CC BY
0
НЕПРЕРЫВНОЕ МЕДИЦИНСКОЕ ОБРАЗОВАНИЕ
Совершенствование методической базы обучения методам лабораторной диагностики туляремии
Сазанова Е.В., Малюкова Т.А., Попов Ю.А., Бойко А.В., Сеничкина А.М., Абдрашитова А.С., Щербакова Н.Е., Ляшова О.Ю., Терехова И.В., Вахрушина Н.И.
Федеральное казенное учреждение науки «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, 410005, г. Саратов, Российская Федерация
Резюме
Обучение бактериологов, эпидемиологов и лаборантов, работающих с возбудителями I-II групп патоген-ности, требует формирования пула штаммов микроорганизмов, характеризующихся сниженной вирулентностью. Стандартизированный учебный набор штаммов позволяет выполнить в полном объеме план учебного модуля на практических занятиях по освоению регламентированных методов лабораторной диагностики.
Цель исследования - подбор штаммов Francisella tularensis со сниженной вирулентностью для формирования стандартизованного учебного набора.
Материал и методы. Исследования штаммов Francisella проводили с помощью аналитического, микробиологического, молекулярно-биологического, иммунодиагностических и биологического методов, масс-спектрометрического анализа.
Результаты и обсуждение. Подобраны штаммы F. tularensis, разработаны алгоритм и дифференцированный подход использования каждого штамма при освоении регламентированных методов индикации и идентификации возбудителя туляремии. Разработаны стандартные учебные образцы проб - имитаторов патогенного биологического агента для проведения практических занятий.
Заключение. Применение учебного набора штаммов F. tularensis позволяет минимизировать риск лабораторного инфицирования обучающихся на курсах профессиональной переподготовки и освоить в полном объеме методы индикации и идентификации туляремийного микроба, регламентированные на территории Российской Федерации.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Сазанова Е.В., Малюкова Т.А.; сбор и обработка материала - Бойко А.В.,
Абдрашитова А.С., Щербакова Н.Е., Сеничкина А.М., Ляшова О.Ю., Терехова И.В., Вахрушина Н.И.; написание текста - Сазанова Е.В.; редактирование - Малюкова Т.А., Попов Ю.А., Бойко А.В.
Для цитирования: Сазанова Е.В., Малюкова Т.А., Попов Ю.А., Бойко А.В., Сеничкина А.М., Абдрашитова А.С., Щербакова Н.Е., Ляшова О.Ю., Терехова И.В., Вахрушина Н.И. Совершенствование методической базы обучения методам лабораторной диагностики туляремии // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2024. Т. 13, № 1. С. 96-103. DOI: https://doi. org/10.33029/2305-3496-2024-13-1-96-103
Статья поступила в редакцию 17.04.2023. Принята в печать 29.12.2023.
Ключевые слова:
Francisella
Шагеп$1$',
учебный набор
штаммов;
подготовка
специалистов;
биологическая
безопасность;
лабораторная
диагностика
туляремии
Improving the methoоdological basis for teaching methods of laboratory diagnosis of tularemia
Sazanova E.V., Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", 410005, Saratov, Russian
Malyukova T.A., Federation
Popov Yu.A.,
Boyko A.V.,
Senichkina A.M.,
Abdrashitova A.S.,
Shcherbakova N.E.,
Lyashova O.Yu.,
Terekhova I.V.,
Vakhrushina N.I.
Abstract
Training of bacteriologists and laboratory technicians working with agents of pathogenicity groups I-II requires the formation of a pool of microorganism strains characterized by attenuated virulence. Availability of a standardized training set of strains allows for implementing the schedule of the training module during practical classes on mastering regulated laboratory diagnostic methods to the full extent.
The aim of the study was to select Francisella tularensis strains with reduced virulence to form a standardized training set.
Material and methods. Studies of Francisella strains were carried out using analytical, microbiological, molecular-biological, immunodiagnostic and biological methods, and mass spectrometric analysis.
Results and discussion. Strains of F. tularensis have been assorted; an algorithm and a differentiated approach to using each strain in mastering regulated methods for indicating and identifying the causative agent of tularemia have been developed. Standard training sets of pathogenic biological agent simulator samples have been designed for practical training.
Conclusion. Application of the training set of F. tularensis strains makes it possible to minimize the risk of laboratory infection of students during professional retraining courses and to fully master the methods of indication and identification of the tularemia microbe, regulated in the Russian Federation.
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution. The concept and design of the study - Sazanova E.V., Malyukova T.A.; collection and processing of material - Boyko A.V., Abdrashitova A.S., Shcherbakova N.E., Senichkina A.M., Lyashova O.Yu., Terekhova I.V., Vakhrushina N.I.; writing - Sazanova E.V.; editing - Malyukova T.A., Popov Yu.A., Boyko A.V.
