CC BY
9
ПРОБЛЕМАТИКА ТРАНСПОРТНЫХ СИСТЕМ
УДК 57.088
Д. А. Белов, Ю. В. Белов, И. Г. Киселев, Ю. О. Водопьянова
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕПЛОВОГО БЛОКА АНАЛИЗАТОРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Дата поступления: 06.07.2018 Решение о публикации: 17.10.2018
Аннотация
Цель: Разработка технических решений, направленных на уменьшение неравномерности температурного поля теплопроводящего элемента в режиме плавления. Методы: Работа анализаторов нуклеиновых кислот основана на методе полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) и методе плавления высокого разрешения (HRMA). Результаты: Разработаны технические решения, обеспечивающие уменьшение неравномерности температурного поля теплопроводящего элемента в режиме плавления. Практическая значимость: Предложенные технические решения обеспечивают уменьшение погрешности измерения температуры плавления ДНК.
Ключевые слова: ПЦР-РВ, плавление ДНК, метод плавления высокого разрешения.
*Dmitriy A. Belov, postgraduate student, onoff_10@mail.ru; Yuriy V. Belov, Cand. Phys. and Math. Sci., associate professor; Igor G. Kiselev, D. Eng. Sci., professor; Yulia O. Vodopyanova, postgraduate student, julua_gazonn@mail.ru (Emperor Alexander I Petersburg State Transport University) THE IMPROVEMENT OF THERMAL ANALYZER BLOCK FOR NUCLEIC ACIDS
Summary
Objective: To develop engineering solutions, aimed at irregularity reduction of temperature field of a heat-conducting element in melting condition. Methods: Functioning of analyzers of nucleic acids is based on the method of real-time polymerase chain reaction (PCR-RT) and high-resolution melting analysis. Results: Engineering solutions which provide for the reduction of irregularity of temperature field of a heat-conducting element in melting condition were developed. Practical importance: The introduced engineering solutions make it possible to reduce errors which occur in the process of measuring the temperature of DNA melting.
Keywords: Real-time polymerase chain reaction (PCR-RT), DNA melting, high-resolution melting method.
Плавление дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) - процесс перехода регулярной двойной спирали линейной молекулы ДНК в клубкообразное состояние под действием температуры [1]. Основанный на этом процессе метод плавления высокого разрешения (High Resolution Melting analysis, HRMA) является методом анализа ДНК, который был разработан в 2002 г. благодаря сотрудничеству между учеными (University of Utah, США) и представителями промышленности (Idaho Technology, США) [2, 3].
HRMA проводится после завершения полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) путем регистрации и последующего анализа флуоресцентного отклика, величина которого изменяется во время постепенного увеличения температуры с шагом 0,008-0,2 °C [4].
Использование метода для решения практических задач многократно доказывало свою эффективность, например, при диагностировании туберкулеза со множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ МБТ): для быстрой детекции мутаций, вызывающих лекарственную устойчивость у микобактерий туберкулеза [5, 6], в эпигенетических исследованиях для определения уровня метилирования фрагментов ДНК [7].
Следует отметить высокую чувствительность и специфичность метода: так, при выявлении МЛУ МБТ чувствительность составляет 80-98,6 % [8], специфичность достигает 100 % [9].
В настоящее время некоторые компании начали выпускать для применения на практике HRMA программное обеспечение и реактивы. Специальное оборудование не требуется: современные анализаторы нуклеиновых кислот позволяют кроме анализа ПЦР-РВ проводить HRMA, в частности приборы 7500 Fast Real-Time PCR System и StepOne Plus компании «Life Technologies», США, CFX 96 Touch™ компании «BIO-RAD», Stratagene MX3005P компании «Agilent», The LightCyclerR 96 System компании «Roche Diagnostics GmbH», DTprime компании «ДНК-технология» и др.
Анализируемые образцы, объем которых составляет 10-30 мкл, помещаются в полипропиленовые пробирки объемом 0,1-0,6 мл или в микро-титраторные планшеты вместимостью от 96 до 384 образцов. Обеспечение температурных циклов осуществляется тепловым блоком. Чаще всего в тепловых блоках используются твердотельные металлические теплопроводящие элементы из алюминия или позолоченного серебра, нагрев и охлаждение производятся элементами Пельтье [10].
Применение элементов Пельтье имеет ряд преимуществ [11]: отсутствие движущихся, изнашивающихся частей, вибрации и шума; высокая охлаждающая способность на единицу веса и объема - до 150 Вт/г и до 100 Вт/см 3; возможность плавного и высокоточного регулирования холодопроизводитель-ности и температурного режима; малая инерционность, быстрый переход из режима охлаждения в режим нагрева; отсутствие рабочих жидкостей и газов; практически неограниченный ресурс работы; произвольная ориентация
в пространстве и поле тяжести; устойчивость к динамическим и статическим перегрузкам; экологическая чистота.
