CC BY
517
DOI: 10.23868/201811029
современное патогенетическое лечение и разработка новых методов генной и клеточной терапии муковисцидоза
С.А. Смирнихина1, А.В. Лавров1, 2
1 Медико-генетический научный центр, Москва, Россия
2 Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова, Москва, Россия
modern pathogenesis-based methods and development of new gene and cell-based methods for cystic fibrosis treatment
S.A. Smirnikhina1, A.V. Lavrov1, 2
1 Research Centre for Medical Genetics, Moscow, Russia
2 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia
e-mail: smirnikhinas@gmail.com
Муковисцидоз — моногенное аутосомно-рецессивное заболевание, вызываемое мутациями в гене CFTR. До недавнего времени терапия муковисцидоза сводилась к симптоматическому лечению респираторных инфекций и мальабсорбции. В последние годы произошел существенный прогресс в патогенетической терапии заболевания, а также возникли предпосылки для развития новых методов генной терапии. В обзоре рассмотрены современные методы лечения муковисцидоза, часть из которых уже используется в клинике (патогенетическая терапия модуляторами CFTR), другая часть — только развивается (генная терапия, в том числе геномное редактирование, и клеточная терапия).
ключевые слова: муковисцидоз, CFTR, модуляторы CFTR, геномное редактирование, генная терапия, CRISPR/Cas9, рР508(^е1.
Введение
Муковисцидоз (МВ) — тяжелое системное моногенное заболевание, в основе которого лежит дисбаланс ионов хлора. Тяжесть клинической картины обусловлена главным образом поражением легких и желудочно-кишечного тракта. Нарушение функции легких, рецидивирующие легочные инфекции, нарушения работы желудочно-кишечного тракта — ферментативная недостаточность и синдром мальабсорбции — все это влияет на качество и продолжительность жизни пациентов. К развитию заболевания приводят мутации в гене CFTR, кодирующем трансмембранный белок-регулятор проведения ионов хлора (CFTR), влекущие нарушение строения канала ионов хлора CFTR [1]. Ионный канал функционирует на апикальной мембране эпителиальных клеток, обеспечивает транспорт ионов хлора, а также бикарбонатов [2, 3]. Мутация p.F508del (делеция фенилаланина в 508 положении) — самая частая у больных МВ, 35 % из них являются гетерозиготными носителями мутации, а 38 % — гомозиготными [4]. Данная мутация обусловливает нарушение пост-трансляционной модификации белка, запускается процесс деградации белка CFTR, в результате которого его молекула либо полностью разрушается, либо становится функционально неполноценной и нестабильной [5, 6]. Вследствие отсутствия или дефектов белка CFTR развивается эпителиальная дисфункция и нарушение функций дыхательной системы, поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта и репродуктивной системы [7].
Симптоматическая терапия
Многие годы единственным доступным лечением МВ была симптоматическая терапия, направленная как на облегчение симптоматики, так и на предотвращение развития осложнений. Основные задачи симптоматической терапии — борьба с легочными инфекциями
Cystic fibrosis is a monogenic autosomal recessive disorder caused by mutations in CFTR gene. Until recent days, cystic fibrosis therapy was limited to symptomatic treatment of respiratory infections and malabsorption. In last years pathogenetic therapy of the disease received significant progress and premises for development of new methods of gene therapy came into sight. In the review, modern methods of cystic fibrosis treatment are considered, some of them are already used in the clinic (pathogenesis-based therapy with CFTR modulators), while the other part is only developing (gene therapy, including genome editing and cell therapy).
Keywords: cystic fibrosis, CFTR, CFTR modulators, genome editing, gene therapy, CRISPR/Cas9, p.F508del.
(антибиотики и противовоспалительная терапия, брон-ходилататоры, муколитики и отхаркивающие средства) и синдромом мальабсорбции (фермент-заместительная терапия для нормализации функции желудочно-кишечного тракта) [8]. Для профилактики осложнений активно используют физические упражнения, физиотерапию, ви-тамино- и диетотерапию. Классическая симптоматическая терапия не является предметом рассмотрения данной статьи, более детально этот вопрос освещен в ранее опубликованных работах [9, 10].
Развитие симптоматической терапии позволило в значительной мере увеличить продолжительность и качество жизни больных МВ. Однако, несмотря на очевидные успехи симптоматической терапии, она не позволяет полностью остановить развитие заболевания.
Новые подходы в лечении больных МВ — патогенетическая терапия и функциональная коррекция мутаций
Мутации гена CFTR разделяют на 5 классов, но некоторые исследователи выделяют 6 и даже 7 классов мутаций (табл. 1) [11]). Для коррекции эффектов одних мутаций разработаны препараты, уже внесенные в стандартные схемы лечения. Для коррекции эффектов других мутаций препараты только разрабатываются. Все новые патогенетические препараты могут быть разделены на три основные группы: 1) супрессоры преждевременной остановки трансляции белка (препарат аталурен); 2) корректоры фолдинга и процессинга белка (например, люмакафтор); 3) потенциаторы проводимости и открыва-емости ионного канала (препарат ивакафтор).
Одним из первых патогенетических препаратов, предложенных для лечения муковисцидоза, был аталу-рен, под действием которого происходит пропуск стоп-кодона РНК-полимеразой и продолжение транскрипции
Таблица 1. Классификация мутаций в гене CFTR (адаптировано из [11])
Класс мутаций Ia
Ib
II
III
IV
V
VI
Дефект
Терапия
Одобренные
лекарственные
препараты
Степень тяжести лечения
Нет мРНК
Нет
Нет
Нет белка
Нет транспорта белка
Нарушено открытие канала
Уменьшена проводимость канала
Восстановление Восстановление Восстановление Восстановление трансляции транспорта активности активности
канала канала
Мало белка
Коррекция сплайсинга
Белок не стабилен
Увеличение стабильности
Нет Корректоры Потенциаторы Потенциаторы Антисмысловые Стабилизаторов
олигонуклеотиды, нет
корректоры, потенциаторы?
Более тяжёлое течение Менее тяжёлое течение
гена. Препарат разработала компания PTC Therapeutics (США) для лечения миодистрофии Дюшенна, вызванной нонсенс мутациями. Аталурен был зарегистрирован под торговой маркой Трансларна на территории Евросоюза. Поскольку при МВ также есть больные с нонсенс-мутациями, действие препарата была проверено на этой группе больных. К сожалению, препарат оказался неэффективен [12, 13]. Таким образом, в настоящее время препараты-супрессоры для лечения больных с нонсенс мутациями при муковисцидозе отсутствуют.
В последние годы большие надежды возлагают на группу препаратов модуляторов (корректоров и потен-циаторов), которые компенсируют последствия мутаций — корректоры улучшают созревание белка CFTR, потенциаторы — усиливают открытие ионного канала CFTR. Первый препарат данной группы, одобренный FDA в 2012 г., ивакафтор (VX-770, Калидеко, Vertex Pharmaceuticals, Германия), относящийся к потенциаторам, усиливает открытие ионного канала CFTR на поверхности клетки через активацию аденилатциклазного пути [14-16]. Изначально ивакафтор был одобрен для лечения пациентов старше 2 лет с мутацией p.G551D, однако сейчас FDA выдало разрешение на использование препарата у пациентов с одной из 38 точковых мутаций, включая 5 мутаций сплайсинга [17]. Ивакафтор также был проверен у пациентов с гомозиготной мутацией p.F508del и показал незначительный эффект в уменьшении уровня хлоридов в потовой пробе, но не улучшил функцию легких [18].