For citation: Sazanova E.V., Malyukova T.A., Popov Yu.A., Boyko A.V., Senichkina A.M., Abdrashitova A.S., Shcherbakova N.E., Lyashova O.Yu., Terekhova I.V., Vakhrushina N.I. Improving the methodological basis for teaching methods of laboratory diagnosis of tularemia. Infektsionnye bolezni: novosti, mneniya, obuchenie [Infectious Diseases: News, Opinions, Training]. 2024; 13 (1): 96-103. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2024-13-1-96-103 (in Russian) Received 17.04.2023. Accepted 29.12.2023.
Keywords:
Francisella tularensis; training set of strains; training of specialists; biological safety; laboratory diagnostics of tularemia
Одним из основных государственных направлений в сфере охраны здоровья населения является обеспечение качественной профессиональной подготовки специалистов учреждений Роспотребнадзора, медицинских и иных организаций по лабораторной диагностике инфекционных болезней. Обучение бактериологов, эпидемиологов и лаборантов регламентированным методам лабораторной диагностики туляремии проводят в ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора с 1924 г. с использованием вирулентных штаммов [1].
Государственная политика в области обеспечения биологической безопасности Российской Федерации ставит задачу исключить или минимизировать использование в технологических процессах патогенных микроорганизмов [2].
Данный подход может быть реализован путем формирования пула штаммов микроорганизмов, характеризующихся сниженной вирулентностью и позволяющих выполнить в полном объеме план учебного модуля «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии» на практических занятиях при освоении регламентированных методов лабораторной диагностики туляремии. Необходимо подчеркнуть, что преподавание модуля «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии», согласно учебной программе, основывается на теоретических (лекции, семинары) и обязательных практических занятиях. Важная роль практических занятий в программе профессиональной переподготовки эпидемиологов, бактериологов и лаборантов определяет количество учебных часов, выделяемых для овладения
регламентированными методами лабораторной диагностики туляремии, которое в 3 раза превышает учебное время, отведенное на освоение теоретического материала.
Практические занятия для слушателей курсов проводят с учетом современных требований биологической безопасности, положений профессиональных стандартов и квалификационных характеристик специалистов. Предусмотрено не только решение ситуационных задач с моделированием эпидемических ситуаций, но и использование проб - имитаторов материалов, содержащих F. tularensis, что способствует формированию знаний биологических свойств возбудителя туляремии. Полученные знания позволят оперативно организовать проведение индикации и идентификации возбудителей при возникновении вспышек инфекционных болезней.
Следует отметить, что с целью максимального снижения вероятного риска лабораторного инфицирования обучающихся при изучении биологических свойств возбудителя туляремии возможно использование только одного штамма, применяемого для вакцинации людей - F. tularensis 15 НИИЭГ (подвид holarctica). Однако данный штамм не может обеспечить изучение всего разнообразия микробиологических свойств других таксономических подвидов - tularensis, mediasiatica и novicida [3].
В связи с этим предварительно был проведен информационный поиск штаммов F. tularensis, перспективных для использования в учебном процессе. В поисковой системе найдены патенты с описанием способа получения вакцинных штаммов возбудителя туляремии путем селекции из чистой линии бактерий R-формы штамма F. tularensis 15 НИИЭГ [4]. Запатентован набор штаммов бактерий вида F. tularensis для получения контрольных ДНК препаратов, применяемый для генетических исследований [5]. Имеется патент, в котором описан аттенуированный штамм F. tularensis В 399 A-CoLe Strr 2500/K для разработки живой вакцины, являющийся стрептомицин-резистентным мутантом [6]. Однако использование этого штамма в учебном процессе возможно только при его чувствительности не менее чем к 2 антибактериальным препаратам (СанПиН 3.3686-21 п. 202). Таким образом, в ходе информационного поиска не удалось обнаружить сведений о штаммах или наборе штаммов F. tularensis, применяемых для освоения комплекса регламентированных методов лабораторной диагностики туляремии. Вместе с тем штамм F. tularensis В 399 A-CoLe Strr 2500/K был рассмотрен как перспективный для формирования учебного набора штаммов.
Цель исследования - подбор штаммов F. tularensis для формирования стандартизованного учебного набора.
Материал и методы
В работе использованы нормативные и методические документы по лабораторной диагностике туляремии и биобезопасности работ с патогенными биологическими агентами (ПБА); учебные программы профессиональной переподготовки для работ с возбудителями особо опасных инфекций (ООИ); паспорта штаммов F. tularensis, депонированных в Государственной коллекции патогенных бактерий
ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора; открытые научно-технические источники информации. В соответствии с паспортными данными отобраны 8 штаммов различных подвидов F. tularensis: 1 штамм - вакцинный; 2 - кандидаты в вакцинные, не прошедшие государственные испытания и 5 - вирулентные.
