Современные аспекты диагностики Clostridium estertheticum как специфического микроорганизма порчи мяса в вакуумной упаковке Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

Ветеринарный врач. 2022 . № 5 . С. 30-40 ^e veterinarian. 2022; (4): 30 - 40.

Научная статья

УДК 619:612.392.81:637.5.037:579.832/.833:637.065:637.075

DOI 10.33632/1998-698Х_2022_5_30

Современные аспекты диагностики Clostridium estertheticum как специфического микроорганизма порчи мяса в вакуумной упаковке

Александр Сергеевич Мазуров1, Ирина Николаевна Матвеева2,

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, г/о Лосино-Петровский, Московской обл., vnitibp@mail.ru 1kypck_m.a.c@mail.ru 2biolog1967@mail.ru

Автор, ответственный за переписку: Александр Сергеевич Мазуров, kypck_m.a.c@mail.ru

Аннотация. Clostridium estertheticum-это психротолерантные, грамположительные, облигатные, подвижные, анаэробные, спорообразующие, палочковидные бактерии вызывающие вздутие вакуумной упаковки мяса (BPS). Порча продукта происходит при хранении без нарушения температурных режимов и целостности. Предположительно, источниками контаминации являются: почва, оборудование цеха по убою скота и шкура животного. В течение последних 30 лет, в некоторых странах обнаруживают BPS, вызванное Cl. estertheticum. Несмотря на то, что этот микроорганизм напрямую влияет на убытки связанные с порчей, его исследованиям сопутствуют многочисленные затруднения. К ним относятся отсутствие или слабый рост в лабораторных средах, длительные периоды культивирования и непредсказуемая изоляция. Эти факторы препятствуют обнаружению Cl. estertheticum, что еще больше подрывает усилия по предотвращению возникновения BPS. Тем не менее, произошли значительные изменения в отношении способов детекции. Многие учёные разрабатывают различные методы обнаружения, исключая культивирование и, делая важной особенностью скорость, специфичность и доступность тест-систем, которые в свою очередь смогут значительно расширить возможности мясоперерабатывающих предприятий, и привести финансовую нагрузку к минимуму. Так как Cl. estertheticum растёт исключительно в анаэробных условиях, то основным фактором активного внимания стали мясные отруба, хранящиеся в вакуумной упаковке. Хотя данные о бактерии имеются, но они ограничены и остаются сильно фрагментированными. Таким образом, в этом обзоре собрана доступная информация и обсуждаются современные аспекты Cl. estertheticum как специфического микроорганизма вызывающего BPS, и методы его обнаружения.

Ключевые слова: Clostridium estertheticum; питательные среды; ДНК; РНК; ПЦР-анализ; вздутие упаковки; вакуумирование; порча мяса

Modern aspects of the diagnosis of Clostridium estertheticum as a specific microorganism of

meat spoilage in vacuum packaging

Aleksandr S Mazurov, Irina N Matveeva

All-Russian research and technological institute of biological industry, Losino-Petrovsky, Moscow obl.,

vnitibp@mail.ru

1kypck_m.a.c@mail.ru

2biolog1967@mail.ru

Corresponding author: Alexander Sergeevich Mazurov, kypck_m.a.c@mail.ru

Abstract. Clostridium estertheticum is a psychrotolerant, gram-positive, obligate, motile, anaerobic, spore-forming, rod-shaped bacterium that causes spoilage bloating of vacuum packed meat (BPS). Damage to the product occurs during storage without violating temperature conditions and integrity. Presumably, the sources of contamination are: soil, equipment for slaughtering livestock and animal skin. Over the past 30 years, BPS caused by Cl. estertheticum has been detected in some countries. Despite the fact that this microorganism directly affects damage-related losses, its research is accompanied by numerous difficulties. These include no or weak growth in laboratory environments, long cultivation periods, and unpredictable

isolation. These factors prevent the detection of Cl. estertheticum, which further undermines efforts to prevent the occurrence of BPS. However, there have been significant changes regarding detection methods. Many scientists are developing various detection methods, excluding cultivation and making the speed, specificity and availability of test systems an important feature, which in turn will be able to significantly expand the capabilities of meat processing enterprises and reduce the financial burden to a minimum. Since Cl. estertheticum grows exclusively in anaerobic conditions, meat cuts stored in vacuum packaging have become the main factor of active attention. Although data on the bacterium are available, they are limited and remain highly fragmented. So, this review collects the available information and discusses the current aspects of Cl. estertheticum as a specific microorganism causing BPS, and methods of its detection.

Keywords: Clostridium estertheticum; culture media; DNA; RNA; PCR analysis; packaging bloating; vacuuming; meat spoilage

Введение. Мясо является скоропортящимся продуктом, который подвергается микробной контаминации и химическим изменениям в процессе реализации. Происходит снижение органолептических и физии-ческих показателей: изменяется цвет и образуются неприятные запахи, слизь и экссудаты, которые существенно влияют на потребительские свойства [1]. Порча может оказывать значительное влияние на мировые поставки продовольствия. В Европе и Северной Америке примерно 21% потерь приходится на мясо и мясопродукты [2]. А для предприятий и розничной торговли этот показатель составляет до 40% производственных убытков [3]. Эти факторы приводят к огромным финансовым потерям для мясной промышленности, и являются дестабилизирующими для макроэкономики. Порча мяса - это результат сочетания химических процессов и степени обсеменённости. Оба они считаются важными, хотя микробиологическая активность является основной причиной, особенно для сырого мяса [4,5]. Оно обычно считается чистым перед убоем, но окружающая среда, в которой происходят процессы убоя, не стерильна, и поэтому может произойти определенная степень загрязнения [6]. Микробиологическое качество парного мяса в первую очередь определяется его типом обработки, условиями транспортирования и хранения [7]. Убойное оборудование, персонал, а также вода, воздух и почва, могут привести к перекрестной контаминации мяса, разными видами бактерий [8,9]. При хранении, различные внутренние и внешние факторы влияют на микробиологические процессы. К ним относятся потребность в кислороде, рН, температура и конкурирующие организмы [10]. Разнообразие этих экофизиологических составляющих, влияет на динамику роста, включая последовательность микроорганизмов и состав микробиоты, а также тип и скорость порчи мяса. Его состав предлагает легкодоступные субстраты, среди которых гликоген и аминокисло-