Основной механизм действия корректоров — улучшение созревание белка CFTR за счет прямого связывания с ним, либо за счет адаптации белкового гомеостаза и уменьшения деградации белка [19]. Самым известным корректором является люмакафтор (VX-809). Показано, что данный препарат стабилизирует целый белок CFTR и ускоряет его перемещение на поверхность клеточной мембраны, а также способен частично восстанавливать функцию белка, стабилизируя N-концевой домен белка CFTR [20]. Несмотря на то, что данный препарат стабилизирует белок CFTR даже у пациентов с мутацией p.F508del, это, как и в случае с ивакафтором, приводит лишь к незначительному снижению уровня хлоридов в потовой пробе [21]. По этой причине люмакафтор, как и ивакафтор, не используется в монотерапии для лечения больных с мутацией p.F508del. Высвобожденные под действием люмакафтора на поверхность клетки молекулы CFTR являются единичными и неполноценными, поэтому для достижения клинического эффекта вместе с корректором необходимо принимать потенциатор, усиливающий открытие единичных ионных каналов CFTR и повышающих таким образом транспорт ионов.
Исходя из вышесказанного, очевидным было предположить, что ивакафтор и люмакафтор в комбинации будут существенно улучшать эффекты друг друга [22, 23]. Важным событием в терапии МВ стал выход на рынок в 2015 г. комбинированного препарата ивакафтор/ люмакафтор (Оркамби). Действительно, сочетание по-тенциатора и корректора позволило добиваться клинического эффекта у больных — носителей самой распространённой мутации при МВ — делеции фенилаланина в 508 положении [24]. Оркамби разрешен к применению у детей старше 6 лет и взрослых с гомозиготной мутацией p.F508del [25]. К сожалению, несмотря на свою эффективность, препарат необходимо принимать дважды в день пожизненно, и он имеет довольно широкий перечень побочных эффектов, которые могут ухудшать качество жизни пациентов. Кроме того, Оркамби эффективен только в случае одной мутации p.F508del, находящейся в гомозиготном состоянии, при сочетании мутации p.F508del с другой мутацией в гене CFTR препарат неэффективен [26, 27].
Комбинация ивакафтора с другим препаратом — те-закафтором (Симдеко) оказалась достаточно эффективна при лечении пациентов с гомозиготной мутацией p.F508del [28]. Однако после проведения клинического исследования фазы 3 компанией Vertex в марте 2018 г. тройной терапии (VX-659, тезакафтор, ивакафтор) было сделано заключение, что комбинированное использование VX-659, тезакафтора и ивакафтора еще более эффективно при лечении пациентов с гомозиготной мутацией p.F508del [29].
Важно отметить, что для лечения муковисцидоза часто требуется одновременный прием нескольких препаратов, и их взаимодействие может иметь решающее значение для эффективности терапии. Клиницисты должны знать не только о лекарствах, которые регулярно используются для лечения МВ, но особое внимание уделять новым комбинациям традиционных препаратов (рифам-пицин, азоловые противогрибковые средства и др.) с разработанными недавно патогенетическими препаратами (ивакафтор и люмакафтор/ивакафтор). Примечательно, что новые препараты (Калидеко и Оркамби) продемонстрировали синергическую активность против высоко полимиксин-резистентных штаммов P. aeruginosa и могут быть использованы в борьбе с некоторыми неизлечимыми инфекциями легких при МВ [30]. Аспекты лекарственного взаимодействия подробно рассмотрены в обзоре C. Jordan с соавт. (2016) [31], авторы подчеркивают, что для оказания помощи больным при МВ необходимо персонализированное ведение пациентов и постоянное участие фармацевтов и фармакологов.
Эффективность препаратов исследуют в группах пациентов с разными мутациями в гене CFTR и в случае положительных результатов фазы 3 клинических испытаний вносят эти мутации в список мутаций, при которых показан данный препарат. Страховые компании покрывают стоимость лечения только тем больным, у которых есть мутации, внесенные в этот список.
Что касается редких мутаций, наши знания о функциональных эффектах препаратов могут быть ограниченными или искаженными, что часто препятствует назначению корректных лекарств. Кроме того, несмотря на то, что препараты могут демонстрировать эффективность in vitro в отношении редких мутаций, полномасштабные клинические исследования таких препаратов невозможны из-за ограниченного числа пациентов, а значит эти мутации не будут внесены в список одобренных мутаций и страховые компании не будут оплачивать лечение больных с редкими мутациями. Например, у больных с МВ есть редкая мутация p.P67L, которую ранее связывали с аномалиями проводимости канала [32], но в недавних исследованиях было установлено, что в результате мутации p.P67L нарушается строение ионного канала, созревание белка CFTR, его транспорт на поверхность клетки, а проводимость не нарушается [32]. Также авторы продемонстрировали, что ивакафтор и люмакафтор могут активировать белок CFTR в случае мутации p.P67L в культуре эпителиальных клеток верхних дыхательных путей человека. Однако назначение лекарств для коррекции мутаций в данном случае ограничено высокой стоимостью препаратов, т. к. страховые компании не покрывают стоимость терапии [32]. Тем не менее, успешный опыт применения патогенетических препаратов у пациентов, не имеющих мутаций [33], свидетельствует о необходимости пересмотра требований к показаниям по использованию новых лекарств для лечения орфан-ных заболеваний. Более подробное обсуждение истории развития, тестирования, фармакологии, побочных эффектов, новых вопросов и проблем из противоречивых литературных отчетов доступно в обзоре с очень говорящим названием «Могут ли пациенты с муковисцидо-зом наконец начать дышать с помощью Люмакафтор/ Ивакафтор?» [34].
Таким образом, на основании имеющейся информации можно считать, что доступное патогенетическое лечение является большим прорывом в разработке терапии пациентов с МВ. Однако действие зарегистрированных препаратов направлено на коррекцию эффектов лишь небольшого числа мутаций, вызывающих заболевание, в то время как существует около 2000 мутаций, которые, как известно, приводят к МВ [35]. Кроме того, эти препараты очень дорогие, имеют значительные побочные эффекты, и их нужно применять регулярно на протяжении всей жизни. Следовательно, необходимы новые этиотропные методы лечения, и генная терапия, очевидно, является единственной, которая теоретически может вылечить больных с МВ.
Генная терапия
Генная терапия — группа методов, заключающихся в переносе нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в клетки с целью заместить дефект, вызванный мутацией в гене. кДНК нормального гена CFTR часто используется как донорная нуклеиновая кислота для генной терапии МВ [36-38]. Для переноса кДНК в клетки применяют различные методы, которые можно разделить на две группы: вирусные и невирусные. В табл. 2 представлены ключевые клинические исследования по генной терапии МВ, зарегистрированные в США [39]. Детальную
информацию о других клинических исследованиях можно найти в трех обстоятельных обзорных работах, опубликованных ранее [36-38].