Методы исследования: аналитический, микробиологический, молекулярно-биологический, иммунологические, биологический и масс-спектрометрический анализ. Культурально-морфологические, биохимические свойства изучали с помощью регламентированных методов, изложенных в методических документах по лабораторной диагностике туляремии [7-9]. Штаммы F. tularensis выращивали на FT-агаре при температуре 37±1 °С в течение 48-72 ч.
Обнаружение видоспецифического антигена липополи-сахарида (ЛПС) проводили с помощью методов флюоресцирующих антител (МФА), иммуноферментного анализа (ИФА), иммунохроматографического анализа (ИХА) и реакции агглютинации специфической сывороткой (РА). Использовали медицинские изделия для in vitro диагностики «Иммуноглобулины диагностические туляремийные флуоресцирующие сухие», «Тест-система дот-иммуноферментная для детекции туляремийного микроба моноклональная», сыворотка диагностическая туляремийная сухая для РА, иммунохроматографическая тест-система для экспресс-выявления и идентификации возбудителя туляремии «ИХ тест F. tularensis». Работу осуществляли в соответствии с инструкциями фирм производителя.
Регистрацию результатов матрично-активированной лазерной десорбционно/ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) проводились на масс-спектрометре Bruker DaLtonics (Германия) серии Microflex™ LT с использованием программы Flex Control 3.4. Запись спектров была проведена в автоматическом режиме при частоте лазера 60 Гц в диапазоне масс от 2000 до 20 000 Да. Для получения одиночного масс-спектра использовали 40 импульсов лазера. Генерация спектра, анализ и обработка спектров были проведены с помощью программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0 (Bruker DaLtonics, Германия). Обеззараживание и приготовление экстрактов исследуемых штаммов микроорганизмов проводили в соответствии с МУК 4.2.3733-21 «Подготовка культур микроорганизмов I-II групп патогенности для анализа методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и создание баз данных референсных масс-спектров для автоматической идентификации микроорганизмов». В качестве матрицы использовали а-циано-4-гидроксикоричную кислоту. Оценку масс-спектров проводили с помощью Flex Analysis 3.4 (Bruker DaLtonics GmbH, Германия), выполняя сглаживание и вычитание базовой линии.
Выявление генетических маркеров, специфичных для возбудителя туляремии, осуществляли с помощью наборов реагентов в соответствии с инструкциями производителей и методическими указаниями [10]. Для определения вида F. tularensis использовали «Набор реагентов для выявления ДНК Francisella tularensis методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флюоресцентным учетом
результатов в режиме реального времени (ген Francisella tularensis - РГФ)», для идентификации и подвидовой дифференциации штаммов F. tularensis - «Набор реагентов для ускоренной идентификации штаммов F. tularensis методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с гибриди-зационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (ген Francisella tularensis - подвид РГФ)» и «Набор реагентов для выявления и идентификации ДНК возбудителя туляремии методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Туляремия-РВ)».
Для моделирования проб-имитаторов использовали коммерческие препараты, имитирующие биологические жидкости человека и сельскохозяйственного животного (сыворотка диагностическая туляремийная, а также сыворотка крови лошади), аллерген туляремийный жидкий (Тулярин), диагностикум туляремийный, физиологический раствор; нелинейные (аутбредные) белые мыши и блохи (инсектарий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора).
С использованием штаммов микроорганизмов учебного набора разработаны образцы: 8 проб - клинического материала; 1 проба - исследование сыворотки крови больного туляремией сельскохозяйственного животного; 2 пробы -грызуны, привезенные с полей; 1 проба - исследование кровососущих членистоногих на содержание возбудителя туляремии; 3 пробы - объекты окружающей среды, предназначенные для решения ситуационных бактериологических задач.
Вирулентность штаммов оценивали на нелинейных белых мышах массой тела 18-20 г, полученных из производственного комплекса по разведению экспериментальных животных ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора. Заражали белых мышей подкожно в область внутренней поверхности бедра взвесью, приготовленной из 48-часовой агаровой культуры F. tularensis в объеме 0,2 мл. Испытывали 4 дозы с 10-кратными разведениями от 5х103 до 5 КОЕ/мл. Наблюдение за зараженными мышами проводили в течение 15 дней. Павших лабораторных животных вскрывали, изучали пато-логоанатомическую картину и проводили посев паренхиматозных органов на FT-агар с целью выделения F. tularensis. Показатель вирулентности (LD50) рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина [11].
Эксперименты на лабораторных животных проводили в соответствии с требованиями действующих Санитарно-эпидемиологических правил и этическим кодексом по проведению медико-биологических исследований [12, 13].
Результаты и обсуждение
Для формирования учебного набора штаммов для модуля «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии» были проанализированы нормативные и методические документы по лабораторной диагностике туляремии, обеспечению биологической безопасности при работе с патогенными биологическими агентами и разработанные ранее критерии по подбору штаммов F. tularensis в качестве учебных [7-9, 14, 15].