ты. Питательные вещества обеспечивают благоприятную среду для разнообразия микробного роста и метаболизма, что приводит к порче [11]. Несмотря на это, только часть исходной популяции, которые называются: "специфическими микроорганизмами порчи" (SSO), может развиться во время хранения [12,13]. В мясе они метаболизируют доступные субстраты, с последующими изменениями текстуры и образованием летучих органических соединений, вызывающих неприятный запах [14]. Также SSO могут вызывать накопление газов, особенно в вакуумной упаковке [15]. Вакуумирование используется мясными компаниями для снижения порчи. Способность влиять на рост некоторых пищевых патогенов и бактерий присутствующих на мясе, делает его широко используемым методом увеличения сроков реализации [16]. Анаэробная среда вакуумной упаковки создается путем удаления воздуха с последующей немедленной герметизацией [17]. Общепризнано, что отсутствие кислорода является важным внешним фактором для SSO в хранящемся мясе [18]. Изменяя газовый состав внутри упаковок, создаются критические условия для аэробных бактерий, одновременно способствуя росту факультативных и строгих анаэробов [19]. Дополнительным фактором вакуумной упаковки является поддерживание рН от 5,0 до 6,0 при длительном хранении [20]. Содержание молочной кислоты, которое является результатом метаболизма гликогена некоторыми анаэробными SSO [21], также может влиять на рост других микроорганизмов, для которых она является питательной средой [22]. Порча при холодильном хранении упакованного в вакуум мяса дополнительно указывает на психрофиль-ные или психротолерантные свойства бактерий [12]. Основной состав микроорганизмов включает Streptococcus spp., Brochothrix spp., P sychrobacter spp. и Acinetobacter spp. [8,23,24]. Ряд клостридий также были идентифицированы как SSO [25]. Clostridium estertheti-

cum, Cl. algidicamis, Cl. perfringens, Cl. gasige-nes, Cl. frigoris и Cl. bowmanii чаще всех встречаются в испорченном охлажденном вакууми-рованном мясе и мясных продуктах [26,27]. Процессы роста Cl. algidicarnis, Cl. frigoris, Cl. bowmanirn Cl. frigidicarmis происходят без образования газа, в то время как Cl. estertheticum и Cl. gasigenes характеризуется его присутствием [25]. Порчу вызванную Cl. estertheticum и Cl. gasigenes, также идентифицируют как (BPS), и в большинстве случаев обнаруживают Cl. estertheticum [28], что делает его основным SSO в подобных случаях. Существует два признанных подвида Cl. estertheticum, это estertheticum и Clostridium estertheticum subspp. laramiense [29,30], которые являются причиной BPS [31]. Первые данные о вздутии вакуумной упаковки охлаждённой говядины от Cl. estertheticum были получены в 1989 году в Великобритании и США [32,33]. Позже, BPS было зарегистрировано в Новой Зеландии [34] и Ирландии [35], что сделало его глобальным явлением, влияющим на мясную промышленность. В настоящем обзоре рассматриваются характеристики Cl. estertheticum в качестве SSO BPS в охлажденном мясе.

Таксономическая классификация Clostridium estertheticum. Род Clostridium-это большая, разнообразная группа, состоящая из грамположительных, спорообразующих, обли-гатных, анаэробных бактерий [36]. Открыли его в 1880 году с обнаружением Cl. buty-ricum [37]. В настоящее время род насчитывает более 230 признанных видов и подвидов [38]. Это объясняется широким спектром фенотипов, отображаемых различными видами, которые включают синтез хинона и цитохромов, различное содержание глицина и цистеина (GC), а также широкий диапазон температуры роста и кислотности [39]. Применение молекулярных методов, которые включают гибридизацию ДНК-рРНК и исследования по анализу 16S рРНК, выявило филогенетическое разнообразие и привело к рекласси-фикации [39,40]. Основываясь на этом анализе, род в настоящее время разделен на Кластер I и Кластер II, Cl. estertheticum попадает в Кластер I как Clostridium sensu stricto [29,30]. Впервые представители вида Cl. estertheticum были идентифицированы и зарегистрированы в разных странах в одно и то же время, несмотря на это, названия им присваивали разные [32,33]. Бактерия, обнаруженная в испорченном мясе в вакуумной упаковке в Великобритании, была названа Cl. estertheticum, из-за её способности образовывать сложные эфиры [41]. А выявленный микроорганизм в США, был наз-

ван Clostridium laramie, по названию города Ларами, штат Вайоминг [42]. Collins, M.D. [41] охарактеризовал бактерию с помощью 16S рибосомальной РНК (рРНК), в то время как Kalchayanand, N. и др. [42] определяли её с помощью фенотипических тестов и содержания GC. Таксономия двух видов была позже решена, когда эксперименты по гибридизации ДНК-ДНК показали, что их сходство составляет 79%, а анализ 16s РНК выявил тесную взаимосвязь на уровне видов, образующую плотный кластер [43]. Поэтому Spring [43 ] предложил объединить их в один, и назвать Cl. estertheticum, который был разделен на два подвида Cl.estertheticum subsp. estertheticum и Cl.esterteticum subsp. lara miense. Секвенирование штамма Cl. estertheti-cum DSM 8809 показало, что он содержит незначительно более высокое содержание GC, чем Cl. botulinum и Cl. perfringens [44]. Также, Cl. estertheticum subsp. estertheticum и Cl. estertheticum subsp. laramiense не группируются вместе в филогенетическом дереве, несмотря на то, что их последовательность 16s РНК схожа [30,43]. В частности, Cl. estertheticum subsp. laramiense группируется с Cl. frigioris, в то время как Cl. estertheticum subsp. estertheticum с Cl. lacusfryxellense в диапазоне 98,7-99,6% [30,43]. Эти различия поставили вопрос об идентификации двух подвидов как единого, в соответствии с существующей системой классификации [45]. Изначально, исследования фенотипических характеристик, указывали на различия в гемолитической активности, условиях роста, положении спор и продуктах ферментации [41,43]. Позже выяснили, что они не проявляли этих отличительных особенностей [45]. Это иллюстрирует проблемы, с которыми сталкиваются при использовании фенотипических признаков в пределах рода Clostridium для таксономической классификации.