При проведении анализа методом ПЦР-РВ важны скорости изменения температуры. Обычно они варьируют от 1 до 6 ^ в секунду, при этом охлаждение происходит значительно медленнее, чем нагрев [10].
Для увеличения скорости изменения температуры в режиме охлаждения авторами ранее было предложено ввести в состав теплового блока гидравлическую систему, которая обеспечивает дополнительный сток теплоты за счет протекания жидкости в каналах теплопроводящего элемента [12].
При работе гидравлической системы в циклическом режиме (рис. 1) с помощью контроллера поршневые или мембранные насосы 1 и 2 через клапаны 2 и 4 в течение времени стабилизации температуры на нижнем уровне, нагрева и стабилизации температуры на верхнем уровне заполняются с выходов емкости 1 соответственно воздухом и жидкостью. В режиме охлаждения насос 2 через клапан 3 обеспечивает заполнение жидкостью и проточный режим каналов держателя пробирок. В конце режима охлаждения насос 2 останавливается, а насос 1 через клапан 1 обеспечивает удаление жидкости из каналов держателя пробирок в емкость 2. Через отверстия в перегородке выравниваются уровни жидкости в емкостях 1 и 2. Температурные циклы многократно повторяются.
При всех температурных режимах активно работают термоэлектрические элементы. Температура заполняющей емкости жидкости с помощью радиаторов поддерживается на уровне температуры окружающей среды.
Рис. 1. Схема гидравлической системы
При протекании жидкости через внутренние каналы теплопроводящего элемента активно происходит теплообмен между нагретым теплопроводящим элементом с пробирками и жидкостью, обладающей значительно меньшей температурой.
Одной из основных причин погрешностей измерения температуры плавления ДНК является разность температур соседних пробирок. Уменьшение погрешностей измерения возможно благодаря методам обработки кривых плавления [13], получаемых в результате анализа, и путем компенсации неравномерности температурного поля теплопроводящего элемента [14].
Для выравнивания неравномерности температурного поля в режиме плавления известная гидравлическая система [12] дополнительно содержит насос 3 и электромагнитный или обратный клапан 5.
Режим плавления выполняется с помощью непрерывного или ступенчатого изменения температуры теплопроводящего элемента благодаря работе термоэлектрического элемента 1. С помощью насоса 3 через клапан 5 жидкость усредненной температуры поступает на входы внутренних каналов теплопроводящего элемента. При протекании жидкости через каналы активно происходит теплообмен между теплопроводящим элементом и жидкостью. Потоки жидкости с выходов внутренних каналов смешиваются.
Круговое движение жидкости в каналах обеспечивает выравнивание температуры всех пробирок, содержащих реакционную смесь. Таким образом, достигается уменьшение разброса результатов анализа в режиме плавления.
Для устранения краевого эффекта циркуляция воды в теплопроводящем элементе происходит в соответствии с рис. 2.
Вход воды—>
с;
Вход воды—>
оооооооо =оо=о=оо=ооо= оооооооо оооооооо
->
)
-> Выход воды
)
Рис. 2. Схема движения воды в каналах теплопроводящего элемента
На основе анализатора нуклеиновых кислот АНК-32, который серийно выпускается в Институте аналитического приборостроения РАН (ИАП РАН, Санкт-Петербург), разработан экспериментальный образец теплового блока, при испытании которого получены следующие результаты: разброс температур по пробиркам уменьшился более чем в 3 раза.
Новизна предложенных технических решений подтверждена патентом на изобретение [15].
Работа выполнена в ИАП РАН в рамках НИР по государственному заказу 0074-2014-0010, государственный регистрационный номер: АААА-А16-116041310008-3.
Библиографический список
1. Веденов А. А. Переход спираль-клубок в ДНК / А. А. Веденов, А. М. Дыхне, М. Д. Франк-Каменецкий // Успехи физ. наук. - 1971. - Т. 105, вып. 3. - С. 479-519.
2. Wittwer C. T. High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen / C. T. Wittwer, G. H. Reed, C. N. Gundry, J. G. Vandersteen, R. J. Pryor // Clin Chem. -2003. - Vol. 49. - P. 853-860.
3. Reed G. H. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics / G. H. Reed, J. O. Kent, C. T. Wittwer // Pharmacogenomics. - 2007. - Vol. 8. -P. 597-608.
4. Никитина Д. И. Использование высокоразрешающего анализа кривых плавления ДНК в диагностике наследственных заболеваний / Д. И. Никитина, М. А. Маретина, А. А. Егорова, А. Б. Масленников, А. В. Киселев // Медицинская генетика. - 2017. - № 16 (5). -С. 26-33.