Вирусные методы доставки нуклеиновых кислот в клетки in vivo более эффективны, чем невирусные [62], поэтому первые клинические исследования проводились с их использованием. Аденовирусные векторы (АдВ), несущие нормальный ген CFTR, были протестированы в нескольких клинических исследованиях, но показали низкую эффективность (трансдуцируются <1 % эпителиальных клеток) из-за отсутствия необходимых рецепторов на апикальной поверхности эпителиальных клеток дыхательных путей человека [36, 40, 41, 44]. Еще одним недостатком аденовирусных векторов является дозо-зависимое усугубление воспалительных процессов дыхательных путей у пациентов с МВ [36, 37, 40, 41, 44], что ограничивает повторные введения. В отличие от аденовирусного вектора, аденоассоциированные векторы (ААВ) демонстрируют лучшую переносимость у пациентов с МВ. Этот тип векторов не вызывает локального воспаления или других связанных с иммунитетом побочных эффектов, за исключением повышения уровня IL-1 0, даже при многократном введении [48, 51, 52, 54]. Тем не менее, общая эффективность ААВ ниже, чем АдВ: в исследованиях in vivo не удалось обнаружить ни мРНК, доставляемую вектором [46, 51 , 52], ни экспрессию трансгена [53, 54]. Функциональные тесты также выявили отсутствие клинического эффекта: не получено различий в спирометрических показателях у пациентов, получавших терапию, с группой контроля [54]. Низкая эффективность переноса гена у человека с помощью ААВ может быть обусловлена затрудненной диффузией ААВ через мокроту пациентов с МВ [63] или бактериальной инфекцией, снижающей эффективность доставки генов с применением ААВ [64]. Лентивирусные векторы не были протестированы в протоколах генной терапии МВ, однако группа под руководством профессор E.W. Alton с соавт. в 2017 г. анонсировали начало нового клинического исследования с использованием этого вектора [65]. Отмечается, что в доклинических испытаниях на мышах этот вектор показал высокую эффективность и низкую токсичность.
Невирусные методы доставки гена CFTR также были опробованы для лечения МВ. Почти все они демонстрировали обратимый перенос гена и очень короткие временные интервалы изменения транспорта ионов хлора [42, 66]. Так как невирусные методы безопасны и хорошо переносятся пациентами [66], возможно проводить повторные введения комплексов ДНК/липид для лечения МВ. Группа под руководством профессора E.W. Alton (2015-2016) получила многообещающие результаты, применяя ежемесячный (1 раз в месяц) липосом-опосре-дованный перенос гена CfTr (pGM169/GL67A) с помощью небулайзера. Исследование выявило клинический эффект, заключающийся в улучшении объема форсированного выдоха за 1 сек. и форсированной жизненной емкости легких [57, 58]. Однако, несмотря на то, что полученные результаты показали статистически значимое улучшение некоторых клинических характеристик, эти изменения были не очень заметными.
Эффективность генной терапии, вероятно, можно увеличить за счет ее комбинации с существующими препаратами, например, потенциаторами CFTR [58].
Недавно ProQR Therapeutics (США) начала два клинических исследования по коррекции гена CFTR, опосредованной РНК, одно из которых (NCT02564354) на сегодняшний день уже завершено. Метод основан на интраназальном введении одноцепочечной
таблица 2. Наиболее важные клинические исследования по генной терапии МВ [по 38 с изм.]
Идентификатор на clinicalTrials.gov
Год начала исследования
Название
Краткое описание
Ссылка
NCT00004779
NCT00004471
NCT00004806
NCT00004287
NCT00004533
NCT00073463
NCT00789867
1993 Phase I Pilot Study of Ad5-CB-CFTR, an Adenovirus Vector Containing the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene, in Patients With Cystic Fibrosis
1995 Phase I Pilot Study of Gene Therapy for Cystic Fibrosis Using Cationic Liposome Mediated Gene Transfer
1995 Phase I Study of Liposome-Mediated Gene Transfer in Patients With Cystic Fibrosis
1995 Phase I Study of the Third Generation Adenovirus H5.001CBCFTR in Patients With Cystic Fibrosis
1999 Phase I Randomized Study of Adeno-Associated Virus-CFTR Vector in Patients With Cystic Fibrosis
2003 Safety and Efficacy of Recombinant Adeno-Associated Virus Containing the CFTR Gene in the Treatment of Cystic Fibrosis
2008 Single Dose
of pGM169/GL67A in CF Patients
В исследовании использовали [40, 41]
аденовирусный вектор с нормальным геном CFTR, который вводили интраназально 12 пациентам. Показано, что у пациентов развилось локальное воспаление слизистой оболочки, а эффективность терапии была очень низкой (вектор обнаруживался в <1 % эпителиальных клеток).
Пациентам вводили комплекс липид/ДНК [42] (pGT-1 lipid complex] с помощью инстилляции шприцем более 30 минут в правый нижний носовой ход. В исследовании показана возможность частичного восстановления перфузии Cl- у пациентов с МВ после введения кДНК CFTR, однако все эти изменения носили обратимый характер и не определялись через 7 дней.
Комплекс гена CFTR с липидом (DMRIE/ [43]
DOPE] вводили в правый нижний носовой ход. Результаты работы не были опубликованы.
Одиннадцати пациентам с МВ вводили [44]
нормальный CFTR с помощью аденовирусного вектора через бронхоскоп. Показана низкая эффективность генной доставки (<1 % эпителиальных клеток бронхов) и выраженный иммунный ответ.
В работе использовали рекомбинантный [45-52]
аденоассоциированный вирусный вектор
(рААВ) с нормальным геном CFTR,
который вводили с помощью небулайзера
25-ти пациентам с МВ. Вектор хорошо
переносился пациентами, за исключением
повышения уровня 11_-10, однако обнаружить
вектор в клетках не удалось.
Рекомбинантный ААВ вектор, несущий кДНК [53, 54] CFTR (tgAAVCF) вводили с помощью аэрозоля 51 пациенту с МВ, сравнивая их с группой плацебо (п=51). tgAAvCF был безопасен и хорошо переносился пациентами, однако разницы в спирометрических характеристиках между группами пациентов не было получено. Из-за отсутствия эффекта исследование было остановлено.
Плазмиду с геном CFTR в комплексе с катионным липидом 67 и вспомогательными липидами (pGM169/G_67A) вводили интраназально пациентам с МВ. Нет опубликованных результатов по этой работе, однако та же исследовательская группа инициировала новое клиническое исследование с повторяющимся введением pGM169/G_67A (1ЧСТ01621867), что говорит о том, что метод показал себя безопасным, однако малоэффективным при однократном введении.
[55, 56]
Идентификатор на clinicalTrials.gov Год начала исследования Название Краткое описание Ссылка
NCTG162186y
2G12
NCTG2564354
2G15
NCTG2532764
2G15
Repeated Application of Gene Therapy in CF Patients
Exploratory Study to Evaluate QR-010 in Subjects With Cystic Fibrosis AF508 CFTR Mutation
Dose Escalation Study of QR-010 in Homozygous AF508 Cystic Fibrosis Patients
pGM169/GL67A комплекс с геном CFTR [57, 58]
вводили пациентам с МВ с помощью
небулайзера. В исследование входило
116 пациентов (62 в исследуемой
группе и 54 в группе плацебо]. pGM169/
G67A вводили каждые 28 дней (±5]
на протяжении года. В исследовании показан
незначительный клинический эффект —
увеличение объема форсированного выдоха
за 1 сек. и форсированной жизненной
емкости легких.
Одноцепочечный антисмысловой РНК [59-61]
олигонуклеотид (QR-010), вводимый
интраназально, был использован как
матрица для редактирования мРНК гена
CFTR. В исследование вошло 18 пациентов
с МВ — 10 гомозигот с мутацией F508del
и 8 компаунд-гетерозигот. Показано, что
QR-010 безопасен, хорошо переносится
пациентами и восстанавливает функцию
CFTR в группе пациентов, гомозиготных
по мутации p.F508del.