Результаты анализа позволили детализировать критерии выбора штаммов F. tularensis для учебных целей:
■ вирулентность для белых мышей (LD50) при подкожном введении должна быть не менее 1х102 КОЕ [15] (вследствие отсутствия четких критериев, дающих возможность разделить штаммы F. tularensis по вирулентности, в основу первого критерия был взят количественный показатель «остаточная вирулентность», предъявляемый к вакцинным штаммам);
■ типичные для вида и подвидов культуральные и фи-зиолого-биохимические свойства F. tularensis;
■ наличие комплекса свойств для проведения внутривидовой дифференциации возбудителя туляремии, различающихся по способности ферментировать глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, глицерин, цитрулли-нуреидазу, а также по фосфатазной и р-лактамазной активности;
■ наличие генетических маркеров, специфичных для вида F. tularensis (iglBC) и подвидов [ISFtu2, FTT1670C, FTT_1272 (A), FTT_1272 (G), ISFtu5];
■ различия в структуре ЛПС у подвидов tularensis, mediasiatica, holarctica и novicida, выявляющиеся с помощью иммунологических методов исследования;
■ способность формировать патологоанатомические изменения (картина острого сепсиса) во внутренних органах лабораторных животных;
■ чувствительность к антибактериальным препаратам, регламентированным для экстренной профилактики туляремии.
С учетом вышеперечисленных критериев, паспортных данных и современной внутривидовой классификации возбудителя туляремии были отобраны для дальнейшего изучения 8 штаммов, из которых 2 отнесены к подвиду tularensis: Schu 7; B399A-CoLe Strr 2500/K; 3 - к подвиду mediasiatica: А-61(117); А-142 (112); А-148; 2 - к novicida: Like F 6168; Utah 112 (АТСС 15482) и 1 - к подвиду holarctica 15 НИИЭГ. Все штаммы отнесены к ПБА II группы пато-генности, исключение составляет F. tularensis 15 НИИЭГ (III группа патогенности).
Подобранную группу штаммов, перспективных в качестве учебных, изучили по спектру тинкториальных, культурально-морфологических и основных биохимических свойств в соответствии с практическим руководством «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» [7]. В мазках, приготовленных по методу Грама, клетки изучаемых штаммов имели вид отрицательно окрашенных кокко-бацилл. Культивирование штаммов F. tularensis подвидов holarctica и tularensis на питательной среде FT-агар характеризовалось формированием в течение 48-72 ч зрелых колоний в S-форме диаметром около 1,5 мм, слизистых, блестящих, хорошо снимающихся петлей с поверхности агаровой пластины. Рост бактерии подвида mediasiatica отличался формированием более мелких колоний диаметром не более 1 мм, штаммы подвида novicida образовывали крупные колонии диаметром 2 мм через 24-48 ч инкубации.
Все штаммы, кроме F. tularensis B399A-CoLe Strr 2500/K, были чувствительны к антибактериальным препаратам, регламентированным для экстренной профилактики туляремии.
Одним из этапов подвидовой идентификации возбудителя туляремии является изучение биохимических свойств по совокупности ряда признаков: ферментации глюкозы, мальтозы, глицерина, наличию или отсутствию цитрулли-нуреидазной, фосфатазной, р-лактамазной активности. По совокупности характеристик была подтверждена принадлежность отобранных штаммов к определенному подвиду. Штаммы F. subsp. mediasiatica фермен-
тировали глицерин, имели цитруллинуреидазную и фосфа-тазную активность, но отсутствовала р-лактамазная активность. Штаммы F. ^1агеп$1$ $иЬ$р. tularensis и F. ^1агеп$1$ $иЬ$р. пovicida характеризовались ферментацией глицерина, цитруллинуреидазной, р-лактамазной, фосфатазной активностью; штамм F. tulareпsis subsp. holarctica отличался отсутствием цитруллинуреидазы, фосфатазы, ферментации глицерина и наличием р-лактамазной активности. Таким образом, отобранные штаммы дают возможность выработать у обучающихся навыки определения подвидов.
Лабораторная диагностика туляремии у человека и животных включает использование регламентированных методов, направленных на выявление как антител к возбудителю, так и его антигенов. Поэтому отобранные штаммы были исследованы с помощью иммунологических методов (МФА, РА, ИХА, ИФА, РНГА) для выявления ЛПС разных подвидов F. tulareпsis. При иммунологической идентификации отобранных штаммов выявляли как положительные результаты (штаммы F. tulareпsis подвидов tulareпsis, mediasiatica и holarctica), так и отрицательный tulareпsis subsp. пovicida), что связано с особенностями химической структуры О-антигена у данного подвида [16].