5. Hoek K. G. Fluorometric assay for testing rifampin susceptibility of Mycobacterium Tuberculosis Complex / K. G. Hoek, N. C. Gey van Pittius, H. Moolman-Smook, K. Carelse-Tofa, A. Jordaan, G. D. van der Spuy, E. Streicher, T. C. Victor, P. D. van Helden, R. M. Warren // J. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol. 46. - Р. 1369-1373.
6. Choi G. E. High-resolution melting curve analysis for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium Tuberculosis clinical isolates / G. E. Choi, S. M. Lee, J. Yi, S. H. Hwang, H. H. Kim, E. Y. Lee, E. H. Cho, J. H. Kim, H. J. Kim, C. L. Chang // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48, N 11. - Р. 3893-3898.
7. Wojdacz T. K. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation / T. K. Wojdacz, A. Dobrovic // Nucleic Acids Res. - 2007. - N 35 (6). - Р. 41-48.
8. Galarza M. High-resolution melting analysis for molecular detection of multidrug resistance tuberculosis in Peruvian isolates / M. Galarza, M. Fasabi, K. S. Levano, E. Castillo, N. Barreda, M. Rodriguez, H. Guio // MC Infectious Diseases. - December 2016. - P. 260-266.
9. Лаврова О. И. HRM - новый молекулярный метод определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза / О. И. Лаврова, М. В. Альварес Фигероа, М. Г. Тво-рогова // Клиническая лабораторная диагностика. - 2014. - № 7. - С. 62-64.
10. Магданов Э. Г. Современное приборное оснащение количественной и цифровой ПЦР / Э. Г. Магданов, Д. А. Чемерис, А. В. Чемерис // Биомика. - 2011. - Т. 1, № 1. -С. 15-60.
11. Алексеев В. С. Самосогласованная краевая задача тепломассопереноса и термоэлектрического охлаждения / В. С. Алексеев // Вестн. Саратов. гос. техн. ун-та. - 2012. -№ 1 (66). - С. 11-15.
12. Патент RU2640186, МПК: G01N35/00, G01N33/68, G01N33/48, G01N21/64 (РФ). Устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества ампли-фикаций нуклеиновой кислоты / Д. А. Белов, Ю. В. Белов, С. В. Коновалов, Я. И. Алексеев ;
патентообладатель : «Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН)». - Заявл. 19.11.2015 г. - Опубл. 26.12.2017 г. - Бюл. № 36.
13. Белов Д. А. Новая методика обработки флуоресцентного отклика плавления ДНК / Д. А. Белов, Ю. В. Белов, В. Е. Курочкин // Научное приборостроение. - 2018. - Т. 28, № 1. - С. 3-10.
14. Белов Д. А. Методика определения разброса температур по лункам анализаторов нуклеиновых кислот / Д. А. Белов, А. C. Альдекеева, Ю. В. Белов, И. Г. Киселев // Научное приборостроение. - 2017. - Т. 27, № 4. - С. 34-39.
15. Патент RU2666209, МПК: G01N33/68, G01N1/10, G01N21/64, G01N35/00 (РФ). Устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества ампли-фикаций нуклеиновой кислоты / Д. А. Белов, Ю. В. Белов ; патентообладатель : «Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН)». - Заявл. 22.09.2016 г. - Опубл. 06.09.2018 г. -Бюл. № 25.
References
1. Vedenov A.A., Dykhne A. M. & Frank-Kamenetskiy M. D. Perekhod spiral-klubok v DNK [Helix-coil transition in DNA]. Uspekhy phys. nauk [The achievements of phys. sciences], 1971, vol. 105, issue 3, pp. 479-519. (In Russian)
2. Wittwer C. T., Reed G. H., Gundry C. N., Vandersteen J. G. & Pryor R. J. High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. Clin Chem., 2003, vol. 49, pp. 853-860.
3. Reed G. H., Kent J. O., Wittwer C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics, 2007, vol. 8, pp. 597-608.
4. Nikitina D. I., Maretina M.A., Egorova A.A., Maslennikov A. B. & Kiselev A. V. Ispol-zovaniye vysokorazreshayushchego analiza krivykh plavleniya DNK v diagnostike nasled-stvennykh zabolevaniy [Application of high-resolution analysis of DNA melting curves in diagnostics of hereditary diseases]. Meditsinskaya genetika [Medical genetics], 2017, no. 16 (5), pp. 26-33. (In Russian)
5. Hoek K. G., Gey van Pittius N. C., Moolman-Smook H., Carelse-Tofa K., Jordaan A., van der Spuy G. D., Streicher E., Victor T. C., van Helden P. D. & Warren R. M. Fluorometric assay for testing rifampin susceptibility of Mycobacterium Tuberculosis Complex. J. Clin. Microbiol., 2008, vol. 46, pp. 1369-1373.