Выделение и традиционное культивирование Clostridium estertheticum. Несмотря на то, что Cl. estertheticum был впервые обнаружен в 1989 году, его выделение было затруднено, из-за невозможности его выращивания в лабораторных средах, доступных в то время, которые включали тиогликолевый агар, инфу-зионный агар с сердечно-мозговым экстрактом, агар из яичного желтка с лактозой и триптон-дрожжевой агар с глюкозой [32,33]. Аналогичные результаты были получены 20 лет спустя Byrne, B. и др. [35]. После, их усилия по изоляции Cl. estertheticum из образцов BPS с использованием колумбийского кровяного агара (CBA), триптоза-сульфит-

циклосериновый агар (Tryptose-sulfite-cyclo-serine agar (TSC)), агара Шахиди-Фергюсона перфрингенса (Shahidi-Ferguson-perfringens agar (SFP)), обогащённого клостридиального агара (RCM) и инфузионного агара с сердечно-мозговым экстрактом, приводили к росту только других факультативных, анаэробных, не-спорообразующих бактерий, отличных от Cl. estertheticum. Тем не менее, чистые культуры Cl. estertheticum изначально можно было выращивать на RCM [41]. Позже, Broda, D.M. и др. [46] разработали протокол на основе восстановленного RCM, который включал предварительную обработку образцов этанолом и нагреванием, для прорастания спор клостридий после инактивации других микроорганизмов, и применили его для выделения Clostridium spp. из BPS. Этот метод был использован Boerema и соавторами [47], для выделения Cl. estertheticum на агаре с добавлением дефибринированной крови, затем идентифицировали по морфологии колоний. Позже, этот метод сравнили со способом, который включал стадию обогащения с использованием предварительно восстановленного крахмального глюкозно-дрожжевого пептон-ного экстракта (PYGS), при выделении Cl. estertheticum из образцов скотобойни, и было показано, что стадия обогащения способствовала успешной изоляции организма [48]. Фактором неудачного культивирования Cl. estertheticum было производство бутанола в изолирующих средах, который в конечном итоге убивает клетки организма [49]. Кроме того, не существует дифференциальных сред для его идентификации из-за переменных фенотипических характеристик между двумя подвидами [41,43,45,48] и среди психрофиль-ных клостридий [50]. По этим причинам Cl. estertheticum не обнаруживается с помощью большинства доступных в настоящее время методов культивирования [51]. Соответственно, для диагностики Cl. estertheticum на протяжении многих лет основывались на неспецифических средах, включая PYGS и CBA дополненный 5%-ной дефибринированной лошадиной кровью [52]. На CBA образуются колонии, округлой формы с часто крупно гранулированными краями, гладкие, слегка приподнятые, кремово-белые до сероватых и полупрозрачные до непрозрачных и могут быть ß-гемолитическими [48]. Современные традиционные процессы культивирования требуют много времени, потому что для Cl. estertheticum оптимальна низкая температура, соответственно рост бактерий происходит медленно, часто занимая до трех месяцев [44].

Даже при наличии всех благоприятных условий рабочей культуры, в настоящее время отсутствуют коммерческие наборы, которые позволяют фенотипически дифференцировать все виды клостридий, что может еще больше затруднить правильную идентификацию Cl. estertheticum [53].

Молекулярная и немолекулярная идентификация Clostridium estertheticum. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), оказался надежным для обнаружения Cl. stertheti-cum. Успех также зависит от стадии обогащения перед анализом [28,54]. Collins, M.D. [41] описал первый молекулярный метод идентификации Cl. estertheticum, основанный на гене 16S рРНК, который позволил дифференцировать Cl. estertheticum от Cl. acetobutyli-cum, Cl. butyricum и Cl. tetani. После этого, разработали методику на рибосомальной ДНК (рДНК) для обнаружения Cl. estertheticum в бульоне, мясе и смывах при обработке [55]. Broda, D.M. и др. [34] разработали анализ полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (ПДРФ) на основе 16S рДНК для дифференциации Cl. estertheticum от Cl. botulinum, Cl. algidicarnis, Cl. putrefaciens, Cl. vincentii и Cl. fimetarium. Впоследствии Broda, D.M. и др. [56], использовали анализ внутренних транскрибированных спейсеров 16S-23S рДНК, для детекции образцов из мясоперерабатывающих предприятий. Также, Broda, D.M. и др. [57] описали первый набор праймеров 16SEF и 16SER, с помощью которого дифференцировали Cl. stertheticum от других клостридий, обнаруженных в мясе без ПДРФ-анализа. Этот протокол пригоден для обнаружения бактерий из подготовленных для утилизации BPS, с пределом обнаружения 100 клеток на грамм. Этот метод впоследствии был использован и подтвержден в различных исследованиях [47,58,59]. Стремясь сократить время детекции Cl. estertheticum, Brightwell, G.; Clemens, R. [28], разработали и подтвердили ПЦР-анализ в реальном времени (ПЦР-РВ), который был применён в различных матрицах, включая почву, шкуры, фекалии и мясо. Bonke, R. и др. [50] сравнили его с обычным методом ПЦР, описанным Broda, D.M. и соавт. [57], и выяснили, что ПЦР-РВ был более чувствительным. Reid, R. и др. [60] улучшили ПЦР-РВ, для одновременного обнаружения Cl. estertheticum, Cl. gasigenes и Cl. ruminantium в мясном соке и образцах влажных или сухих мазков в низких концентрациях. Этот анализ может обнаруживать пять спор на миллилитр без необходимости этапа обогащения, что также значительно ускоряет время, необходи-

мое для идентификации клостридий. Dorn-In, S. и др. [25] разработали мультиплексную количественную ПЦР (кПЦР) для обнаружения Cl. estertheticum, Cl. frigoriphilum, Cl. bowmanii и Cl. tagluense, в экстрактах мясного сока из образцов BPS. Cl. estertheticum подвид. estertheticum и Cl. estertheticum подвид lara-miense можно было дифференцировать путем расщепления SmaI ДНК с последующим анализом электрофореза в пульсирующем поле (PFGE). [45]. Анализ позволяет различать их, из-за совершенно разных моделей PFGE с коэффициентом сходства Дайса, равным 90%. Рестрикционный анализ амплифицированной рДНК (ARDRA), являющийся модифицированным методом ПДРФ, был использован для дифференциации Cl. estertheticum от других видов клостридий, в том числе в образцах BPS [61]. Также для идентификации рода, используется матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролетным разделением (MALDI-TOF MS), из туш овец и крупного рогатого скота на разных стадиях убоя, и результаты подтверждены с помощью секвенирования гена 16S рДНК. [53].