В результате ПЦР-анализа исследуемых штаммов определены генетические маркеры, специфичные для вида F. tulareпsis - iglBC гены и соответствующие подвидам локусы Ши2, FTTl670c, FTT_1272 (А), FTT_1272 №и5 (табл. 1).
По результатам идентификации установлено, что все исследуемые штаммы туляремийного микроба содержат видоспецифичные гены ]'д1ВС. У штаммов F. tulareпsis подвида tulareпsis выявлены локусы FTT 1670с, FTT_1272 (G), ^^5; у штаммов подвида mediasiatica - локусы FTT 1670с, FTT_1272 (А), 5; у штамма подвида holarctica - локусы
ISFtu2, FTT_1272 (A), ISFtu5, у штаммов подвида novicida -только локусы FTT 1670c и FTT_1272 (A). Полученные данные в полной мере соответствуют типичной для вида и подвидов возбудителя туляремии молекулярной характеристике.
Для дополнительного подтверждения внутривидовой идентификации был проведен масс-спектрометрический анализ. В результате применения метода MALDI-TOF MS установлено наличие у данных штаммов общих родо- и видоспе-цифичных масс-пиков (3070, 3156, 4737, 5181, 6142, 6768, 9475, 10245±5 КДа). Также были обнаружены белки с массой 6730 и 7800 Да, которые были предложены как маркеры для F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. holarctica соответственно [17]. В результате идентификации F. tularensis subsp. с помощью MALDI-TOF MS значения оценочного коэффициента (Score) составили от 2,02 до 2,35, что достоверно подтверждало видовую принадлежность изучаемых штаммов F. tularensis. Известно, что при значении оценочного коэффициента Score >2 результат соответствует надежной идентификации до вида, а Score >2,5 - до подвида [18]. Однако, несмотря на то что значения Score не превышали 2,5, идентификация данных штаммов до подвида при масс-спектрометрическом анализе в 100% случаев совпала с паспортными данными и результатами подвидовой дифференциации в ПЦР (табл. 2).
Оценку вирулентных свойств отобранных штаммов F. tularensis проводили in vivo. Павших лабораторных животных вскрывали, фиксировали изменения вовнутренних органах (картина острого сепсиса) с выделением культуры туляремийного микроба на FT-агаре из лимфатических узлов и паренхиматозных органов. Сравнивая данные, представленные в табл. 2, было отмечено, что при заражении нелинейных белых мышей штаммы 4 подвидов туляремийного микроба можно разделить на 3 группы. 1-ю группу составили наименее вирулентные штаммы, относящиеся к подвиду novicida; во 2-ю вошли штаммы со сниженной вирулентностью подвидов tularensis и holarctica; в 3-ю - вирулентные штаммы подвида mediasiatica.
Таким образом, учитывая проведенную статистическую обработку данных по показателю (LD50) и основной критерий «остаточная вирулентность», были отобраны перспективные штаммы для включения в учебный набор, а именно F. tularensis Utah112 (АТСС15482), 15 НИИЭГ,
Таблица 1. Результаты идентификации штаммов ГгапаввИа Шагвпз1в методом полимеразной цепной реакции
Штамм Наборы реагентов для выявления генетических маркеров
«Ген Francisella tularensis - РГФ» «Ген Francisella tularensis -подвид - РГФ» «ОМ-Скрин-Туляремия-РВ»
iglBC ISFtu2 FTT 1670c FTT_1272 (A) FTT_1272 (G) ISFtu5
F. tularensis ssp. tularensis: Schu 7; B399A-Cole Strr 2500/k + - + - + +
F. tularensis ssp. mediasiatica + - + + - + А-61(117); А-142 (112); А-148
F. tularensis ssp. holarctica 15 НИИЭГ + + - + - +
F. tularensis ssp. novicida Like F + - + + - - 6168; Utah 112 (АТСС 15482)
Таблица 2. Результаты идентификации и вирулентность штаммов Ягапо1вв!!а Шагвпв1в
Номер штамма Подвид штамма* Результаты идентификации методом ПЦР Результат идентификации методом масс-спектрометрии, значение Score Величина LD50 для белых мышей, КОЕ/мл
A-142 mediasiatica F. tularensis mediasiatica F. tularensis mediasiatica - 2,09 2
А-61(117) mediasiatica F. tularensis mediasiatica F. tularensis mediasiatica - 2,25 4
A-148 mediasiatica F. tularensis mediasiatica F. tularensis mediasiatica - 2,06 2
Like F6168 novicida F. tularensis novicida F. tularensis novicida - 2,26 >105
Utah112 (АТСС15482) novicida F. tularensis novicida F. tularensis novicida - 2,12 >106
15 НИИЭГ holarctica F. tularensis holarctica F. tularensis holarctica - 2,02 928
В399А-Cole Strr 2500/k tularensis F. tularensis tularensis F. tularensis tularensis - 2,2 112*
Schu 7 tularensis F. tularensis tularensis F. tularensis tularensis - 2,35 136
* - по паспортным данным.
