CC BY
88
Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2016. Т. 16, вып. 2
УДК 616.934: 578.233: 53.086
СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИЗУЧЕНИЯ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ МИКРООРГАНИЗМОВ В УСЛОВИЯХ НЕБЛАГОПРИЯТНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ БИОТИЧЕСКОЙ И АБИОТИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ МЕТОДАМИ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
П. С. Ерохин, Д. В. Уткин, Н. А. Осина, А. В. Бойко, О. С. Кузнецов, В. Е. Куклев, Т. В. Бугоркова
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов E-mail: rusrapi@microbe.ru
В статье приведены основные сведения о применении атомно-силовой микроскопии для изучения влияния факторов биотической и абиотической природы на ультраструктуру и морфологические особенности микроорганизмов. Ключевые слова: микроорганизмы, атомно-силовая микроскопия, шероховатость, сила адгезии, биотические факторы, абиотические факторы.
Current State of Investigation of Cell Wall Surface of Microorganisms Ultrastructure under the Action of Factors Biotic and Abiotic Nature Using Methods of Atomic Force Microscopy
P. S. Erokhin, D. V. Utkin, N. A. Osina, A. V. Boyko, O. S. Kuznetsov, V. E. Kuklev, T. V. Bugorkova
This article presents data about current application of atomic force microscopy for study the influence factors biotic and abiotic nature on ultrastructure and morphological features of microorganisms. Key words: microorganisms, atomic force microscopy, roughness, biotic factors, abiotic factors.
DOI: 10.18500/1816-9775-2016-16-2-186-189
В микробиологии световая микроскопия является бесспорным лидером среди всех методов визуализации в силу доступности, относительной простоты приготовления исследуемых образцов, а также возможности изучения биологических структур в близких к природным условиях. Слабой стороной оптических приборов является ограниченная дифракционным пределом разрешающая способность. Именно поэтому ультраструктуру микроорганизмов удалось изучить и описать лишь с появлением электронной микроскопии в 40-е гг. XX в. Однако электронная микроскопия, до настоящего времени являющаяся единственным методом визуализации нанометрового разрешения, имеет ряд недостатков, главные из которых - сложность приготовления препаратов и необходимость проведения исследований в условиях высокого вакуума.
В 1981 г. Гердом Биннигом и Генрихом Рорером был изобретен сканирующий зондо-вый микроскоп (Нобелевская премия 1986 г.), в основе работы которого лежит регистрация взаимодействия, возникающего между зондом и поверхностью образца при сканировании. В настоящее время существует целое семейство зондовых микроскопов, один из которых - атом-но-силовой микроскоп (АСМ) - наиболее активно используется для изучения биологических образцов микронного и субмикронного уровня организации благодаря простой процедуре пробоподготовки и возможности визуализации объектов практически в любой биологической среде.
Существование бактерий во многом зависит от влияния различных условий среды обитания. При воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды реализуются адаптационные свойства микроба, которые могут проявляться в обратимых или необратимых изменениях поверхностных структур клетки [1]. Они могут быть зарегистрированы с использованием ряда методов микроскопической техники, в том числе атомно-силовой микроскопии (АСМ) [2]. АСМ позволяет оценить морфологические и механические параметры бактерий, изменяющиеся под влиянием биотических и абиотических факторов.
Так, под действием катионных антимикробных пептидов, например магаинина 2, отмечено изменение упруго-механических свойств Escherichia coli: снижение значений модуля Юнга на 25,89 % [3]. Для клеток Bacillus cereus снижение этого показателя составило 41,44 % [3]. Действие антибиотика ампициллина на клетки B.cereus вызывало несколько типов изменений у микробной клетки, которые стало возможно оценить с помощью АСМ не только качественно, но и количественно. При сравнении с контрольными показателями часть бактериальных клеток изменила свои линейные размеры в сторону снижения длины в 1,2—1,7 раза, увеличения ширины в 1,8—2,0 раза, некоторые клетки при-
© Ерохин П. С., Уткин Д. В., Осина Н. А., Бойко А. В., Кузнецов О. С., Куклев В. Е., Бугоркова Т. В., 2016
няли сферическую форму. Другой показатель поверхности клеточной стенки - шероховатость (Rq) возрос до 11,37±3,54 нм, что в 4-5 раз превышает контрольные значения [3]. Аналогичные результаты были получены с помощью АСМ и другими исследователями [4, 5]. Например, при изучении влияния ванкомицина и оритаванцина на Helicobacter pylori отмечено резкое снижение линейных размеров клеток и увеличение шероховатости их поверхности [4].