Рост и метаболизм Cl. estertheticum Cl. Estertheticum является облигатной, анаэробной бактерией, поэтому она чувствительна к кислороду в вегетативном состоянии [62]. Будучи психротолерантной, она растет в диапазоне температур от -2 до 22 °C [63,64], а при 25 °C или выше метаболизм прекращается [41]. Оптимальный предел колеблется от 6 до 15 °C [43,45]. Тип субстрата также может влиять на благоприятную температуру, учитывая, что Cl. estertheticum растёт в мясном соке при 20 °C, а в бульоне PYGS нет [63]. Также значимым фактором является рН среды, допустимый диапазон от 5,5 до 7,5 с максимальной активностью между 5,8 и 6,8 [63]. В мясном соке Cl. estertheticum использует глюкозу и гликоген, но истощение глюкозы приводило к прекращению метаболизма с одновременным поглощением лактата и выработкой CO2 и H2, но без роста, вероятно, из-за низкого уровня ацетата [65]. Cl. estertheticum производит бути-рат, ацетат и формиат из глюкозы, а из лактата: 1-бутанол, этанол, бутират, формиат [45]. Бактерии для жизнедеятельности используют аминокислоты не содержащие серы, следовательно, не производят сероводород [45]. Мясо с высоким рН и концентрацией глюкозы является наиболее благоприятной пищевой средой для роста Cl. estertheticum [66].

Clostridium estertheticum - как возбудитель порчи мяса в вакуумной упаковке. Ранее утверждали, что BPS в охлаждённом мясе,

также может быть вызвано газообразующими энтеробактериями, включая Hafnia spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Rahnella spp. и Ewingella spp. [67]. Тем не менее, эти виды не растут ниже 4 °C [68]. Несмотря на то, что различные SSO, включая энтеробактерии и молочнокислые бактерии, могут вызывать BPS при температуре охлаждения от 4 °C до 15 °C [69], порча ниже 2 °C является основным отличием Cl. estertheticum в BPS [46]. Четырехлетний анализ BPS в Ирландии, показал, что распространённость Cl. estertheticum была выше, чем у других клостридий [70]. В другом исследовании были взяты образцы говядины и баранины из Европы, Северной и Южной Америки и Океании, и также было обнаружено, что Cl. estertheticum была наиболее распространенной бактерией [50]. Сравнение 11 видов клостридий показало, что все они могли расти на упакованном в вакуум мясе, но только Cl. estertheticum и Cl. frigioris вызывали вздутие [71]. Аналогичные результаты были получены Silva, A.R. и соавт. [72]. В этих отчетах подчеркивается, что Cl. estertheticum на сегодняшний день является наиболее распространенной психротолерантной клост-ридией, вызывающей BPS охлаждённого ниже 2 °C мяса в вакуумной упаковке. Как правило, вздутая упаковка, порча которой обусловлена метаболизмом Cl. estertheticum, содержит большое количество жидкости и газа, результатом этого является значительное растяжение упаковки [64]. При вскрытии отдельных упаковок BPS может ощущаться очень неприятный запах, сопровождаемый сильным фруктовым или молочным ароматом [33,63]. Эти органолептические показатели не могут быть окончательно применены для характеристики BPS Cl. estertheticum, учитывая что, несмотря на его неспособность продуцировать сероводород [45], неприятный запах ощущался и от естественной порчи продукта [32], но отсутствовал в других исследованиях [63]. Испорченное мясо обесцвечивается и становится чрезмерно нежным [33]. BPS не рассматривается как угроза биобезопасности, но такое мясо не имеет коммерческой ценности, и наносит значительные финансовые убытки мясной промышленности [70]. Потери, которые вызваны Cl. estertheticum, чаще всего происходят летом, в сезон с наибольшей распространенностью [70,73]. Хотя риски безопасности считаются низкими, анализ генома показал, что Cl. estertheticum содержит множество генов, потенциально связанных с устойчивостью к антибиотикам, биоцидам и металлам, наряду с

несколькими генетическими факторами вирулентности [44].

Факторы, влияющие на Cl. estertheticum во время метаболизма в продукте. Вздутие, вызванное Cl. estertheticum в первую очередь зависит от контаминации мяса до ва-куумирования и способности прорастать в упаковках. Всего одной споры Cl. estertheticum достаточно, чтобы вызвать BPS [64]. Существует предположение, что 100 спор на см2 является критическим числом для порчи [74]. Скорость прорастания, следовательно, соотношение количества спор и вегетативных клеток Cl. estertheticum во время продолжающегося процесса BPS, также может влиять на вздутие [75]. В частности, как нейтральный рН, так и лактат повышают скорость прорастания спор [62]. Также было показано, что максимальное количество Cl. estertheticum в BPS зависит от количества глюкозы, доступной для метаболизма [65]. Поэтому является ключевым фактором, так как это первый субстрат, предпочтительно используемый большинством бактерий, растущих в сыром мясе во время хранения в холодильнике [14]. Более того, способность Cl. estertheticum конкурировать с микрофлорой использующей глюкозу в упакованном в вакуум мясе, такой как мезентериальные лейконостоки, может влиять на возникновение BPS [76]. Температура хранения оказывает существенное влияние на BPS. Чтобы свести к минимуму порчу, рекомендуемая температура хранения -1,5 °C, а выше 0 °C считается недопустимой [77]. Срок годности продукта при - 1,5 °C, составляет от 60 до 70 дней [78]. К сожалению, BPS от Cl. estertheticum может возникать при соблюдении температурных режимов и целостности упаковки [59]. Всего 10 спор на см2 может сократить срок годности мяса до 44 дней при температуре -1,5 °C [64]. В упаковках контаминированных Cl. estertheticum первые признаки вздутия появляются на 15-й и 4-й день хранения при 2 °C и 15 °C соответственно [72]. А при -1,5 °C, очевидно замедляется скорость BPS, время, необходимое для охлаждения до -1,5 °C , не влияет на газообразование [75]. Еще одним фактором, связанным с температурой, является применение термоусадки. Это погружение вакуумных упаковок мяса в воду при температуре 85-90 °C в течение 2-3 секунд, сразу после герметизации, для улуч-