7 Schu, А-61(117). Выбранным критериям соответствовали штаммы подвидов novicida, holarctica, 1и1агепз!з. Представителя подвида mediasiatica, несмотря на превышение величины LD50 для белых мышей, необходимо включить в набор штаммов для реализации практических занятий по изучению слушателями курсов типичных биологических свойств подвида mediasiatica, а также демонстрации выраженной патологоанатомической картины при заражении лабораторных животных (интенсивная гиперемия сосудов подкожной клетчатки, формирование участков некроза в тканях селезенки и печени).
Вместе с тем полученные данные о вирулентности отобранных штаммов F. tularensis послужили основанием для разработки дифференцированного подхода к использованию их на практических занятиях при освоении слушателями курсов регламентированных методов индикации
и идентификации туляремийного микроба в рамках учебных тем модуля «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии» (табл. 3).
Таким образом, вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ может быть использован для индивидуальной работы слушателями курсов и преподавателями на всех этапах обучения регламентированным методам исследования; штаммы подвидов novicida, holarctica, tularensis tularensis и mediasiatica - только для демонстрации тестов преподавателями.
Разработаны стандартные учебные образцы, имитирующие пробы биологического материала и объектов окружающей среды, содержащие возбудителя туляремии, а также панель проб для освоения исследования материала с помощью ПЦР, для решения бактериологических задач с целью контроля полученных знаний и умений у слушателей курсов.
Таблица 3. Рекомендации к применению на практических занятиях демонстрационных штаммов Ягапо1вв!!а Шагвпв1в с различиями уровня вирулентности
Штамм Вирулентность штаммов, LD50 (КОЕ/мл) Контингент Цель использования штамма Р. 1и!агвпв1в на практических занятиях
F. tularensis 15 928 НИИЭГ - Изучение типичных видовых свойств, регламентированных методов лабораторной диагностики; - постановка тестов для подвидовой дифференциации Я. Ти!агвпв1в; Слушатели курсов - освоение биологического метода лабораторной диагностики; - исследование проб-имитаторов на практических занятиях; - освоение лабораторной диагностики с помощью иммунологических методов, ПЦР
- Подготовка проб-имитаторов ПБА для практических занятий Преподаватели и проб для ПЦР анализа
F. tularensis 7 Schu F. tularensis А-61 F. tularensis Utah 112 (АТСС 15482) 136 5 >106 Преподаватели - Демонстрация тестов подвидовой дифференциации Я. Ти!агвпв1в; - демонстрация вариантов результата при освоении метода ПЦР
- Демонстрация патологоанатомической картины туляремии Я. Ти!агвпв1в А-61 5 Преподаватели у лабораторных животных при подкожном заражении
Заключение
Сформирован и протестирован набор штаммов F. tuíareпsis, который может быть использован на курсах не только профессиональной переподготовки, но и повышения квалификации врачей-бактериологов, эпидемиологов, лаборантов. В рамках проведения практических занятий слушатели курсов имеют возможность самостоятельно отработать технику постановки регламентированных методов индикации и идентификации возбудителя туляремии с интерпретацией результатов. Предложенный набор штаммов позволяет безопасно проводить постановку ПЦР для формирования у обучающихся умения дифференцировать подвиды F. tulareпsis.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Работа преподавателя с комплектом штаммов возбудителя туляремии предоставляет возможность подготовить пробы-имитаторы ПБА, в том числе для ПЦР анализа с целью демонстрации определения подвидовой дифференциации F. tulareпsis. Использование отобранных штаммов при подкожном заражении позволит продемонстрировать патологоанатомическую картину туляремии у лабораторных животных.
Подана заявка на получение патента «Комплект штаммов бактерий для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза».
ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, Саратов, Российская Федерация:
Сазанова Елена Владимировна (Elena V. Sazanova)* - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела
образовательных программ и подготовки специалистов
E-mail: rusrapi@microbe.ru
https://orcid.org/0000-0001-9140-3910
Малюкова Татьяна Анатольевна (Tatyana A. Malyukova) - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела образовательных программ и подготовки специалистов E-mail: rusrapi@microbe.ru https://orcid.org/0000-0002-5629-4111
Попов Юрий Алексеевич (Yurij A. Popov) - доктор медицинских наук, главный научный сотрудник отдела образовательных программ и подготовки специалистов E-mail: rusrapi@microbe.ru https://orcid.org/0000-0001-7641-6334
Бойко Андрей Витальевич (Andrey V. Boyko) - доктор медицинских наук, доцент, ведущий научный сотрудник отдела диагностики и инфекционных болезней E-mail: rusrapi@microbe.ru https://orcid.org/0000-0001-9576-4959
Сеничкина Айслу Мухамятовна (Aislu M. Senichkina) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела диагностики и инфекционных болезней E-mail: rusrapi@microbe.ru https://orcid.org/0000-0003-1026-2680
Абдрашитова Адиля Саберьжановна (Adilya S. Abdrashitova) - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела диагностики и инфекционных болезней E-mail: rusrapi@microbe.ru https://orcid.org/0000-0003-1803-4156
Щербакова Наталья Евгеньевна (Natalia E. Shcherbakova) - научный сотрудник отдела диагностики и инфекционных болезней
E-mail: rusrapi@microbe.ru https://orcid.org/0000-0003-3261-6128
Ляшова Ольга Юрьевна (Olga Yu. Lyashova) - научный сотрудник отдела «Государственная коллекция патогенных бактерий»
E-mail: rusrapi@microbe.ru
https://orcid.org/0000-0002-1332-9580
Терехова Ирина Викторовна (Irina V. Terekhova) - научный сотрудник отдела диагностики и инфекционных болезней
E-mail: rusrapi@microbe.ru
https://orcid.org/0000-0003-3749-5011
Вахрушина Наталия Ивановна (Natalia I. Vakhrushina) - научный сотрудник отдела питательных сред
E-mail: rusrapi@microbe.ru
https://orcid.org/0000-0003-4400-9747
* Автор для корреспонденции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Попов Ю.А., Малюкова Т.А., Тихомирова Л.А., Кутырев В.В. Система подготовки специалистов по биологической безопасности в Российской Федерации // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2016. № 1 (14). С. 11-18.
2. Основы государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2025 года и дальнейшую перспективу: приказ Президента РФ от 01.11.2013 № Пр-2573.
3. Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.T., Garrity G.M. (eds). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 2: the Proteobacteria. Part A. Introductory essays. Boston : Springer, 2005. 304 p.
4. Пат. RU 2 308 969 A61K39/02 А61К35/74 d2N1/00 A61P31/04. Живая туляремийная вакцина Nik-sp. Francisella tularensis / Кисличкин Н.Н., Кислич-кина О.И., заявл. 2006-06-16, опубл. 27.10.2007.
5. Пат. SU № 1839960 С12Т1/60 А61К39/02. Штамм бактерий Francisella tularensis для приготовления живой вакцины против туляремийной инфекции / Кормилицына М.И., Маракуша Б.И., Петровская В.Г., Мещерякова И.С. заявл. 19.01.1987, опубл. 20.06.2006.
6. Пат. RU 2 443 772 C1 C12N C12Q C12N C12R. Набор штаммов бактерий вида Francisella tularensis для получения комплекта контрольных ДНК препаратов, комплект ДНК препаратов для генно-диагностических исследований. / Осина Н.А., Уткин Д.В., Сеничкина А.М., Бугоркова Т.В., Кутырев В.В. заявл.26.07.2010, опубл. 27.02.2012.
7. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней : практическое руководство / под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. 2-е изд., перераб. Москва : Шико, 2013. 560 с. ISBN 978-5-900758-68-8.
8. Эпидемиологический надзор за туляремией: методические указания МУ 3.1.2007-05. Москва : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотреб-надзора, 2005. 142 с.
9. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней: методические указания МУК 4.2.2939-11. Москва : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011. 59 с.
10. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности МУ 1.3.2569-09. Москва : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. 51 с.
11. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград : Медгиз, 1962. 180 с.
12. Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней: санитарно-эпидемиологические правила и нормы СанПиН 3.3686-21. Москва : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнад-зора, 28.01.2021. 1091 с.
13. Международные рекомендации (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных. CIOMS. Geneva, 1985. 1 c.
14. Сазанова Е.В., Осина Н.А., Горельникова Е.А., Попов Ю.А. Пути совершенствования освоения лабораторной диагностики туляремии на курсах дополнительного профессионального образования // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2020. Т. 9, № 3. C. 133-138. DOI: https://doi. org/10.33029/2305-3496-2020-9-3-133-138 (in Russian)
15. Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба: методические указания МУ 3.3.1.2161-07. Москва : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. 51 с.
16. Vinogradov E., Perry M.B., Conlan J.W. Structural analysis of Francisella tularensis lipopolysaccharide// Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269. Article ID 61126118. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1432-1033.2002.03321.x
17. Афанасьев М.В., Миронова Л.В., Балахонов С.В. MALDI-ToF масс-спектро-метрический анализ для идентификации возбудителей чумы, холеры и туляремии // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015. № 2. С. 3-8.
18. Regoui S., Hennebique A., Girard T., Boisset S., Caspar Y., Maurin M. Optimized MALDI TOF mass spectrometry identification of Francisella tularensis subsp. holarctica // Microorganisms. 2020. Vol. 8, N 8. P. 1143. DOI: https://doi. org/10.3390/microorganisms 8081143 PMID: 32731606.
