CC BY
79
ЭКОЛОГИЯ
УДК 575: 631.527 Л.И. Тихомирова
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОЦЕССА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ СОРТОВ IRIS HYBRIDA HORT. ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
Ключевые слова: культура in vitro, ирис, микроклональное размножение, питательные среды, растения — регенеранты, регуляторы роста, анатомические срезы.
Одной из основных проблем при микро-клональном размножении является поддержание длительно пассируемой культуры. При длительном культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5-10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Для ряда культур на этапе собственно микроразмножения снижают содержание гормонов цитокининового типа действия, что приводит к уменьшению коэффициента размножения.
При длительном пассировании Gerbera jamesonii Bolus на средах с одной и той же концентрацией БАП новообразующиеся побеги имели морфологические изменения, плохо укоренялись, погибали. Отмеченное явление позволило сделать вывод о необходимости чередования циклов культивирования с различной концентрацией цитокинина в питательной среде при одновременном обеспечении достаточной скорости размножения. Циклы микроразмножения: активация новообразования почек при 5 мг/л цитокинина и элонгация развивающихся побегов при 1 мг/л повторяли 12-15 раз в течение 2 лет [1].
Цель работы — разработать элементы технологии микроклонального размножения для длительно пассируемой культуры Iris hybrida hort. на основе анатомических исследований корневища.
Объекты, методы и условия исследований
Объекты исследований — перспективные сорта отечественной и зарубежной селекции I. Hybrid из коллекции НИИ садоводства Сибири им. М.А. Лисавенко, г. Барнаул.
Питательные среды готовили по прописи Мурасиге и Скуга, с дабавлением 30 г/л сахарозы. Из регуляторов роста на этапе введения ирисов в культуру изучено действие нафтилуксусной кислоты (НУК), 3-индо-лилмасляной кислота (ИМК), 6-бензи-ламинопурина (БАП) в концентрациях
0.1-5,0 мкМ. Из негормональных стимуляторов роста использовали L-глютамин и аденин сульфат в количестве 100 мг/л.
Экспериментальные работы с использованием метода культуры тканей проведены по общепринятым методикам [2]. Основными показателями, определяющими эффективность размножения, служили число микропобегов (пазушных и адвентивных), образовавшихся de novo в течение одного пассажа, и их длина. При умножении этих показателей получали общую высоту растений.
Анатомическое строение корневища в культуре in vitro изучали на постоянных препаратах, изготовленных по общепринятой методике [3].
Растения выращивали в лабораторных условиях при искусственном освещении (20004000 лк) в условиях фотопериода: 16/8 ч свет/темнота, температура 24-260С.
Результаты и их обсуждение
Размножение I. hybrida осуществлялось многократным пассированием побегов, полученных в результате прямого органогенеза. На этапе собственно микроразмножения
1. hybrida использовали питательные среды, содержащие 1.0, 2.5 и 5.0 мкМ 6-БАП, а также среды, содержащие такое же количество цитокинина, дополненные ауксинами
НУК и ИМК в количестве 0,1 мкМ. В качестве контроля была использована питательная среда, содержащая 0,5 мкМ 6-БАП. Среднее значение числа побегов во всех вариантах опыта составило 1,49 в течение 8 пассажей, при этом среднее значение высоты растения было равно 48,4 мм. У I. НуЬпба была отмечена высокая склонность к витрификации. Выше среднего значения число побегов и высоту растений наблюдали на средах с 1,0 мкМ 6-БАП. Было отмечено, что морфогенный эффект цито-кинина более активно реализуется при взаимодействии с регуляторами роста аук-синовой природы. На средах, содержащих 5,0 мкМ 6-БАП, через 3-5 пассажей наблюдали витрификацию побегов (табл.).
У I. НуЬпба сорт Chardette на питательных средах, содержащих 1,0 мкМ 6-БАП, коэффициент размножения составил 2,2, а среднее значение высоты растений равно 48,44 мм. На продольном анатомическом срезе корневища хорошо просматривается основная паренхима, наружный слой пер-
вичной коры состоит из опробковевших клеток. В пазухе листа развивается адвентивный побег. Отмечена активизация клеточных делений в зоне центрального цилиндра.
На питательных средах, содержащих 2,5 мкМ 6-БАП, у I. hybrida при гистологическом исследовании было обнаружено слабое побегообразование, коэффициент размножения составлял 1,15. На базальной части побега при продольном срезе была обнаружена защитная пробка из некротизи-рованных тканей. Пазушные почки и придаточные корни закладывались одновременно. В клетках паренхимы были видны крахмальные зёрна (рис. 1).