Целью работы является выявление Нет
безопасности, переносимости данных
и фармакокинетики однократного и многократного введения QR-010. Исследование сейчас продолжается, в него включены 64 пациента с гомозиготной мутацией F508del.
антисмысловой РНК (eluforsen, QR-010], которая является матрицей для редактирования мРНК CFTR. Ранее в экспериментах in vitro и in vivo на мышах было показано, что диффузия QR-010 не нарушается в условиях МВ-подобной мокроты и наблюдаются положительные изменения в транспорте хлоридов [59-61]. ProQR Therapeutics заявляет, что QR-010 восстанавливает функцию CFTR в группе пациентов, гомозиготных по мутации p.F508del, но не компаунд-гетерозиготных [67].
К сожалению, перечисленные выше примеры применения генной терапии для лечения пациентов с МВ показывают очень низкую эффективность доставки тар-гетной молекулы в клетки верхних дыхательных путей, несмотря на хорошие результаты, полученные в доклинических исследованиях. Невозможность доставки гена CFTR приводит к отсутствию или чрезвычайно низкому клиническому эффекту, что не позволяет использовать эти методы в рутинной практике.
Геномное редактирование
Геномное редактирование — группа методов генной терапии, в основе которых лежит применение «программируемых» нуклеаз, то есть ферментов, под действием которых происходит двуцепочечный разрыв (ДЦР) ДНК в строго определенном месте в геноме [68]. Благодаря ДЦР, в месте мутации появляется возможность коррекции (исправления] данной мутации с помощью одного из способов репарации ДНК. Суть направленной гомологичной репарации (НГР) состоит в замещении поврежденного участка ДНК неповрежденной молекулой (до-норной ДНК]. В отсутствии матрицы для репарации ДЦР сшивается лигазой с образованием небольших вставок или потерь нуклеотидов — инделов [69].
ZFNs
Впервые метод геномного редактирования описан в 1996 г., и в его основе лежит использование нуклеаз цинковых пальцев ^№), соединенных с нуклеазой FokI [70]. Начиная с 2008 г., разные научные коллективы применяют ZFNs для разработки метода коррекции мутации p.F508del в гене CFTR. В первой работе М._. Maeder с соавт. (2008), проведенной на культурах клеток НЕК293 и К562, была продемонстрирована очень низкая эффективность образования инделов — 1,2 % и 0-2,6 % соответственно [71]. Ряд исследований, проведенных на иммортализованных эпителиальных клетках трахеи ^ТЕ) [72]) и бронхов ^ВЕ) [73]), полученных от пациентов с гомозиготной мутацией p.F508del, также показали, что данный локус CFTR довольно плохо поддается редактированию — частота инделов не превышала в среднем 8 % [72] и 14 % [73]. Попытки редактирования мутации p.F508del с помощью вставки короткого фрагмента выявили эффективность меньше 1 %, что, возможно, связано с большим расстоянием между самой мутацией и таргетными сайтами для ZFN в 200 п. о. [72]. Попытки вставки большего фрагмента, содержащего экзоны 11-27 гена CFTR, были более результативны — частота вставки в среднем составила 10 %, однако наблюдались случаи случайной интеграции этой вставки в другие гены, хоть это и не сопровождалось никакими побочными эффектами [73]. Последний описанный подход — вставка супер-экзона — позволяет избежать пациент-специфичного лечения и дает исследователю универсальный способ коррекции мутаций, локализованных в 10-м и последующих экзонах. Проведены также работы и на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК) [74, 75]. Первая работа [74] показала
возможность вставки кодирующей последовательности CFTR в ген CCR5, кодирующий поверхностный рецептор к хемокинам [76], не являющийся обязательным для нормальной дифференцировки и функционирования клеток. Авторы продемонстрировали успешность такого подхода увеличенной экспрессией CFTR с локуса CCR5 на протяжении 15 клеточных пассажей, сохранением плюрипо-тентности ИПСК, а также отсутствием неспецифических изменений в геноме [74]. Такой способ вставки гена CFTR также позволяет избежать пациент-специфического подхода в лечении МВ.
TALENs
В 2011 г. появился еще один метод геномного редактирования, основанный на использовании эндону-клеаз эффекторов, подобных активатору транскрипции (TALEN) [77]. На сегодняшний день существуют только три работы [78-80], описывающие его применение для коррекции мутации p.F508del, все они проведены на культурах ИПСК, полученных от пациентов с МВ с гомозиготной мутацией p.F508del. Исследователи, работающие с ИПСК, всегда сталкиваются с проблемой чрезвычайно низкой эффективности редактирования этого типа клеток, что заставляет использовать тот или иной вид селекции или обогащения редактированными клонами клеток. Несмотря на двухэтапную селекцию редактированных ИПСК M.V. Camarasa с соавт. (2016) обнаружили лишь 1,7-4,9х 10-5 эффективность коррекции мутации p.F508del в ИПСК с помощью донорной двух-цепочечной ДНК [78]. Группа исследователей под руководством D.C. Gruenert (2016) провела шестиэтапное обогащение культуры ИПСК методом отбора редактированных клонов на основе результатов положительной ПЦР на вставку фрагмента CFTR, однако даже 100-кратное обогащение не позволило получить эффективность редактирования мутации больше 10 % [79]. Недавно опубликована статья об успешной моноаллельной коррекции p.F508del в ИПСК, однако авторы обнаружили всего 5 клонов с исправленной мутацией [80]. Важно отметить, во всех работах было показано, что манипуляции с геномом ИПСК не приводят к каким-либо генетическим нарушениям, клетки сохраняют свой дифференцировоч-ный потенциал и свойства [78-80].
CRISPR/Cas9
Технология CRISPR/Cas является новым многообещающим подходом для таргетных манипуляций с геномом клеток и организмов. CRISPR/Cas система — естественная противовирусная защита прокариотов. CRISPR/ Cas9 — одна из шести систем CRISPR/Cas, наиболее подходящая для биотехнологического использования и большинство подходов геномного редактирования основаны на этой системе [81, 82]. CRISPR/Cas9 состоит из двух основных компонентов — CRISPR-ассоциированного белка 9 (Cas9) и направляющей РНК (sgRNA), подобранной комплементарно той последовательности ДНК, которую необходимо изменить. Под действием CRISPR/Cas9 происходит двуцепочечный разрыв ДНК, который далее ре-парируется тем или иным способом [83].
К настоящему времени опубликовано всего четыре работы, описывающие редактирование гена CFTR с помощью технологии CRISPR/Cas9 [84-87], три из которых [84-86] направлены на коррекцию мутации p.F508del. Первая работа была проведена G. Schwank с соавт. (2013) на органоидах, выращенных из биопта-та клеток кишечника от пациентов с МВ с гомозиготной мутацией p.F508del. С помощью липофекции органоиды трансфицировали плазмидами, содержащими
компоненты CRISPR/Cas9 и матрицу для гомологичной репарации p.F508del. В связи с низкой эффективностью редактирования авторы выполнили селекцию клеток со «скорректированной» мутацией и доказали, что уровень экспрессии CFTR восстановился, а белок CFTR функционирует. В работе было показано, что в большинстве клеток происходит исправление мутации только в одном аллеле [84]. Несмотря на поражение многих тканей и органов при МВ, наибольшую проблему в клиническом плане представляет поражение легких, поэтому наиболее актуально разрабатывать терапию, направленную на коррекцию легочных проявлений заболевания. В 2015 г. A.L. Firth с соавт. опубликовали работу, в которой описали создание линии ИПСК от пациентов с корректированной гомозиготной мутацией p.F508del, дифференцировку редактированных ИПСК в клетки респираторного эпителия и доказали функционирование белка CFTR после геномного редактирования. В этой работе также была проведена селекция клеток с редактированной мутацией, так как эффективность редактирования была чрезвычайно низкой [85]. Попытки исправить мутацию p.F508del также были предприняты in vitro на клеточной линии трахеального эпителия CFTE, однако в работе, J.A. Hollywood с соавт. (2016) была обнаружена низкая эффективность коррекции мутации — 1,9 %, что не позволяет использовать этот подход без селекции редактированных клеток [86].