При использовании полуконтактного метода, а также методов рассогласования и отображения фазы в реальном времени была изучена морфология клеточной стенки бактерий, обработанных катионным антимикробным пептидом (КАМП) или пептидом СМ 15 [2, 6]. Установлено, что в клетке происходит формирование пор диаметром от 2 до 4 нм, а также увеличивается средняя квадратичная шероховатость их поверхности. При этом действие препаратов на грамположительные бактерии проявлялось в меньшей степени, чем на грамотрицательные [2, 6].
С помощью полуконтактного метода и метода постоянной высоты АСМ рядом исследователей выявлена зависимость степени разрушения клеток E.coli от концентрации и времени воздействия антибиотика на патогенные микроорганизмы [7, 8]. Ранее нами с помощью бесконтактного режима АСМ (в жидкости) показано, что при воздействии неомицина В сульфата и гентами-цина на штаммы E.coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa наблюдалось снижение высоты (толщины) бактерий на 50% через 33 мин экспозиции [8]. Кроме того, для каждого вида бактерий минимальная концентрация антибактериального препарата, оказывающего влияние на клетку, была различной. Были установлены минимальные концентрации антибиотика, влияющие на микробную клетку для каждого вида бактерий [8].
Под воздействием антибиотиков происходили изменения не только толщины бактерий, но и индекса I (соотношение ширины бактерий к их высоте), которые указывают на запуск защитных механизмов бактериальной клеткой, а также увеличение шероховатости поверхности клетки и силы адгезии. При этом изменение последних показателей зависело от степени воздействия антибактериальных препаратов. Максимальное воздействие оказывал антибактериальный препарат в концентрациях от 20 до 40 мкг/мл.
Под воздействием муцина в различных физиологических условиях - на воздухе, в воде и среде культивирования наблюдаются изменения линейных размеров E.coli и Proteus mirabilisR45
[9], например, длины, длины и ширины. Более того, с применением методов постоянной высоты АСМ и туннельной микроскопии была установлена динамика изменений длины, ширины и высоты в зависимости от физиологических условий - на воздухе, в воде и среде культивирования.
Метод модуляции силы также был успешно использован для изучения адгезионного взаимодействия химиотерапевтических веществ с поверхностью различных материалов, а также для изучения лекарственного и других воздействий факторов внешней среды на микроорганизмы [10, 11] - антибактериальных препаратов и ин-терферонов.
В настоящее время накоплен достаточно большой опыт использования атомно-силовой микроскопии для оценки воздействия на бактериальную клетку неорганических и органических веществ, биологически активных соединений, а также вирусных частиц (на примере бактериофагов).
С использованием метода рассогласования АСМ [12] было изучено взаимодействия холерных бактериофагов со штаммами V.cholerae. Установлено, что через 30 мин инкубации диагностических бактериофагов с вибрионами происходят заметные изменения клеточной стенки с максимальной адсорбцией фаговых частиц на поверхности клеток и началом выхода фагов наружу. Через 60 мин наблюдается разрушение клеток бактерий [12].
Изменение рН среды обитания микроорганизмов может вызывать различные реакции. Так, бактерии Shigella sonnei ATCC25931, находящиеся в кислой среде (рН 3,5) в течение 60 мин, формируют защитный слой [13].
На адгезию клеток к поверхностям оказывают влияние условия роста микроорганизма. С помощью методов АСМ различными авторами показано, что при кислых значениях рН среды микроорганизмы более активно прикрепляются к поверхности субстрата [13, 14].
При определении адгезии клеток Azospirillum brasilense к подложке в условиях роста в течение 2 ч при температуре 30 °С и в течение 24 ч при 40 °С методом модуляции силы, Fadh составила 0,8±0,2 и 0,2±0,02 нН соответственно [15].