При добавлении ауксинов в питательные среды, содержащие 2,5 мкМ 6-БАП, побегообразовательная деятельность у I. hybrida сорт Chardette оставалась на прежнем уровне. Коэффициент размножения составлял 1,38. При анатомическом исследовании побегов отличий, связанных с введением ауксинов, обнаружено не было.
Таблица
Влияние концентрации БАП, НУК и ИМК на число и высоту побегов
у I. hybrida сорт Chardette
БАП, MS+БАП MS + БАП + 0,1 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК
мкМ число побегов высота растения, мм число побегов высота растения, мм
0,5 контр. 1,2±0,4 66,6±4,4
1,0 2,0±0,5 48,44±6,1
2,5 1,15±0,5 47,93±2,5 1,38 ±0,4 47,91±6,1
5,0 1,3±0,3 44,06±3,3 (витрификация) 1,45±0,2 55,76±2,4 (витрификация)
Рис. 1. Внешнее и внутреннее строение побега I. hybrida сорта СЬа^еНе на питательной среде,
содержащей 2,5 мкМ 6-БАП: а — побег; б — продольный срез (увел. 10*10)
С целью увеличения коэффициента размножения и высоты растений, для Iris hybrida мы разработали следующую схему культивирования: 1) чередование среды,
содержащей 1,0; 2,5; и 5,0 мкМ 6-БАП (с ауксинами и без), и безгормональной среды, содержащей L-глютамин и аденин сульфат в количестве 100 мг/л; 2) без чередования сред. На протяжении всего времени этапа собственно микроразмножения было отмечено увеличение коэффициента размножения и высоты растений, а соответственно, и общей высоты растений. Максимального значения общей высоты растения достигали при 2,5 мкМ 6-БАП с чередованием сред по схеме. Если питательные среды содержали 1 мкМ 6-БАП, то общая высота растений с чередованием сред и без чередования была практически одинаковой. Это, вероятно, зависело от низкого содержания цитокинина, при чередовании его концентрация в тканях растений ещё более снижалась. Минимальные значения общей высоты растений мы отмечали при 5,0 мкМ 6-БАП в питательной среде. При чередовании сред такого явления как витрификация не наблюдали даже при высоких концентрациях цитокинина. Необходимо отметить, что при добавлении в среды ауксинов общая высота растений увеличивается (рис. 2).
150 т
1 2 3 4 5
Состав сред
□без чередования Ос чередованием
Рис. 2. Влияние схемы культивирования на общую высоту растений у I. hybrida. Состав сред: 1) 1,0 мкМ 6БАП;
2) 2,5 мкМ 6БАП; 3) 2,5 мкМ 6БАП + 0,1 мкМ НУК + 0,1 мкМ ИМК; 4) 5,0 мкМ 6БАП;
5) 5,0 мкМ 6БАП + 0,1 мкМ НУК +
+ 0,1 мкМ ИМК
Общей особенностью для всех вариантов содержания 6-БАП было отрастание корней при чередовании сред. Безгормональные среды, содержащие L-глютамин и аденин сульфат, стимулировали образование длинных корней у I. hybrida на этапе собственно микроразмножения. В ряде случаев у реге-нерантов развивались корни второго порядка.
При анатомическом исследовании на поперечном срезе при чередовании питатель-
ных сред, содержащих 2,5 мкМ 6-БАП, и безгормональной среды на основе MS отчётливо видны основные ткани побега. В наружных слоях первичной коры некротизи-рованные клетки образуют защитную ткань из эпидермы и паренхимы. Паренхимная ткань первичной коры более глубоких слоёв хорошо прокрашена, представлена клетками почти округлой формы. Ближе к центральному цилиндру несколько слоёв клеток образуют слабоокрашенную зону. В области центрального цилиндра отмечена активная побегообразовательная деятельность.
Использование схемы культивирования с чередованием сред позволило повысить коэффициент размножения в среднем до 2,28 при высоте растений 70,0 мм. На анатомических срезах отмечен геммогенез высокой степени. Зачаточные побеги формируются в области первичной коры и центрального цилиндра. Исключение гормональной нагрузки в последующем пассаже позволяет зачаткам развиться в морфологически нормальные адвентивные побеги, способные к укоренению и адаптации.