шения целостности [79]. Было показано, что этот метод ускоряет вздутие, в результате чего газ образуется в термообработанных упаковках намного раньше, чем без таковой [80]. На возникновение BPS также может влиять после-убойная обвалка туш. Она может быть горячей, которая осуществляется перед охлаждением, либо холодной, сразу после него [81]. Горячее обваливание имеет множество экономических и технологических преимуществ, которые включают меньшие энергетические затраты на охлаждение и соответственно удешевляет производство, а также обеспечивает высокое качество мяса, благодаря показателю рН, гигроскопичности и эмульгирующей способности [82,83]. Исследование двух методов обработки показало, что горячая обвалка привела к более раннему вздутию вызванному Cl. estertheticum, чем при холодном [60].

Заключение. Большой проблемой для агропромышленного комплекса, по-прежнему остаются бактерии. Результатом их жизнедеятельности становится падёж поголовья и контаминация продуктов животноводства. Одним из факторов, является вздутие вакуумной упаковки мяса, обусловленное метаболизмом Cl. estertheticum. Исследования, направленные на поиски эффективных способов культивирования и изучения генетических характеристик, могут дать более подробное представление о механизмах, которые будут применены для контроля распространения. Хотя этот подвид клостридий не является источником биологической опасности, но он оказывает косвенное экономическое влияние на мясную промышленность. Важную роль играет разработка и внедрение российских ПЦР-тест систем, которые станут достойной заменой дорогостоящих импортных аналогов, давая возможность мясоперерабатывающим предприятиям снизить себестоимость и повысить качественные показатели выпускаемой продукции. А также позволит проводить микробиологический анализ на всех этапах производства, для обнаружения возможной контаминации, и исключать риски возникновения BPS дорогостоящих отрубов. В перспективе, контроль санитарных норм и надлежащих стандартов, положительно повлияет на финансовую составляющую российского АПК, исключая убытки на утилизацию и потери связанные с порчей мяса.

Список источников

1. Hilgarth, M.; Behr, J.; Vogel, R.F. Monitoring of spoilage-associated microbiota on modified atmosphere packaged beef and differentiation of psychrophilic and psychrotrophic strains. J. Appl. Microbiol. 2018, 124, 740-753.

2. Holl, L.; Behr, J.; Vogel, R.F. Identification and growth dynamics of meat spoilage microorganisms in modified atmosphere packaged poultry meat by MALDI-TOF MS. Food Microbiol. 2016, 60, 84-91.

3. Lahmar, A.; Morcuende, D.; Andrade, M.-J.; Chekir-Ghedira, L.; Estevez, M. Prolonging shelf life of lamb cutlets packed under high-oxygen modified atmosphere by spraying essential oils from North-African plants. Meat Sci. 2018, 139, 56-64.

4. Miks-Krajnik, M.; Yoon, Y.-J.; Ukuku, D.O.; Yuk, H.-G. Volatile chemical spoilage indexes of raw atlantic salmon (Salmo salar) stored under aerobic condition in relation to microbiological and sensory shelf lives. Food Microbiol. 2016, 53, 182-191.

5. Cheng, W.; Sun, D.-W.; Pu, H.; Wei, Q. Chemical spoilage extent traceability of two kinds of processed pork meats using one multispectral system developed by hyperspectral imaging combined with effective variable selection methods. Food Chem. 2017, 221, 1989-1996.

6. Holman, B.W.B.; Kerry, J.P.; Hopkins, D.L. Meat packaging solutions to current industry challenges: A review. Meat Sci. 2018, 144, 159-168.

7. Nychas, G.-J.E.; Skandamis, P.N.; Tassou, C.C.; Koutsoumanis, K.P. Meat spoilage during distribution. Meat Sci. 2008, 78, 77-89.

8. Stellato, G.; La Storia, A.; De Filippis, F.; Borriello, G.; Villani, F.; Ercolini, D. Overlap of spoilage-associated microbiota between meat and the meat processing environment in small-scale and large-scale retail distributions. Appl. Environ. Microbiol. 2016, 82, 4045-4054.

9. Wambui, J.; Lamuka, P.; Karuri, E.; Matofari, J.; Njage, P.M.K. Microbial contamination level profiles attributed to contamination of beef carcasses, personnel, and equipment: Case of small and medium enterprise slaughterhouses. J. Food Prot. 2018, 81, 684-691.

10. Fletcher, B.; Mullane, K.; Platts, P.; Todd, E.; Power, A.; Roberts, J.; Chapman, J.; Cozzolino, D.; Chandra, S. Advances in meat spoilage detection: A short focus on rapid methods and technologies. CyTA J. Food 2018, 16, 1037-1044.

11. Hilgarth, M.; Nani, M.; Vogel, R.F. Assertiveness of meat-borne Lactococcus piscium strains and their potential for competitive exclusion of spoilage bacteria in situ and in vitro. J. Appl. Microbiol. 2018, 124, 1243-1253.

12. Gram, L.; Ravn, L.; Rasch, M.; Bruhn, J.B.; Christensen, A.B.; Givskov, M. Food spoilage-interactions between food spoilage bacteria. Int. J. Food Microbiol. 2002, 78, 79-97.

13. Andreevskaya, M.; Jaaskelainen, E.; Johansson, P.; Ylinen, A.; Paulin, L.; Bjorkroth, J.; Auvinen, P. Food spoilage-associated Leuconostoc, Lactococcus, and Lactobacillus species display different survival strategies in response to competition. Appl. Environ. Microbiol. 2018, 84, e00554-18.

14. Casaburi, A.; Piombino, P.; Nychas, G.-J.; Villani, F.; Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiol. 2015, 45, 83-102.

15. Van Rooyen, L.A.; Allen, P.; Kelly-Rees, C.; O'Connor, D.I. The Effects of varying gas concentrations and exposure times on colour stability and shelf-life of vacuum packaged beef steaks subjected to carbon monoxide pretreatment. Food Packag. Shelf Life 2018, 18, 230-237.