Последняя на сегодня работа по редактированию гена CFTR с помощью технологии CRISPR/Cas9 сфокусирована на коррекции трех редких мутаций в гене CFTR [87] и, в отличие от предыдущих работ [84-86], редактирование происходит без использования матрицы для гомологичной репарации. Все три мутации находятся в интрон-ной области гена и представляют собой отсутствующие в норме акцепторы сплайсинга, которые приводят к тому, что в мРНК включаются псевдоэкзоны или удлиненные экзоны, либо сдвигающие рамку считывания, либо сами содержащие стоп-кодон, что приводит к терминации синтеза белка CFTR. Используя две направляющие РНК до и после мутации, можно с эффективностью 55-61 % вырезать участок интрона с мутацией и восстановить нормальный сплайсинг — получить 56-90 % нормальных транскриптов, в зависимости от мутации [87].
Геномное редактирование — недавно появившийся метод генной терапии, поэтому он пока не применяется in vivo у человека для лечения МВ. Результаты, полученные на культурах клеток in vitro, демонстрируют невысокую эффективность всех используемых подходов и в таком виде будут неэффективны при переносе их в живой организм. Необходимо либо переходить на вирусные способы доставки, например, с помощью безопасных аденоассоциированных векторов, либо развивать направление ex vivo, при котором клетки пациента редактируются in vitro и затем трансплантируются обратно.
Клеточная терапия
Клеточная терапия — способ лечения, основанный на применении разных типов клеток для восстановления органа или ткани. Клеточная терапия обычно ассоциируется с использованием различных стволовых клеток, которые условно можно разделить на аллогенные (эмбриональные стволовые клетки, стволовые клетки плаценты и амниона) и аутогенные (мультипотентные мезенхималь-ные стромальные (ММСК), индуцированные плюрипо-тентные стволовые (ИПСК) и прогениторные клетки) [88, 89]. Несмотря на различия в дифференцировочном потенциале и наличие специфических поверхностных маркеров, существует проблема точного определения типа
стволовых клеток и их производных перед трансплантацией [90], что существенно осложняет оценку и сопоставление результатов клинических испытаний.
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) — плюрипо-тентные клетки, полученные от эмбрионов, способные дифференцироваться в большинстве направлений [91]. Несмотря на имеющиеся данные о том, что ЭСК довольно можно индуцировать к дифференцировке в клетки дыхательного эпителия, клиническое применение такого подхода, с одной стороны, ограничено большой вероятностью образования тератом in vivo, а с другой стороны, необходимостью иммуносупрессии из-за аллогенной трансплантации [89].
ММСК — клетки, обладающие меньшим дифферен-цировочным потенциалом, однако большей биодоступностью, так как их можно получить из костного мозга, жировой ткани, пульпы зуба, амниона, пуповинной крови и многих других источников [89]. Источниками ММСК часто являются собственные ткани пациента, что обеспечивает аутогенную клеточную терапию. Существуют два основных подхода использования ММСК ex vivo: введение интактных клеток или их дифференцировка в клетки дыхательного эпителия с последующей трансплантацией. Было обнаружено, что неизмененные ММСК, введенные в организм, вызывая паракринные эффекты, способны модулировать противовоспалительный иммунитет у животных и человека при разных формах воспаления легких [89, 90, 92-96], а также могут приводить к реорганизации актинового цитоскелета, повышению экспрессии гена CFTR и улучшению транспорта ионов хлора в клетках линии CFBE41o- — клетках эпителия бронхов с гомозиготной мутацией p.F508del [95]. Несмотря на успехи доклинических исследований, клинические работы с введением различных типов стволовых клеток, как системно, так и непосредственно в легкие, демонстрируют незначительный и временный эффект [94, 96]. Второй подход — применение ММСК в качестве источника клеток эпителия дыхательных путей — используется реже из-за его низкой эффективности. Однако показано, что можно дифференцировать пациент-специфичные ММСК в клетки дыхательного эпителия методом их со-культивирования с клеточной культурой CFBE41o- [97].
ИПСК — плюрипотентные клетки, полученные из соматических клеток путем их репрограммирования [98]. Теоретически любая клетка взрослого организма может быть перепрограммирована в ИПСК, но чаще всего источником служат фибробласты кожи. ИПСК считаются отличной заменой ЭСК, так как позволяют использовать аутогенную трансплантацию и существуют эффективные протоколы дифференцировки ИПСК в CFTR-экспрессирующие клетки дыхательного эпителия [99, 1 00]. Тем не менее, по состоянию на апрель 201 8 г. не зарегистрировано ни одного клинического испытания клеточной терапии ИПСК у пациентов с МВ.
Прогениторные клетки — стволовые клетки, способные дифференцироваться в клетки того органа, из которого они получены. До появления ИПСК прогениторные клетки рассматривались как хороший аутогенный источник для регенерации легких. Клетки можно выделить из биоптата легкого, культивировать и трансплантировать обратно пациенту, предварительно отредактировав мутацию, вызывающую МВ [88]. Чаще всего такие клетки in vivo служат источником для образования дифференцированных клеток дыхательного эпителия. С появлением технологии перепрограммирования соматических клеток в ИПСК, работа с прогениторными клетками постепенно сходит на нет из-за сложности их получения, в отличие от фибробластов кожи.
Несмотря на огромный потенциал используемых клеток, существует большая проблема их доставки в организм человека и заселения ими легких. На модели повреждения легких (нафтален) было показано, что ЭСК человека можно доставить внутривенно и успешно заселить ими легкие мыши [101]. Позже на аналогичной модели повреждения легких мыши (нафтален и бусульфан) было продемонстрировано, что клетки костного мозга (КМ) возможно доставить в легкие ин-тратрахеально и они будут персистировать там на протяжении 6-12 мес. На животных с нокаутом CFTR после индуцированного химического повреждения легких было доказано, что клетки КМ с нормальным геном CFTR задерживаются в легких в течение 1-6 месяцев, приводя к появлению CFTR на апикальной поверхности эпителиальных клеток легких, однако уровень экспрессии CFTR увеличивается незначительно — до 6,9±5,5 % от нормы [102]. Процитированные работы демонстрируют возможность доставки клеток в легкие, однако эффективность этого метода не очень высокая [88].
Таким образом, существует несколько подходов клеточной терапии МВ, однако на текущий момент все они свидетельствуют о низкой эффективности in vivo, связанной с трудностью доставки клеток в пораженные легкие. После отдельных экспериментов большинство работ не были продолжены, ни одна из них так и не дошла до клинического испытания при лечении МВ.