Среды, содержащие 5,0 мкМ 6-БАП, оказывали токсическое действие на побеги
I. hybrida. Растения на данных средах плохо размножались, имели угнетённый вид и со временем гибли. Введение ауксинов несколько сглаживало токсический эффект высоких доз цитокинина, но в последующих пассажах происходила витрификация. На поперечных срезах корневища при гистологическом анализе определялась хорошо окрашенная паренхима первичной коры и центрального цилиндра. Поверхностные слои первичной коры состоят из некротизирован-ных тканей. В более глубоких слоях паренхимы первичной коры определяются зоны меристематической активности и зачаточные побеги. Более активно регенерационные процессы идут в области центрального цилиндра. Но рост адвентивных побегов отмечен в слабой степени, коэффициент размножения на данных питательных средах составил 1.4 при средней высоте побегов 63,2 мм. Вероятно, большая часть зачаточных побегов не имела возможности развиваться в нормальные побеги, ввиду высокой концентрации 6-БАП, и со временем гибла в результате некроза.
При изучении действий разных концентраций 6-БАП и схем культивирования на изменение анатомического строение побегов I. hybridа было отмечено, что наиболее близким к интактным растениям является строение побегов, выросших на средах, содержащих 1,0 мкМ 6-БАП. Использование более высоких концентраций цитокинина приводило к угнетению меристематической
активности. Чередование сред, содержащих гормоны, и безгормональных сред повышало регенерационную способность материнских побегов, зачатки развивались в нормальные адвентивные побеги, средняя высота растений при данной схеме культивирования была на 22 мм больше, чем у побегов на среде 1,0 мкМ 6-БАП.
Заключение
Таким образом, изучая влияние гормональных и негормональных регуляторов роста на побегообразовательную деятельность у I. Hybrid, было отмечено, что на этапе собственно микроразмножения среды должны содержать 1,0-2,5 мкМ 6-БАП. При этом необходимо чередовать среды с фитогормонами и безгормональные среды через один пассаж. В безгормональные среды желательно добавлять L-глютамин и аденин сульфат в количестве 100 мг/л. На анатомических срезах отмечен геммогенез
высокой степени. Зачаточные побеги формируются в области первичной коры и центрального цилиндра. Исключение гормональной нагрузки в последующем пассаже позволяет зачаткам развиться в морфологически нормальные адвентивные побеги, способные к укоренению и адаптации.
Библиографический список
1. Патент РФ № 2152150 МПК7 А01Н 4/00. Способ получения оздоровленного in vitro посадочного материала Gerbera jame-sonii bolus.
2. Калинин Ф.А., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. — Киев, 1980. — 488 с.
3. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. — М.: Изд-во МГУ, 2004. — 312 с.
УДК 582.4/.9-18:633.1 Г.К. Зверева
СТРУКТУРА ХЛОРЕНХИМЫ КОЛОСКОВЫХ ЧЕШУЙ ХЛЕБНЫХ ЗЛАКОВ
Ключевые слова: Poaceaе, хлебные злаки, колосковая чешуя, хлоренхима, ячеистые клетки, срединные клетки, пространственная организация хлоренхимы.
Введение
Формирование урожая хлебных злаков определяется фотосинтетической деятельностью всех зеленых органов растений, большую роль при этом, начиная с периода колошения, играют элементы колоса или метелки [1, 2 и др.].
Известно, что мезофилл листьев зерновых хлебов состоит из клеток сложных форм [3, 4 и др.], сильная разветвленность клеточных оболочек и большое разнообразие конфигураций клеток хлоренхимы отмечаются также и в их нелистовых фотосинтезирующих органах [5, 6 и др.]. Ассимиляционная ткань колосковых и цветковых чешуй пшеницы описывалась как складчатая [7] или как рыхлая губчатая [8], при этом отмечалось, что в листоподобных органах колоса от верхних частей к базальным имеется ряд переходов от складчатых клеток к звездчатым.
Клеточная организация ассимиляционной ткани листовых пластинок и влагалищ у некоторых типичных хлебных злаков рассмот-
рена нами ранее [9], задачей данного исследования было выявить особенности пространственного распределения клеток хлоренхимы в их колосковых чешуях.
Объекты и методы
Формы проекций ассимиляционных клеток и структура хлоренхимы колосковых чешуй изучены у Triticum aestivum L., сорт Новосибирская 89, Secale cereale L., сорт Крупнозерная (триба Triticeae Dum.) и Avena sativa L., сорт СИР 4 (триба Aveneae Dum.), возделываемых в Приобской лесостепи Западной Сибири. Исследовалось анатомическое строение нижних колосковых чешуй злаков, находящихся в состоянии колошения — начала цветения с помощью методики, описанной ранее [9]. При характеристике клеточной организации ассимиляционной ткани будем опираться на предложенные нами классификацию клеток хлоренхимы и схему расположения хлорофиллоносных клеток в пространстве листа злаков [10].
Результаты исследований
Наружная эпидерма колосковых чешуй изученных хлебных злаков представлена удлиненными клетками с сильноизвилистыми антиклинальными стенками. Основные клет-