16. De Filippis, F.; La Storia, A.; Villani, F.; Ercolini, D. Strain-level diversity analysis of Pseudomonas fragi after in situ pangenome reconstruction shows distinctive spoilage-associated metabolic traits clearly selected by different storage conditions. Appl. Environ. Microbiol. 2019, 85, e02212-18.

17. Lavieri, N.; Williams, S.K. Effects of packaging systems and fat concentrations on microbiology, sensory and physical properties of ground beef stored at 4 ±1 °C for 25 days. Meat Sci. 2014, 97, 534-541.

18. Mansur, A.R.; Song, E.-J.; Cho, Y.-S.; Nam, Y.-D.; Choi, Y.-S.; Kim, D.-O.; Seo, D.-H.; Nam, T.G. Comparative evaluation of spoilage-related bacterial diversity and metabolite profiles in chilled beef stored under air and vacuum packaging. Food Microbiol. 2019, 77, 166-172.

19. Doulgeraki, A.I.; Ercolini, D.; Villani, F.; Nychas, G.-J.E. Spoilage microbiota associated to the storage of raw meat in different conditions. Int. J. Food Microbiol. 2012, 157, 130-141.

20. Chen, X.; Zhang, Y.; Yang, X.; Hopkins, D.L.; Zhu, L.; Dong, P.; Liang, R.; Luo, X. Shelf-life and microbial community dynamics of super-chilled beef imported from Australia to China. Food Res. Int. 2019, 120, 784-792.

21. Pothakos, V.; Devlieghere, F.; Villani, F.; Bjorkroth, J.; Ercolini, D. Lactic Acid Bacteria and their controversial role in fresh meat spoilage. Meat Sci. 2015, 109, 66-74. [Google Scholar] [CrossRef]

22. Zhang, P.; Badoni, M.; Ganzle, M.; Yang, X. Growth of Carnobacterium spp. isolated from chilled vacuum-packaged meat under relevant acidic conditions. Int. J. Food Microbiol. 2018, 286, 120-127.

23. Chaillou, S.; Chaulot-Talmon, A.; Caekebeke, H.; Cardinal, M.; Christieans, S.; Denis, C.; Hélène Desmonts, M.; Dousset, X.; Feurer, C.; Hamon, E.; et al. Origin and ecological selection of core and food-specific bacterial communities associated with meat and seafood spoilage. ISME J. 2015, 9, 1105— 1118.

24. Hultman, J.; Rahkila, R.; Ali, J.; Rousu, J.; Björkroth, K.J. Meat processing plant microbiome and contamination patterns of cold-tolerant bacteria causing food safety and spoilage risks in the manufacture of vacuum-packaged cooked sausages. Appl. Environ. Microbiol. 2015, 81, 7088-7097.

25. Dorn-In, S.; Schwaiger, K.; Springer, C.; Barta, L.; Ulrich, S.; Gareis, M. Development of a Multiplex QPCR for the species identification of Clostridium estertheticum, C. frigoriphilum, C. bowmanii and C. tagluense-like from blown pack spoilage (BPS) meats and from wild boars. Int. J. Food Microbiol. 2018, 286, 162-169.

26. André, S.; Vallaeys, T.; Planchon, S. Spore-forming bacteria responsible for food spoilage. Res. Microbiol. 2017, 168, 379-387.

27. Zhang, Y.; Wei, J.; Yuan, Y.; Yue, T. Diversity and characterization of spoilage-associated psychrotrophs in food in cold chain. Int. J. Food Microbiol. 2019, 290, 86-95.

28. Brightwell, G.; Clemens, R. Development and validation of a Real-Time PCR assay specific for Clostridium estertheticum and C. estertheticum-like psychrotolerant bacteria. Meat Sci. 2012, 92, 697703.

29. Collins, M.D.; Lawson, P.A.; Willems, A.; Cordoba, J.J.; Fernandez-Garayzabal, J.; Garcia, P.; Cai, J.; Hippe, H.; Farrow, J.A.E. The phylogeny of the genus Clostridium: Proposal of five new genera and eleven new species combinations. Int. J. Syst. Bacteriol. 1994, 44, 812-826.

30. Vos, P.; Garrity, G.M.; Jones, D.; Krieg, N.R.; Ludwig, W.; Rainey, F.A.; Schleifer, K-H. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume 3: The Firmicutes; Springer: Berlin/Heidelberg, Germany, 2012; p. 1450.

31. Moschonas, G.; Bolton, D.J.; Sheridan, J.J.; McDowell, D.A. The effect of storage temperature and inoculum level on the time of onset of "blown pack" spoilage. J. Appl. Microbiol. 2010, 108, 532-539.

32. Dainty, R.H.; Edwards, R.A.; Hibbard, C.M. Spoilage of vacuum-packed beef by Aclostridium sp. J. Sci. Food Agric. 1989, 49, 473-486.

33. Kalchayanand, N.; Ray, B.; Field, R.A.; Johnson, M.C. Spoilage of vacuum-packaged refrigerated beef by Clostridium. J. Food Prot. 1989, 52, 424-426.

34. Broda, D.M.; Musgrave, D.R.; Bell, R.G. Use of Restriction Fragment Length Polymorphism analysis to differentiate strains of psychrophilic and psychrotrophic Clostridia associated with "blown pack" spoilage of vacuum-packed meats. J. Appl. Microbiol. 2000, 88, 107-116.

35. Byrne, B.; Monaghan, A.M.; Lyng, J.G.; Sheridan, J.J.; Bolton, D.J. A case of "blown pack" meat linked to Clostridium estertheticum in Ireland. J. Food Saf. 2009, 29, 629-635.

36. Joseph, R.C.; Kim, N.M.; Sandoval, N.R. Recent developments of the synthetic biology toolkit for Clostridium. Front. Microbiol. 2018, 9, 1-13.

37. Prazmowski, A. Untersuchung über die Entwickelungsgeschichte und Fermentwirking einiger Bakterien-arten. Inaugural Dissertation, Hugo Voigt, Leipzig, Germany, 1880.