Заключение
Комбинированная симптоматическая терапия позволила увеличить среднюю продолжительность жизни пациентов с МВ с 5 до 37 лет [103]. Появление новых патогенетических препаратов, модулирующих CFTR дает надежду на существенное улучшение прогноза жизни пациентов в ближайшие годы. Однако, не следует забывать о том, что применение потенци-аторов и корректоров ограничено определенным перечнем мутаций, который пополняется из года в год, но все еще не охватывает всех пациентов с МВ. Кроме того, стоимость такого лечения довольно высока, и в России лечение этими препаратами не финансируется государством. Еще одним недостатком патогенетической терапии является то, что такой подход не устраняет причину заболевания, тем самым заставляя пациента пожизненно принимать препараты, снижающие качество жизни из-за побочных эффектов. Этиотропная терапия, особенно с помощью геномного редактирования, теоретически может стабильно корректировать мутацию, приводящую к развитию заболевания, и тем самым вылечить больного. К сожалению, низкая эффективность генной терапии пока не позволяет использовать ее у человека, необходимо продолжать разрабатывать более эффективные способы доставки и коррекции гена. Быстрое развитие технологий геномного редактирования дает возможность прогнозировать существенное улучшение в этой области в ближайшие годы.
Благодарности
Работа выполнена за счет средств Российского научного фонда (Соглашение № 17-75-20095): разделы «Геномное редактирование», «Новые подходы в лечении больных МВ — патогенетическая терапия и функциональная коррекция мутаций»; в рамках государственного задания ФАНО России: разделы «Симптоматическая терапия», «Клеточная терапия»; поддержана программой фундаментальных исследований Российской академии наук: раздел «Гэнная терапия».
ЛИТЕРАТУРА:
1. Derichs N. Targeting a genetic defect: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators in cystic fibrosis. Eur. Respir. Rev. 2013; 22: 58-65.
2. Berger H.A., Anderson M.P., Gregory R.J. et al. Identification and regulation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-generated chloride channel. J. Clin. Invest. 1991; 88: 1422-31.
3. Choi J.Y., Muallem D., Kiselyov K. et al. Aberrant CFTR-dependent HCO3-transport in mutations associated with cystic fibrosis. Nature 2001; 410: 94-7.
4. Cystic Fibrosis Foundation. Patient registry: annual data report, 2016. Bethesda, MD 2017, https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2016-Patient-Registry-Annual-Data-Report. pdf.
5. Lukacs G.L., Mohamed A., Kartner N. et al. Conformational maturation of CFTR but not its mutant counterpart (delta F508) occurs in the endoplasmic reticulum and requires ATP. EMBO J. 1994; 13: 6076-86.
6. Van Goor F., Straley K.S., Cao D. et al. Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking and gating in human cystic fibrosis airway primary cultures by small molecules. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2006; 290: L1117-30.
7. O'Sullivan B.P., Freedman S.D. Cystic fibrosis. Lancet 2009; 373: 1891-904.
8. Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. Современные фармакотерапев-тические подходы к лечению муковисцидоза. Фарматека 2014; 3: 38-43.
9. Каширская Н.Ю., Капранов Н.И., Шерман В.Д. и др. Заместительная терапия ферментами поджелудочной железы при муковисцидозе. Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского 2014; 93(4): 124-31.
10. Красовский С.А., Амелина Е.Л., Кондратьева Е.И. и др. Медикаментозное лечение муковисцидоза в России: анализ данных национального регистра (2014). Пульмонология 2016; 25(5): 539-55.
11. De Boeck K., Amaral M.D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir. Med. 2016; 4(8): 662-74.
12. McDonald C.M., Campbell C., Torricelli R.E. et al. Ataluren in patients with nonsense mutation Duchenne muscular dystrophy (ACT DMD): a multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet 2017; 390(10101): 1489-98.
13. Zainal Abidin N., Haq I.J., Gardner A.I. et al. Ataluren in cystic fibrosis: development, clinical studies and where are we now? Expert Opin. Pharma-cother. 2017; 18(13): 1363-71.
14. Van Goor F., Hadida S., Grootenhuis P.D. et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. PNAS USA 2009; 106(44): 18825-30.
15. Ramsey B.W., Davies J., McElvaney N.G. et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N. Engl. J. Med. 2011; 365(18): 1663-72.
16. Eckford P.D., Li C., Ramjeesingh M. et al. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J. Biol. Chem. 2012; 287(44): 36639-49.
17. FDA Approves Ivacaftor for Five Splice Mutations, https://www.cff. org/News/News-Archive/2017/FDA-Approves-Ivacaftor-for-Five-Splice-Mutations/.
18. Flume P.A., Liou T.G., Borowitz D.S. et al. Ivacaftor in subjects with cystic fibrosis who are homozygous for the F508del-CFTR mutation. Chest 2012; 142(3): 718-24.
19. Mijnders M., Kleizen B., Braakman I. Correcting CFTR folding defects by small-molecule correctors to cure cystic fibrosis. Curr. Opin. Pharmacol. 2017; 34: 83-90.
20. Ren H.Y., Grove D.E., De La Rosa O. et al. VX-809 corrects folding defects in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein through action on membrane-spanning domain 1. Mol. Biol. Cell 2013; 24(19): 3016-24.
21. Clancy J.P., Rowe S.M., Accurso F.J. et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax 2012; 67(1): 12-8.
22. Kopeikin Z., Yuksek Z., Yang H.Y. et al. Combined effects of VX-770 and VX-809 on several functional abnormalities of F508del-CFTR channels. J. Cyst. Fibros. 2014; 13(5): 508-14.
23. Deeks E.D. Lumacaftor/Ivacaftor: A Review in Cystic Fibrosis. Drugs 2016; 76(12): 1191-201.
24. Highlights of prescribing information, https://pi.vrtx.com/files/ uspi_lumacaftor_ivacaftor.pdf.
25. Milla C.E., Ratjen F., Marigowda G. et al. Lumacaftor/Ivacaftor in Patients Aged 6-11 Years with Cystic Fibrosis and Homozygous for F508del-CFTR. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2017; 195(7): 912-20.
26. Boyle M.P., Bell S.C., Konstan M.W. et al. A CFTR corrector (luma-caftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir. Med. 2014; 2(7): 527-38.
27. Rowe S.M., McColley S.A., Rietschel E. et al. Lumacaftor/Ivacaftor Treatment of Patients with Cystic Fibrosis Heterozygous for F508del-CFTR. Ann. Am. Thorac. Soc. 2017; 14(2): 213-9.
28. Rowe S.M., Daines C., Ringshausen F.C. et al. Tezacaftor-Ivacaftor in Residual-Function Heterozygotes with Cystic Fibrosis. N. Engl. J. Med. 2017; 377(21): 2024-35.
29. Vertex Initiates First Phase 3 Study of VX-659, Tezacaftor and Ivacaftor as a Triple Combination Regimen for People with Cystic Fibrosis. Acquire Media, https://investors.vrtx.com/static-files/ e136394a-d5a2-4db2-afe0-054b3d65f064.
30. Schneider E.K., Azad M.A., Han M.L. et al. An "Unlikely" Pair: The Antimicrobial Synergy of Polymyxin B in Combination with the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Drugs KALYDECO and ORKAMBI. ACS Infect. Dis. 2016; 2(7): 478-88.
31. Jordan C.L., Noah T.L., Henry M.M. Therapeutic challenges posed by critical drug-drug interactions in cystic fibrosis. Pediatr. Pulmonol. 2016; 51(S44): S61-70.