При воздействии веществ, оказывающих влияние на адгезию грамположительных и грамо-трицательных (E.coli, S.aureus) бактерий, например клюквенного сока, выявлено существенное снижение показателя силы адгезии для E.coli, но не для S.aureus [16].
В последние годы пристальное внимание уделяется вопросам взаимодействия углеродных
Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2016. Т. 16, вып. 2
наноматериалов с биологическими объектами [17], в частности с микроорганизмами.
Рядом авторов на модели грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий показано влияние различных веществ (хитозана, наноча-стиц ZnO, фуллеренов C60) на клеточную поверхность, вызывающих ее изменения [18-21]. Установлено, что при воздействии хитозана с молекулярной массой 628 кДа происходит снижение линейных размеров модельных микроорганизмов в 1,8-2,3 раза [19]. При исследовании влияния фуллеренов на микробную клетку отмечено увеличение проводимости клеточной стенки до 32,3% в зависимости от концентрации частиц [21].
Особый интерес представляют данные, полученные при изучении процесса прорастания спор в благоприятных условиях (при наличии воды и питательных веществ). Размер спор был определен ранее - 1,2-1,27^0,74-0,8 мкм [15, 22]. Авторы в своей работе показали, что в процессе герминации спор их размер увеличивается с 0,8-0,9 мкм до 3,4-3,8 мкм за 3 ч [22, 23]. Кроме того, меняется архитектоника поверхности клетки: изменяются борозды на поверхности спор в процессе их прорастания [22, 24].
На модели E.coli, Bacillus subtilis с помощью атомно-силовой микроскопии показано воздействие 2,5% глутаральдегида, 10% формалина, 4% параформальдегида, а также смеси метанол/ ацетон в соотношении 1:1 и этанол/уксусная кислота в соотношении 3:1. Установлено, что из всех вариантов химического воздействия на микробную клетку только 2,5% глутаральдегид полностью сохраняет ультраструктуру микробной клетки и может быть использован в качестве фиксатора [25, 26]. Эффективность использования глутарового альдегида для фиксирования была также показана рядом исследователей.
Проведенные нами исследования показали, что под влиянием биогенного амина серотонина на клетки F.tularensis 15НИИЭГ в них наблюдается увеличение толщины слоя капсулоподобного вещества в 5,8 раза по сравнению с контролем: 196,5 и 33,4 нм соответственно [27].
Такие изменения в клетке туляремийного микроба могут быть связаны с одним из механизмов повышения устойчивости возбудителей инфекционных болезней к стрессовым факторам, что связано с продукцией на поверхности клеток дополнительного экзополисахаридного слоя (ЭПС) [28].
Методами контактной АСМ изучены упругие свойства бактерий, входящих в состав био-
пленки в условиях неблагоприятного действия NaCl на E.coli, B.subtilis, Micrococcus luteus, Pseudomonasputida. Установлено, что сила жесткости варьировала в диапазоне от 0,16±0,1 Н/м до 0,41±0,1 Н/м [29].
Ранее нами было показано, что максимальное увеличение индекса I, отражающего защиту бактериальной клетки от воздействия неблагоприятного фактора, в 1,75 раза наблюдается под воздействием 3М гипертонического раствора хлорида натрия в течение 120 мин [30]. Такая же зависимость наблюдалась для показателей шероховатости и силы адгезии: увеличение по сравнению с нормой в 1,8 и 1,5 раза соответственно.
Таким образом, представленные выше сведения отечественных и зарубежных исследователей, а также данные, полученные нами ранее, показывают, что под воздействием биотических и абиотических факторов происходят изменения ряда параметров ультраструктуры поверхности бактериальных клеток: шероховатости, индекса I, силы адгезии, силы жесткости, а также морфоме-трических показателей: толщины, высоты, длины. Качественная и количественная оценка данных показателей может быть успешно выполнена с использованием разнообразных методов АСМ.
Благодаря своим возможностям данный тип микроскопической техники может быть использован для комплексной оценки состояния бактериальных клеток в различных условиях существования и при разнообразных воздействиях, в том числе антибактериальных и антисептических препаратов, при тестировании новых химических соединений в качестве дезинфицирующих средств, изучении специфического лизиса бактерий бактериофагами, осмотическом стрессе и других воздействиях.
