10. Халепо А.И. и др. // Рук-во по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса.- М., 2005.- 30 с.
УДК 616.314.14/. 18-007:616-018.2-007.17]-053.2(571.651)
ВЛИЯНИЕ КЛИМАТОГЕОГРАФИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ СЕВЕРА НА ПОКАЗАТЕЛИ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ И СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ ЗУБОЧЕЛЮСТНЫХ АНОМАЛИЙ, ПАТОЛОГИИ ТВЕРДЫХ ТКАНЕЙ ЗУБОВ И ТКАНЕЙ ПАРОДОНТА У ДЕТЕЙ С ДИСПЛАЗИЕЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
И.А. КУПРИЯНОВ, О.Н. КУПРИЯНОВА, О.Н. ПЕТЬКО, В.В. ПЕТЬКО*
Изучены зубочелюстные аномалии, состояние твердых тканей зубов и тканей пародонта у детей с дисплазией соединительной ткани (ДСТ) в условиях Севера. В группе больных с ДСТ г. Ленска выявлены зубочелюстные аномалии, обусловливающие истинное прогнатическое соотношение челюстей, скученность и мезиальное положение зубов, сужение и деформации зубных рядов.
В формировании здоровья детей и подростков приоритетное влияние оказывают климатогеографические условия. У Республики Саха (Якутия) 40% территории находится за полярным кругом, в зоне вечной мерзлоты, имеющей резкоконтинентальный климат. Влияние экологических и медикогеографических факторов на состояние челюстно-лицевой области у детей двояко, с одной стороны - опосредованное влияние на общее состояние организма и снижение его резистентности, с другой стороны - оказание раздражающего действия метеорологических условий, свойственных для данной местности, при непосредственном контакте с кожей и слизистыми оболочками полости рта [2,4,7]. В последнее время особое внимание врачей различных медицинских специальностей привлекает дисплазия соединительной ткани (ДСТ), которая часто проявляется поражением челюстно-лицевой области (ЧЛО) [1]. Имеются данные о высокой распространенности при дисплазии соединительной ткани зубочелюстных аномалий (ЗЧА), кариеса зубов, заболеваний пародонта, височно-нижнечелюстного сустава (ВНЧС) [3,5,6]. Наличие «неполноценной» соединительной ткани снижает способность организма к адаптации при воздействии на него средо-вых факторов. Неблагоприятное влияние социальноклиматических условий Севера усугубляет развитие диспласти-ко-обусловленных патологических изменений в ЧЛО у больных с ДСТ. В этой связи представляются необходимыми исследования системы соединительной ткани, определяющей морфологическую и функциональную целостность организма, у детей с ДСТ в условиях Севера, и разработка на этой основе методов профилактики и лечения заболеваний ЧЛО.
Цель исследования - выявление морфологических изменений лицевого черепа и зубных рядов, кариеса, некариозных поражений твердых тканей зубов, заболеваний пародонта у детей с ДСТ, живущих в разных климатогеографических условиях, влияющих на планирование методов профилактики и лечения обследованного контингента.
Предметом исследования явились 2 группы больных (п=452) с ДСТ: 1 группа (основная) - дети с ДСТ в возрасте 6-15 лет (п=241) г. Ленск (Республика Саха), 2 группа (контрольная) -больные с ДСТ в возрасте 6-15 лет (п=211) г. Новосибирск.
Для оценки состояния зубочелюстно-лицевой системы применяли обследование, включавшее клинические методы исследования - сбор жалоб, анамнез заболевания, анамнез жизни, осмотр, оценку прикуса, состояния тканей пародонта, биометрическое исследование зубов и зубных рядов, оценку состояния твердых тканей зубов. Исследование соответствия величины зубов и ширины зубных рядов проводили по методу Пона (1907), основанного на зависимости между суммой мезиодистальных размеров 4 верхних резцов и расстоянием между первыми премо-лярами и первыми молярами на верхней и нижней челюстях.
* Новосибирский государственный медицинский университет. 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52 тел./факс 3832222286