38. Alou, M.T.; Ndongo, S.; Frégère, L.; Labas, N.; Andrieu, C.; Richez, M.; Couderc, C.; Baudoin, J.P.; Abrahäo, J.; Brah, S.; et al. Taxonogenomic description of four new Clostridium species isolated from human gut: 'Clostridium amazonitimonense', 'Clostridium merdae', 'Clostridium massilidielmoense' and 'Clostridium nigeriense'. New Microbes New Infect. 2018, 21, 128-139.

39. Lawson, P.A.; Rainey, F.A. Proposal to restrict the Genus Clostridium prazmowski to Clostridium butyricum and related species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2016, 66, 10091016.

40. Oren, A.; Rupnik, M. Clostridium difficile and Clostridioides difficile: Two validly published and correct names. Anaerobe 2018, 52, 125-126.

41. Collins, M.D. Taxonomic studies on a psychrophilic Clostridium from vacuum-packed beef: Description of Clostridium estertheticum sp. nov. FEMS Microbiol. Lett. 1992, 96, 235-239.

42. Kalchayanand, N.; Ray, B.; Field, R.A. Characteristics of psychrotrophic Clostridium laramie causing spoilage of vacuum-packaged refrigerated fresh and roasted beef. J. Food Prot. 1993, 56, 13-17.

43. Spring, S. Characterization of novel psychrophilic Clostridia from an antarctic microbial mat: Description of Clostridium frigoris sp. nov., Clostridium lacusfryxellense sp. nov., Clostridium bowmanii sp. nov. and Clostridium psychrophilum sp. nov. and reclassification of Clostridium laramiense as Clostridium estertheticum subsp. laramiense subsp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003, 53, 1019-1029.

44. Yu, Z.; Gunn, L.; Brennan, E.; Reid, R.; Wall, P.G.; Gaora, P.; Hurley, D.; Bolton, D.; Fanning, S. Complete genome sequence of Clostridium estertheticum DSM 8809, a microbe identified in spoiled vacuum-packed beef. Front. Microbiol. 2016, 7, 1-10.

45. Yang, X.; Gill, C.O.; Balamurugan, S. Products of glucose and lactate fermentation, and utilization of amino acids by Clostridium estertheticum ssp. laramiense and estertheticum growing in meat juice medium. J. Food Prot. 2016, 73, 1348-1352.

46. Broda, DM.; Delacy, KM.; Bell, R.G.; Braggins, T.J.; Cook, R.L. Psychrotrophic Clostridium spp. associated with 'blown pack' spoilage of chilled vacuum-packed red meats and dog rolls in gas-impermeable plastic casings. Int. J. Food Microbiol. 1996, 29, 335-352.

47. Boerema, J.A.; Broda, D.M.; Bell, R.G. Abattoir sources of psychrophilic Clostridia causing blown pack spoilage of vacuum-packed chilled meats determined by culture-based and molecular detection procedures. Lett. Appl. Microbiol. 2003, 36, 406-411.

48. Moschonas, G.; Bolton, D.J.; Sheridan, J.J.; McDowell, D.A. Isolation and sources of blown pack spoilage Clostridia in beef abattoirs. J. Appl. Microbiol. 2009, 107, 616-624.

49. Broda, D.M. The Effect of peroxyacetic acid-based sanitizer, heat and ultrasonic waves on the survival of Clostridium estertheticum spores in vitro. Lett. Appl. Microbiol. 2007, 45, 336-341.

50. Bonke, R.; Drees, N.; Gareis, M. Detection of psychrophilic and psychrotolerant Clostridium spp. in chilled fresh vacuum-packed meat using different PCR methods. FEMS Microbiol. Lett. 2015, 363, fnv218.

51. Jones, R.J.; Zagorec, M.; Brightwell, G.; Tagg, J.R. Inhibition by Lactobacillus sakei of other species in the flora of vacuum packaged raw meats during prolonged storage. Food Microbiol. 2009, 26, 876-881.

52. Moschonas, G.; Bolton, D.J.; McDowell, D.A.; Sheridan, J.J. Diversity of culturable psychrophilic and psychrotrophic anaerobic bacteria isolated from beef abattoirs and their environments. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77, 4280-4284.

53. Bakhtiary, F.; Sayevand, H.R.; Remely, M.; Hippe, B.; Indra, A.; Hosseini, H.; Haslberger, A.G. Identification of Clostridium spp. derived from a sheep and cattle slaughterhouse by Matrix-Assisted Laser Desorption and Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) and 16S RDNA sequencing. J. Food Sci. Technol. 2018, 55, 3232-3240.

54. Yang, X.; Gill, C.O.; Balamurugan, S. Enumeration of Clostridium estertheticum spores in samples from meat plant conveyors and silage stacks by conventional and Real-Time PCR procedures. Internet J. Food Saf. 2010, 12, 115-121.

55. Helps, C.R.; Harbour, D.A.; Corry, J.E.L. PCR-based 16S ribosomal DNA detection technique for Clostridium estertheticum causing spoilage in vacuum-packed chill-stored beef. Int. J. Food Microbiol. 1999, 52, 57-65.

56. Broda, D.M.; Bell, R.G.; Boerema, J.A.; Musgrave, D.R. The abattoir source of culturable psychrophilic Clostridium spp. causing "blown pack" spoilage of vacuum-packed chilled venison. J. Appl. Microbiol. 2002, 93, 817-824.

57. Broda, D.M.; Boerema, J.A.; Bell, R.G. PCR Detection of psychrophilic Clostridium spp. causing "blown pack" spoilage of vacuum-packed chilled meats. J. Appl. Microbiol. 2003, 94, 515-522.

58. Boerema, J.A.; Broda, D.M.; Penney, N.; Brightwell, G. Influence of peroxyacetic acid-based carcass rinse on the onset of "blown pack" spoilage in artificially inoculated vacuum-packed chilled beef. J. Food Prot. 2007, 70, 1434-1439.

59. Brightwell, G.; Broda, D.M.; Boerema, J.A. Sources of psychrophilic and psychrotolerant Clostridia causing spoilage of vacuum-packed chilled meats, as determined by PCR amplification procedure. J. Appl. Microbiol. 2009, 107, 178-186.

60. Reid, R.; Fanning, S.; Whyte, P.; Kerry, J.; Bolton, D. Comparison of hot versus cold boning of beef carcasses on bacterial growth and the risk of blown pack spoilage. Meat Sci. 2017, 125, 46-52.