Список литературы
1. Rhen M., Eriksson S., Pettersson S. Microbial manipulation of innate immunity responses // Curr. Opin. in Microbiol. 2000. Vol. 3. P. 60-64.
2. ВасильченкоА. С. Исследование морфо-функциональ-ной реакции бактерий на различные воздействия с использованием атомно-силовой микроскопии : автореф. дис. ... канд. биол. наук. Пермь, 2012. 22 с.
3. Nikiyan H., Vasilchenko A., Deryabin D. AFM investigations of various disturbing factors on bacterial cells // Formatex. 2010. P. 523-529.
4. Domenech O., Francius G., Tulkens P. M, Bambeke F. V., Durfene Y., Mingeot-LeclercqM.-P. Interactions of orita-vancin, a new lipoglycopeptide derived from vancomycin, with phospholipid bilayers : effect on membrane permeability and nanoscale lipid membrane organization // Biochim. et Biophys. Acta. 2009. Vol. 1788. P. 1832-1840.
188
Научный отдел
5. Couture-TosiE., Ranch J.-L., Haustant G., Pehau-Arnau-det G., Sachse M. Cemovis on a pathogen : analysis of Bacillus anthracis spore // Biol. Cell. 2010. Vol. 102. P. 609-619.
6. Ouberai M., Garch F. E., Bussiere A., Riou M., Alste-ensD., Lins L., Baussanne I., Dufrene Y. F., BrasseurR., Decout J.-L., Mingeot-LeclercqM.-P. The Pseudomonas aeruginosa membranes: a target for a new amphiphilic aminoglycoside derivative? // Biochim. et Biophys. Acta. 2011. Vol. 1808. P. 1716-1727.
7. Braga P. C., Ricci D. Atomic force microscopy : application to investigation of Escherichia coli morphology before and after exposure to cefodizime //Antimicrob. Agents and Chemother. 1998. Vol. 42, № 1. P. 18-22.
8. Ерохин П. С., Уткин Д. В., Кузнецов О. С., Коннов Н. П., Осина Н. А. Применение атомно-силовой микроскопии для определения воздействия антибактериальных препаратов на микробную клетку (на примере E.coli и цефалоспоринов I поколения) // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Физика. 2013. Т. 13, вып. 2. С. 28-33.
9. Hammer M. U., Brauser A., Olah C., Bresesinshi G., Goldmann T., Gustmann T., Andra J. Lipopolysaccharide interaction is decisive for the activity on the antimicrobial peptide NK-2 against Escherichia coli and Proteus mura-bilis // Biochem. J. 2010. Vol. 427. P. 477-488.
10. Narayan G. P., Kartih V., Manoj P., Singh P. S., Alha G. Antibacterial activities of ethanolic extracts of plants used in folk medicine // IJRAP. 2010. Vol. 1, № 2. P. 529-535.
11. Schwarzenbach M. S., Reimann P., Thommen V., Hergen M., Mumenthaler M., Guntherodt H.-J. Interferon a-2a interactions on glass vial surfaces measured by atomic force microscopy // J. of Pharm. Sci. and Technol. 2002. Vol. 56, № 2. P. 78-89.
12. Уткин Д. В., Ерохин П. С., Осина Н. А., Коннов Н. П. Оценка фаголизабельности штаммов холерных вибрионов с использованием атомно-силовой микроскопии // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2013. Т. 13, вып. 3. С. 81-84.
13. EllafiA., HarbiB., LaghaR., Bahhrouf A. The combined effects of starvation and pH on the virulence of Shigella sonnei ATCC25931 //Afr. J. of Biotechnol. 2013. Vol. 12, iss. 16. P. 2034-2040.
14. Teixeira P., Lima J., Azeredo J., Oliveira R. Adhesion of Listeria monocytogenes to materials commonly found in domestic kitchens // Intern. J. of Food Sci. and Technol. 2008. Vol. 43. P. 1239-1244.
15. GaboriaudF., Dufrene Y. F. Atomic force microscopy of microbial cells: application to nanomechanical properties, surface forces and molecular recognition forces // Coll. and Surf. B : Bioint. 2006. Vol. 54. P. 1-10.