32. Sabusap C.M., Wang W., McNicholas C.M. et al. Analysis of cystic fibrosis-associated P67L CFTR illustrates barriers to personalized therapeutics for orphan diseases. JCI Insight 2016; 1(14): pii: e86581.
33. Амелина Е.Л., Красовский С.А., Усачёва М.В. и др. Патогенетическое лечение муковисцидоза: первый клинический случай в России. Пульмонология 2017; 27(2): 298-301.
34. Schneider E.K., Reyes-Ortega F., Li J. et al. Can Cystic Fibrosis Patients Finally Catch a Breath With Lumacaftor/Ivacaftor? Clin. Pharmacol. Ther. 2017; 101(1): 130-41.
35. Amaral M.D. Novel personalized therapies for cystic fibrosis: treating the basic defect in all patients. J. Intern. Med. 2015; 277(2): 155-66.
36. Griesenbach U., Alton E.W. Moving forward: cystic fibrosis gene therapy. Hum. Mol. Genet. 2013; 22(R1): R52-8.
37. Griesenbach U., Pytel K.M., Alton E.W. Cystic fibrosis gene therapy in the UK and elsewhere. Hum. Gene Ther. 2015; 26: 266-75.
38. Dhooghe B., Haaf J.B., Noel S. et al. Strategies in early clinical development for the treatment of basic defects of cystic fibrosis. Expert Opin. Investig. Drugs 2016; 25(4): 423-36.
39. National Library of Medicine at the National Institutes of Health, https://clinicaltrials.gov.
40. Boucher R.C., Knowles M.R., Johnson L.G. et al. Gene therapy for cystic fibrosis using E1-deleted adenovirus: a phase I trial in the nasal cavity. The University of North Carolina at Chapel Hill. Hum. Gene Ther. 1994; 5(5): 615-39.
41. Knowles M.R., Hohneker K.W., Zhou Z. et al. A controlled study of adenoviral-vector-mediated gene transfer in the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. N. Engl. J. Med. 1995; 333(13): 823-31.
42. Caplen N.J., Alton E.W., Middleton P.G. et al. Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. Nat. Med. 1995; 1(1): 39-46.
43. Sorscher E.J., Logan J.J., Frizzell R.A. et al. Gene therapy for cystic fibrosis using cationic liposome mediated gene transfer: a phase I trial of safety and efficacy in the nasal airway. Hum. Gene Ther. 1994; 5(10): 1259-77.
44. Zuckerman J.B., Robinson C.B., McCoy K.S. et al. A phase I study of adenovirus-mediated transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene to a lung segment of individuals with cystic fibrosis. Hum. Gene Ther. 1999; 10(18): 2973-85.
45. Flotte T., Carter B., Conrad C. et al. A phase I study of an adeno-as-sociated virus-CFTR gene vector in adult CF patients with mild lung disease. Hum. Gene Ther. 1996; 7(9): 1145-59.
46. Wagner J.A., Moran M.L., Messner A.H. et al. A phase I/II study of tgAAV-CF for the treatment of chronic sinusitis in patients with cystic fibrosis. Hum. Gene Ther. 1998; 9(6): 889-909.
47. Wagner J.A., Reynolds T., Moran M.L. et al. Efficient and persistent gene transfer of AAV-CFTR in maxillary sinus. Lancet 1998; 351(9117): 1702-3.
48. Wagner J.A., Messner A.H., Moran M.L. et al. Safety and biological efficacy of an adeno-associated virus vector-cystic fibrosis transmembrane regulator (AAV-CFTR) in the cystic fibrosis maxillary sinus. Laryngoscope 1999; 109(2 Pt 1): 266-74.
49. Aitken M.L., Moss R.B., Waltz D.A. et al. A phase I study of aerosolized administration of tgAAVCF to cystic fibrosis subjects with mild lung disease. Hum. Gene Ther. 2001; 12(15): 1907-16.
50. Wagner J.A., Nepomuceno I.B., Messner A.H. et al. A phase II, double-blind, randomized, placebo-controlled clinical trial of tgAAVCF using maxillary sinus delivery in patients with cystic fibrosis with antrostomies. Hum. Gene Ther. 2002; 13(11): 1349-59.
51. Flotte T.R., Zeitlin P.L., Reynolds T.C. et al. Phase I trial of intranasal and endobronchial administration of a recombinant adeno-associated virus serotype 2 (rAAV2)-CFTR vector in adult cystic fibrosis patients: a two-part clinical study. Hum. Gene Ther. 2003; 14(11): 1079-88.
52. Flotte T.R., Schwiebert E.M., Zeitlin P.L. et al. Correlation between DNA transfer and cystic fibrosis airway epithelial cell correction after recombinant adeno-associated virus serotype 2 gene therapy. Hum. Gene Ther. 2005; 16(8): 921-8.
53. Moss R.B., Rodman D., Spencer L.T. et al. Repeated adeno-associat-ed virus serotype 2 aerosol-mediated cystic fibrosis transmembrane regulator gene transfer to the lungs of patients with cystic fibrosis: a multicenter, double-blind, placebo-controlled trial. Chest 2004; 125(2): 509-21.
54. Moss R.B., Milla C., Colombo J. et al. Repeated aerosolized AAV-CFTR for treatment of cystic fibrosis: a randomized placebo-controlled phase 2B trial. Hum. Gene Ther. 2007; 18(8): 726-32.
55. McLachlan G., Ho L.P., Davidson-Smith H. et al. Laboratory and clinical studies in support of cystic fibrosis gene therapy using pCMV-CFTR-DOT-AP. Gene Ther. 1996; 3(12): 1113-23.
56. Alton E.W., Stern M., Farley R. et al. Cationic lipid-mediated CFTR gene transfer to the lungs and nose of patients with cystic fibrosis: a doubleblind placebo-controlled trial. Lancet 1999; 353(9157): 947-54.
57. Alton E.W., Armstrong D.K., Ashby D. et al. Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial. Lancet Respir. Med. 2015; 3(9): 684-91.
58. Alton E.W.F.W., Armstrong D.K., Ashby D. et al. A randomised, doubleblind, placebo-controlled trial of repeated nebulisation of non-viral cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene therapy in patients with cystic fibrosis. Efficacy Mech. Eval. 2016; 3(5). DOI: 10.3310/eme03050.
59. Beumer W., Swildens J., Henig N. et al. QR-010, an RNA therapy, restores CFTR function using in vitro and in vivo models of dF508 CFTR. J. Cyst. Fibros. 2015; 14(S1): S1.
60. Brinks V., Lipinska K., Koppelaar M. et al. QR-010 treatment for cystic fibrosis: assessing the airway-mucus barrier in delivery. Pediatric Pulmon-ology 2015; 50(S41): 271.
61. Brinks V., Lipinska K., Koppelaar M. et al. QR-010 penetrates the CF-like mucus barrier in vitro and in vivo. Journal of Cystic Fibrosis 2016; 15(S1): S31.
62. Vannucci L., Lai M., Chiuppesi F. et al. Viral vectors: a look back and ahead on gene transfer technology. New Microbiol. 2013; 36(1): 1-22.
63. Schuster B.S., Kim A.J., Kays J.C. et al. Overcoming the cystic fibro-sis sputum barrier to leading adeno-associated virus gene therapy vectors. Mol. Ther. 2014; 22(8): 1484-93.
64. Myint M., Limberis M., Bell P. et al. In Vivo Evaluation of Adeno-Asso-ciated Virus Gene Transfer in Airways of Mice with Acute or Chronic Respiratory Infection. Hum. Gene Ther. 2014; 25(11): 966-76.