61. Brightwell, G.; Horvath, K.M. Molecular discrimination of New Zealand sourced meat spoilage associated psychrotolerant Clostridium species by ARDRA and its comparison with 16s RNA gene sequencing. Meat Sci. 2018, 138, 23-27.

62. Rajagopal, S.; McMullen, L.M.; Gill, C.O.; Yang, X. Characterization of germination of spores of Clostridium estertheticum, the primary causative agent of blown pack spoilage of vacuum packaged beef. Food Res. Int. 2016, 87, 109-114.

63. Yang, X.; Gill, C.O.; Balamurugan, S. Effects of temperature and pH on the growth of bacteria isolated from blown packs of vacuum-packaged beef. J. Food Prot. 2009, 72, 2380-2385.

64. Clemens, R.M.; Adam, K.H.; Brightwell, G. Contamination levels of Clostridium estertheticum spores that result in gaseous spoilage of vacuum-packaged chilled beef and lamb meat. Lett. Appl. Microbiol. 2010, 50, 591-596.

65. Yang, X.; Balamurugan, S.; Gill, C.O. Substrate utilization by Clostridium estertheticum cultivated in meat juice medium. Int. J. Food Microbiol. 2009, 128, 501-505.

66. Yang, X.; Wang, H.; Badoni, M. Effects of meat pH and the initial numbers of spores of Clostridium estertheticum on the development of blown pack spoilage of vacuum-packaged beef. Int. J. Food Sci. Technol. 2014, 49, 1619-1625.

67. Brightwell, G.; Clemens, R.; Urlich, S.; Boerema, J. Possible involvement of psychrotolerant Enterobacteriaceae in blown pack spoilage of vacuum-packaged raw meats. Int. J. Food Microbiol. 2007, 119, 334-339.

68. Kang, D.-H.; Arthur, T.M.; Siragusa, G.R. Gas formation in ground beef chubs due to Hafnia alvei is reduced by multiple applications of antimicrobial interventions to artificially inoculated beef trim stock. J. Food Prot. 2002, 65, 1651-1655.

69. Chaves, R.D.; Silva, A.R.; Sant'Ana, A.S.; Campana, F.B.; Massaguer, P.R. Gas-producing and spoilage potential of Enterobacteriaceae and Lactic Acid Bacteria isolated from chilled vacuum-packaged beef. Int. J. Food Sci. Technol. 2012, 47, 1750-1756.

70. Bolton, D.J.; Carroll, J.; Walsh, D. A four-year survey of blown pack spoilage Clostridium estertheticum and Clostridium gasigenes on beef primal cuts. Lett. Appl. Microbiol. 2015, 61, 153-157.

71. Yang, X.; Youssef, M.K.; Gill, C.O.; Badoni, M.; Lopez-Campos, O. Effects of meat pH on growth of 11 species of psychrotolerant Clostridia on vacuum packaged beef and blown pack spoilage of the product. Food Microbiol. 2014, 39, 13-18.

72. Silva, A.R.; Tahara, A.C.C.; Chaves, R.D.; Sant'Ana, A.S.; Faria, J.d.A.F.; Massaguer, P.R. Influence of different shrinking temperatures and vacuum conditions on the ability of psychrotrophic Clostridium to cause "blown pack" spoilage in chilled vacuum-packaged beef. Meat Sci. 2012, 92, 498-505.

73. Jones, R.J.; Hussein, H.M.; Zagorec, M.; Brightwell, G.; Tagg, J.R. Isolation of Lactic Acid Bacteria with inhibitory activity against pathogens and spoilage organisms associated with fresh meat. Food Microbiol. 2008, 25, 228-234.

74. Silva, A.R.; Carvalho, J.; Massaguer, P.R. "Blown pack" probabilistic modeling for C. algidicarnis and C. estertheticum under the effects of storage temperature, vacuum level and package shrink temperature. Procedia Food Sci. 2016, 7, 59-62.

75. Reid, R.; Fanning, S.; Whyte, P.; Kerry, J.; Bolton, D. An investigation of the effect of rapid slurry chilling on blown pack spoilage of vacuum-packaged beef primals. Lett. Appl. Microbiol. 2017, 64, 177-181.

76. Yang, X.; Balamurugan, S.; Gill, C.O. Effects on the development of blown pack spoilage of the initial numbers of Clostridium estertheticum spores and Leuconostoc mesenteroides on vacuum packed beef. Meat Sci. 2011, 88, 361-367.

77. Mills, J.; Donnison, A.; Brightwell, G. Factors affecting microbial spoilage and shelf-life of chilled vacuum-packed lamb transported to distant markets: A review. Meat Sci. 2014, 98, 71-80.

78. James, S.J.; James, C. Meat Refrigeration; CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 2002; p. 360.

79. Moschonas, G.; Bolton, D.J.; Sheridan, J.J.; McDowell, D.A. The effect of heat shrink treatment and storage temperature on the time of onset of "blown pack" spoilage. Meat Sci. 2011, 87, 115-118.

80. Bell, R.G.; Moorhead, S.M.; Broda, D.M. Influence of heat shrink treatments on the onset of Clostridial "blown pack" spoilage of vacuum-packed chilled meat. Food Res. Int. 2001, 34, 271-275.

81. Sumner, J.; Jenson, I.; Ross, T. Using predictive microbiology to benefit the Australian meat industry. In Case Studies in Food Safety and Authenticity; Elsevier: Amsterdam, The Netherlands, 2012; pp. 276-283.

82. Claus, J.R.; S0rheim, O. Preserving pre-rigor meat functionality for beef patty production. Meat Sci. 2006, 73, 287-294.

83. Sukumaran, A.T.; Holtcamp, A.J.; Campbell, Y.L.; Burnett, D.; Schilling, M.W.; Dinh, T.T.N. Technological characteristics of pre- and post-rigor deboned beef mixtures from Holstein steers and quality attributes of cooked beef sausage. Meat Sci. 2018, 145, 71-78.

Вклад авторов:

Мазуров А.С. и Матвеева И.Н. проанализировали литературные данные и написали рукопись

Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии

конфликта интересов. Contribution of the authors:

Mazurov A.S. and Matveeva I.N. analyzed the literary data and wrote the manuscript The authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts

© Мазуров А.С., Матвеева И.Н., 2022