6. Choi G. E., Lee S. M., Yi J., Hwang S. H., Kim H. H., Lee E. Y., Cho E. H., Kim J. H., Kim H. J. & Chang C. L. High-resolution melting curve analysis for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium Tuberculosis Clinical Isolates. J. Clin. Microbiol., 2010, vol. 48, no. 11, pp. 3893-3898.
7. Wojdacz T. K. & Dobrovic A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res., 2007, no. 35 (6), pp. 41-48.
8. Galarza M., Fasabi M., Levano K. S., Castillo E., Barreda N., Rodriguez M. & Guio H. High-resolution melting analysis for molecular detection of multidrug resistance tuberculosis in Peruvian isolates. BMC Infectious Diseases, 2016, pp. 260-266.
9. Lavrova O. I., Alvares Figeroa M. V., Tvorogova M. G. HRM - noviy molekulyarniy me-tod opredeleniya lekarstvennoy ustoichivosty mikobakteriy tuberkuleza [HRM - the new molecular method for determining drug resistance of Mycobacterium tuberculosis]. Klinicheskaya laborator-naya diagnostika [Clinical laboratory diagnostics], 2014, no. 7, pp. 62-64. (In Russian)
10. Magdanov E. G., Chemeris D.A. & Chemeris A. V. Sovremennoye pribornoye osnash-cheniye kolichestvennoy i tsifrovoy PTsR [Modern instrumentation for quantitative and digital PCR]. Biomika, 2011, vol. 1, no. 1, pp. 15-60. (In Russian)
11. Alekseyev V. S. Samosoglasovannaya krayevaya zadacha teplomassoperenosa i ter-moelektricheskogo okhlazhdeniya [Self-consistent boundary value problem of heat and mass transfer and thermoelectric cooling]. Vestnik Saratovskogo gosudarstvennogo tekhnicheskogo univer-siteta [Bulletin of Saratov State Technical University], 2012, no. 1 (66), pp. 11-15. (In Russian)
12. Belov D.A., Belov Y. V., Konovalov S. V. & Alekseyev Y. I. Ustroistvo dlya odnovre-mennogo kontrolya v realnom masshtabe vremeny mnozhestva amplifikatsiy nukleinovoy kisloty [An appliance designed for simultaneous real-time monitoring of a multitude of nucleic acid based amplifications]. Patent RU2640186, IPC: G01N35/00, G01N33/68, G01N33/48, G01N21/64, (RF). Patent holder: "Federalnoye gosudarstvennoye byudzhetnoye uchrezhdeniye nauky Institut analiticheskogo priborostroyeniya Rossiyskoy akademii nauk (IAP RAN)" ["Federal publicly funded institution of science Analytical Engineering Institution of the Russian Academy of Sciences"]. Appl. 19.11.2015, publ. 26.12.2017, bull. no. 36. (In Russian)
13. Belov D. A., Belov Y. V. & Kurochkin V. E. Novaya metodika obrabotky fluo-restsentnogo otklika plavlenia DNK [A new processing technique of fluorescent response to DNA melting]. Nauchnoye priborostroyeniye [Research engineering], 2018, vol. 28, no. 1, pp. 3-10. (In Russian)
14. Belov D.A., Aldekeyeva A. S., Belov Y. V. & Kiselev I. G. Metodika opredeleniya raz-brosa temperature po lunkam analizatorov nukleinovykh kislot [A technique for determining the temperature spread in the wells of nucleic acid analyzers]. Nauchnoye priborostroyeniye [Research engineering], 2017, vol. 27, no. 4, pp. 34-39. (In Russian)
15. Belov D. A. & Belov Y. V. Ustroistvo dlya odnovremennogo kontrolya v realnom masshtabe vremeny mnozhestva amplifikatsiy nukleinovoy kisloty [An appliance designed for simultaneous real-time monitoring of a multitude of nucleic acid based amplifications]. Patent RU2666209, IPC: G01N33/68, G01N1/10, G01N21/64, G01N35/00, (RF). Patent holder: "Federalnoye gosudarstvennoye byudzhetnoye uchrezhdeniye nauky Institut analiticheskogo pri-borostroyeniya Rossiyskoy akademii nauk (IAP RAN)" ["Federal publicly funded institution of science Analytical Engineering Institution of the Russian Academy of Sciences"]. Appl. 22.09.2016, publ. 06.09.2018, bull. no. 25. (In Russian)
*БЕЛОВ Дмитрий Анатольевич - аспирант, onoff_10@mail.ru; БЕЛОВ Юрий Васильевич -канд. физ.-мат. наук, доцент; КИСЕЛЕВ Игорь Георгиевич - д-р техн. наук, профессор; ВОДОПЬЯНОВА Юлия Олеговна - аспирант, julua_gazonn@mail.ru (Петербургский государственный университет путей сообщения Императора Александра I).