65. Alton E.W., Beekman J.M., Boyd A.C. et al. Preparation for a first-in-man lentivirus trial in patients with cystic fibrosis. Thorax 2017; 72(2): 137-47.
66. Noone P.G., Hohneker K.W., Zhou Z. et al. Safety and biological efficacy of a lipid-CFTR complex for gene transfer in the nasal epithelium of adult patients with cystic fibrosis. Mol. Ther. 2000; 1(1): 105-14.
67. Eluforsen Clinical trials: Study 002, http://www.proqr.com/ eluforsen-npd-study-002/.
68. Maeder M.L., Gersbach C.A. Genome-editing Technologies for Gene and Cell Therapy. Mol. Ther. 2016; 24(3): 430-46.
69. Salsman J., Dellaire G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochem. Cell Biol. 2017; 95(2): 187-201.
70. Kim Y.G., Cha J., Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. PNAS USA 1996; 93(3): 1156-60.
71. Maeder M.L., Thibodeau-Beganny S., Osiak A. et al. Rapid "open-source" engineering of customized zinc-finger nucleases for highly efficient gene modification. Mol. Cell 2008; 31(2): 294-301.
72. Lee C.M., Flynn R., Hollywood J.A. et al. Correction of the AF508 Mutation in the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene by Zinc-Finger Nuclease Homology-Directed Repair. Biores. Open Access 2012; 1(3): 99-108.
73. Bednarski C., Tomczak K., Vom Hövel B. et al. Targeted Integration of a Super-Exon into the CFTR Locus Leads to Functional Correction of a Cystic Fibrosis Cell Line Model. PLoS One 2016; 11(8): e0161072.
74. Ramalingam S., London V., Kandavelou K. et al. Generation and genetic engineering of human induced pluripotent stem cells using designed zinc finger nucleases. Stem Cells Dev. 2013; 22(4): 595-610.
75. Crane A.M., Kramer P., Bui J.H. et al. Targeted correction and restored function of the CFTR gene in cystic fibrosis induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports 2015; 4(4): 569-77.
76. Samson M., Labbe O., Mollereau C. et al. Molecular cloning and functional expression of a new human CC-chemokine receptor gene. Biochemistry 1996; 35(11): 3362-7.
77. Cermak T., Doyle E.L., Christian M. et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 2011; 39(12): e82.
78. Camarasa M.V., Galvez V.M. Robust method for TALEN-edited correction of pF508del in patient-specific induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. Ther. 2016; 7: 26.
79. Suzuki S., Sargent R.G., Illek B. et al. TALENs Facilitate Single-step Seamless SDF Correction of F508del CFTR in Airway Epithelial Submucosal Gland Cell-derived CF-iPSCs. Mol. Ther. Nucleic Acids 2016; 5: e273.
80. Merkert S., Bednarski C., Göhring G. et al. Generation of a gene-corrected isogenic control iPSC line from cystic fibrosis patient-specific iPSCs homozygous for p.Phe508del mutation mediated by TALENs and ssODN. Stem Cell Res. 2017; 23: 95-7.
81. Банников А.В., Лавров А.В. CRISPR/CAS9 — король геномного редактирования. Молекулярная биология 2017; 51(4): 582-94.
82. Валетдинова К.Р., Устьянцева Е.И., Елисафенко Е.А. и др. Инструменты геномной инженерии, предназначенные для создания изогенной клеточной модели бокового амиотрофического склероза. Медицинская генетика 2015; 14(6): 3-9.
83. Zhang F., Wen Y., Guo X. CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and challenges. Hum. Mol. Genet. 2014; 23(R1): R40-6.
84. Schwank G., Koo B.K., Sasselli V. et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell 2013; 13(6): 653-8.
85. Firth A.L., Menon T., Parker G.S. et al. Functional Gene Correction for Cystic Fibrosis in Lung Epithelial Cells Generated from Patient iPSCs. Cell Rep. 2015; 12(9): 1385-90.
86. Hollywood J.A., Lee C.M., Scallan M.F. et al. Analysis of gene repair tracts from Cas9/gRNA double-stranded breaks in the human CFTR gene. Sci. Rep. 2016; 6: 32230.
87. Sanz D.J., Hollywood J.A., Scallan M.F. et al. Cas9/gRNA targeted excision of cystic fibrosis-causing deep-intronic splicing mutations restores normal splicing of CFTR mRNA. PLoS One 2017; 12(9): e0184009.
88. Murphy S.V., Atala A. Cell therapy for cystic fibrosis. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2015; 9(3): 210-23.
89. Wecht S., Rojas M. Mesenchymal stem cells in the treatment of chronic lung disease. Respirology 2016; 21(8): 1366-75.
90. Weiss D.J., Chambers D., Giangreco A. et al. An official American Thoracic Society workshop report: stem cells and cell therapies in lung biology and diseases. Ann. Am. Thorac. Soc. 2015; 12(4): S79-97.
91. Dogan A. Embryonic Stem Cells in Development and Regenerative Medicine. Adv. Exp. Med. Biol. 2018; 1079; 1-15.
92. Hayes M., Masterson C., Devaney J. et al. Therapeutic efficacy of human mesenchymal stromal cells in the repair of established ventilator-induced lung injury in the rat. Anesthesiology 2015; 122(2): 363-73.
93. Wilson J.G., Liu K.D., Zhuo H. et al. Mesenchymal stem (stromal) cells for treatment of ARDS: a phase 1 clinical trial. Lancet Respir. Med. 2015; 3(1): 24-32.
94. Khoury O., Barrios C., Ortega V. et al. Immunomodulatory Cell Therapy to Target Cystic Fibrosis Inflammation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2018; 58(1): 12-20.
95. Carbone A., Castellani S., Favia M. et al. Correction of defective CFTR/ENaC function and tightness of cystic fibrosis airway epithelium by amniotic mesenchymal stromal (stem) cells. J. Cell. Mol. Med. 2014; 18(8): 1631-43.
96. Griesenbach U., Alton E.W. Progress in gene and cell therapy for cystic fibrosis lung disease. Curr. Pharm. Des. 2012; 18(5): 642-62.
97. Wang G., Bunnell B.A., Painter R.G. et al. Adult stem cells from bone marrow stroma differentiate into airway epithelial cells: potential therapy for cystic fibrosis. PNAS USA 2005; 102(1): 186-91.
98. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131(5): 861-72.
99. Wong A.P., Bear C.E., Chin S. et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 2012; 30(9): 876-82.
100. McCauley K.B., Hawkins F., Serra M. et al. Efficient Derivation of Functional Human Airway Epithelium from Pluripotent Stem Cells via Temporal Regulation of Wnt Signaling. Cell Stem Cell 2017; 20(6): 844-57.
101. Rosen C., Shezen E., Aronovich A. et al. Preconditioning allows engraftment of mouse and human embryonic lung cells, enabling lung repair in mice. Nat. Med. 2015; 21(8): 869-79.
102. Duchesneau P., Besla R., Derouet M.F. et al. Partial Restoration of CFTR Function in cftr-Null Mice following Targeted Cell Replacement Therapy. Mol. Ther. 2017; 25(3): 654-65.
103. Cohen-Cymberknoh M., Shoseyov D., Kerem E. Managing cystic fibrosis: strategies that increase life expectancy and improve quality of life. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2011; 183(11): 1463-71.
Поступила: 23.04.2018