REFERENCES
1. Popov Yu.A., Malyukova T.A., Tikhomirova L.A., Kutyrev V.V. System of training of specialists in biological safety in the Russian Federation. Infektsionnye bolezni: novosti, mneniya, obuchenie [Infectious Diseases: News, Opinions, Training]. 2016; 1 (14): 11-8. (in Russian)
2. Fundamentals of state policy in the field of ensuring chemical and biological safety of the Russian Federation for the period until 2025 and beyond: Order of the President of the Russian Federation dated November 1, 2013 No. Pr-2573. (in Russian)
3. Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.T., Garrity G.M. (eds). Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 2: the Proteobacteria. Part A. Introductory essays. Boston: Springer, 2005: 304 p.
4. Patent RU 2 308 969 A61K39/02 A61K35/74 C12N1/00 A61P31/04. Live tularemia vaccine Nik-sp. Francisella tularensis / Kislichkin N.N., Kislichkina O.I., statement 2006-06-16, published 10/27/2007. (in Russian)
5. Patent SU No. 1839960 C12T1/60 A61K39/02. Francisella tularensis bacterial strain for preparation of a live vaccine against tularemia infection / Kormilitsyna M.I., Marakusha B.I., Petrovskaya V.G., Meshcheryakova I.S. statement 01/19/1987, published 06/20/2006. (in Russian)
6. Patent RU 2 443 772 C1 C12N C12Q C12N C12R. A set of strains of bacteria of the species Francisella tularensis for obtaining a set of control DNA preparations, a set of DNA preparations for gene diagnostic studies. / Osina N.A., Utkin D.V., Senichkina A.M., Bugorkova T.V., Kutyrev V.V. statement 07/26/2010, published 02/27/2012. (in Russian)
7. Laboratory diagnosis of dangerous infectious diseases: a practical guide. Ed. G.G. Onishchenko, V.V. Kutyrev. 2nd ed., revised. Moscow: Shiko, 2013: 560 p. ISBN 978-5-9007 5 8-68-8. (in Russian)
8. Epidemiological surveillance of tularemia: guidelines MU 3.1.2007-05. Moscow: Federal Hygienic and Epidemiological Center of Rospotrebnadzor, 2005: 142 p. (in Russian)
9. The procedure for organizing and conducting laboratory diagnostics of tularemia for laboratories at the territorial, regional and federal levels: guidelines MUK 4.2.2939-11. Moscow: Federal Hygienic and Epidemiological Center of Rospotrebnadzor, 2011: 59 p. (in Russian)
10. Organization of work at laboratories using nucleic acid amplification methods when working with material containing microorganisms of pathogenicity groups I-IV MU 1.3.2569-09. Moscow: Federal Hygienic and Epidemiological Center of Rospotrebnadzor, 2010: 51 p. (in Russian)
11. Ashmarin I.P., Vorob'ev A.A. Statistical methods in microbiological research. Leningrad: Medgiz, 1962: 180 p. (in Russian)
12. Sanitary and epidemiological requirements for prevention of infectious diseases: sanitary and epidemiological rules and regulations SanPiN 3.368621. Moscow: Federal Hygienic and Epidemiological Center of Rospotrebnadzor, 01/28/2021: 1091 p. (in Russian)
13. International recommendations (code of ethics) for conducting biomedical research using animals. CIOMS. Geneva, 1985: 1 p.
14. Sazanova E.V., Osina N.A., Gorel'nikova E.A., Popov Yu.A. Ways to improve the mastering of laboratory tularemia diagnostics at vocational training courses Infektsionnye bolezni: novosti, mneniya, obuchenie [Infectious Diseases: News, Opinions, Training]. 2020; 9 (3): 133-8. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2020-9-3-133-138 (in Russian) (in Russian)
15. Basic requirements for vaccine strains of the tularemia microbe: guidelines MU 3.3.1.2161-07. Moscow: Federal Hygienic and Epidemiological Center of Rospotrebnadzor, 2007: 51 p. (in Russian)
16. Vinogradov E., Perry M.B., Conlan J.W. Structural analysis of Francisella tularensis lipopolysaccharide. Eur J Biochem. 2002; 269: 61126118. DOI: https:// doi.org/10.1046/j.1432-1033.2002.03321.x
17. Afanas'ev M.V., Mironova L.V., Balakhonov S.V. MALDI-ToF MS Analysis for Yersinia pestis, Vibrio cholera, and Francisella tularensis Identification. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology, Virology]. 2015; (2): 3-8. (in Russian)
18. Regoui S., Hennebique A., Girard T., Boisset S., Caspar Y., Maurin M. Optimized MALDI TOF mass spectrometry identification of Francisella tularensis subsp. holarctica. Microorganisms. 2020; 8 (8): 1143. DOI: https://doi.org/10.3390/ microorganisms 8081143; PMID: 32731606.