16. Abu-Lail L., Tao Y., Pinzon-Arango P. A., Howell A., Camesano T. A. Using atomic force microscopy to measure anti-adhesion effects on uropathogenic bacteria, observed in urine after cranberry juice consumption // J. of Biomat. and Nanobiotech. 2012. Vol. 3. P. 533-540.
17. Никиян А. Н., Татлыбаева Е. Б. Успехи и перспективы развития атомно-силовой микроскопии в микробиологии // Вестн. ОГУ. 2014. № 6, вып. 167. С. 112-119.
18. Wang C., Liu L.-L., Zhang A.-T., Xie P., Lu J.-J., Zou X.-T. Antibacterial effects of zinc oxide nanoparticles
on Escherichia coli K88 // Afr. J. of Biotechnol. 2012. Vol. 11, № 44. P. 10248-10254.
19. Fernandes J. C., Eaton P., Gomes A. M., Pintado M. E., Malcata F. X. Study of the antibacterial effects of chito-sans on Bacillus cereus (and it's spores) by atomic force microscopy imaging and nanoidentation // Ultramicr. 2009. Vol. 109. P. 854-860.
20. Дерябин Д. Г., Васильченко А. С., Алешина Е. С., Тлягу-лова А. С., Никиян А. Н. Исследование взаимодействия углеродных наноматериалов с клетками Escherichia coli методом атомно-силовой микроскопии // Рос. на-нотех. 2010. Т. 5, № 11-12. С. 136-141.
21. Fang J., Lyon D. Y., Wiesner M. R., Dong J. P., Alvarez P. J. J. Effect of a fullerene water suspension on bacterial phospholipids and membrane behavior // Environ. Sci. Technol. 2007. Vol. 41. P. 2636-2642.
22. Chada V. G. R., SanstadE. A., WangR., DriksA. Morphogenesis of Bacillus spore surfaces // J. of Bacteriol. 2003. Vol. 185, № 21. P. 6255-6261.
23. Ильина Т. С., Романова Ю. М., ГинцбургА. Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина : феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. 2004. № 40. С. 1-12.
24. Zaman M. S., Goyal A., Dubey G. P., Gupta P. K., Chandra H., Das T., Ganguli M., Singh Y. Imaging and analysis of Bacillus anthracis spore germination // Microsc. Res. Tech. 2005. Vol. 66, № 6. P. 307-311.
25. Chao Y., Zhang T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. Vol. 92. P. 381-392.
26. КухтевичИ. В.,ЖуковМ. В., Чубинский-НадеждинВ.И. Фиксация бактерий E. coli на подложке для измерений в жидкости методом атомно-силовой микроскопии // Науч. приборостроение. 2012. Т. 22, № 4. С. 56-61.
27. Клюева С. Н., Щуковская Т. Н., Ерохин П. С., Уткин Д. В. Оценка влияния биогенного амина серотони-на на морфологию туляремийного микроба методом атомно-силовой микроскопии // Материалы XVIII Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел. МО, Черноголовка, 2013. С. 470-471.
28. Wai S. N., Mizunoe Y. A., Kawabata T. S., Yoshidа S. Vibrio cholerae O1 strain TSI-4 produces the exopoly-saccharide materials that determine colony morphology, stress resistance, and biofilm formation // Appl. Environ. Microbiol. 1998. Vol. 64. P. 3648-3655.
29. Volle C. B., FergusonM. A., AidalaK. E., Spain E. M., Nunes M. E. Spring constants and adhesive properties of native bacterial biofilm cells measured by atomic force microscopy // Coll. and Surf. B: Bioint. 2008. Vol. 67, iss. 1. P. 32-40.
30. Ерохин П. С., Заднова С. П., Крепостнова И. М., Коннов Н. П., Уткин Д. В., Кузнецов О. С. Изучение динамических характеристик поверхностной структуры типичных штаммов Vibrio cholerae биовара Эльтор и их геновариантов методом атомно-силовой микроскопии // Материалы Рос. конф. по электрон. микроскопии - XXV. МО, Черноголовка, 2014. Т. 2. С. 580-581.
