Состояние системы гемостаза у крыс при однократном и многократном воздействии гипоксической гипоксии сильной интенсивности Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 612.13:616-005.4

СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА У КРЫС

ПРИ ОДНОКРАТНОМ И МНОГОКРАТНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ

ГИПОКСИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ СИЛЬНОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ

1 Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул

2 НИИ физиологии и фундаментальной медицины, г. Новосибирск

Москаленко С.В.1, Шахматов И.И.1,2, Киселев В.И.1,2,

Бондарчук Ю.А.1,2, Улитина О.М.1,2, Алексеева О.В.1,2

Цель исследования - провести анализ состояния реакции системы гемостаза у крыс на однократное и многократное воздействие гипоксической гипоксии сильной интенсивности. Материал и методы: в работе использовались крысы-самцы (40 особей) линии Вистар. Животные подвергались однократной/ежедневной многократной гипоксической гипоксии посредством «подъема» в барокамере в течение 1 часа. Гипоксиче-ская гипоксия моделировалась при помощи барокамеры приточно-вытяжного типа. Создаваемое в барокамере разряжение воздуха в режиме тренировки соответствовало подъему на «высоту» 7000 м над уровнем моря (41,105 кПА; 308,3 мм рт. ст., гипоксия сильной интенсивности). Результаты и их обсуждение. Однократное воздействие сильной интенсивности гипоксической гипоксии характеризуется состоянием тромботической готовности (на основании выявленной гиперкоагуляции и высокого уровня маркеров внутрисосудистого свертывания крови). После завершения 30-дневного цикла гипоксии сильной интенсивности отмечается активация системы тромбоцитарного звена системы гемостаза, гиперкоагуляция по внутреннему пути свертывания при исчезновении признаков тромбинемии. Кроме того, фиксировалось увеличение антитромбинового резерва плазмы крови в группе опытных животных. Ключевые слова: гипоксическая гипоксия, гемостаз.

The aim of the study was to analyze the state of the reaction of the hemostasis system in rats to a single and multiple exposure to hypoxic hypoxia of strong intensity. Materials and methods: male rats (40 individuals) of the Wistar line were used in the work. Animals were subjected to a single/daily multiple hypoxic hypoxia by "lifting" in a pressure chamber for 1 hour. Hypoxic hypoxia was modeled with the aid of a pressure chamber of the extract and exhaust type. The air discharge created in the pressure chamber in the training mode corresponded to a rise to a "height" of 7000 m above sea level (41.105 kPa, 308.3 mm Hg, hypoxia of strong intensity). Results and its discussion. A single exposure to a strong intensity of hypoxic hypoxia is characterized by a state of thrombotic readiness (based on the revealed hypercoagulation and high level of markers of intravascular coagulation). After completion of the 30-day cycle of severe intensity hypoxia, activation of the platelet system of the hemostasis system was noted, hypercoagulation along the internal clotting path with the disappearance of signs of thrombinemia. In addition, an increase in the antithrombin reserve of blood plasma was recorded in the group of experimental animals. Key words: hypoxic hypoxia, hemostasis.

Иccледование влияния длительной гипоксии на организм человека и животных до сих пор является одной из важнейших проблем физиологии и медицины. Эта проблема приобретает огабую актуальность в cвязи c тем, что cocтoяние гипоксии, пoмимo целoгo ряда забoлеваний, имеет место и в физиoлoгии спoрта, а также при ocвoении различных фед oбитания [1].

Адаптация к гипoкcии является очень свдж-ным и мгогогранным прoцеccoм, в готорый вовлекаются, по сути дела, все органы и системы организма, и прежде всего система крови [2, 3]. Установлено, что в ответ на острую гипоксию происходят фазные изменения в системе гемостаза. Первичгой реакцией системы гоагуляци-онного звена системы гемостаза является гипер-кoагуляция. Однаго более продолжительное пребывание на высоте приводит к развитию 20

гипoкоагуляции, oбуcлoвленной готреблением фактoрoв свертывания [4].

Ранее уже было изучено влияние гипоксической гипоксии (ГГ) на систему крови при низкой (4000 м), средней (5000 м) и умеренно сильной (6000 м) интенсивности [5]. Однако данные при гипоксии сильной (7000 м) и тяжелой (8000 м) интенсивности в литературе в основном представлены по гемореологии крови [6, 7], не затрагивая, в частности, систему гемостаза.

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось изучение состояния системы гемостаза в ответ на однократное и ежедневное многократное воздействие гипоксической гипоксии (ГГ) сильной интенсивности.

Материалы и методы

Исследования выполнены на 40 половозрелых крысах-самцах линии Wistar средней массой

254,0±36,0 г. Все экспериментальные животные были разделены на четыре группы: две контрольные (п=10х2) и две опытные группы (п=10х2).

Первая опытная группа подвергалась однократному воздействию ГГ в барокамере приточно-вытяжного типа в течение 1 ч при разрежении 41,105 кПА (308,3 мм рт. ст.), что соответствовало подъему на высоту 7000 м, при этом первая контрольная группа находилась в течение того же времени в барокамере в условиях обычного атмосферного давления; вторая опытная группа подвергалась 30-кратному ежедневному воздействию ГГ в течение 1 ч на «высоте» 7000 м, в то время как вторая контрольная группа находилась ежедневно в течение 1 ч на протяжении 30 дней в барокамере в условиях обычного атмосферного давления.

Режим гипоксического воздействия был основан на литературных данных: согласно Н.И. Мамадалиевой и соавт. (2014), моделирование подъёма на высоту 4000 м и 5000 м соответствует гипоксии низкой и средней интенсивности; «на высоте» 6000 м и 7000 м создаются условия гипоксии умеренно сильной и сильной интенсивности, а моделирование подъёма на высоту 8000 м соответствует гипоксии тяжелой интенсивности [8].

До начала проведения эксперимента на протяжении недельной адаптации к условиям вивария все крысы находились в стандартных условиях содержания. Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте, и директивами 86/609/ЕЕС. Обезболивание и умерщвление животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» [9].

Кровь для исследования у экспериментальных животных забиралась сразу после окончания однократного (первая опытная группа) либо 30-го экспериментального воздействия (вторая опытная группа). У крыс контрольных групп кровь забиралась сразу после окончания однократного/многократного нахождения в барокамере в условиях обычного атмосферного давления.

Кровь для исследования забиралась под эфирным наркозом из печеночного синуса в объеме 5 мл. Все пробы крови стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 [10].

Комплекс методик, позволяющий оценить состояние системы гемостаза, включал исследование агрегационной способности тромбоцитов, коагуляционного звена гемостаза, а также анти-коагулянтной и фибринолитической активности крови. В качестве реагентов для оценки системы гемостаза были выбраны диагностические наборы фирмы «Технология-Стандарт» (Россия)

с использованием коагулометра «Минилаб» (Россия), «Trombostat-2» (Германия). Подсчет количества тромбоцитов периферической крови проводился при помощи гематологического анализатора Drew3 - PAC (Великобритания). Определение агрегационной активности тромбоцитов осуществлялось при помощи агрего-метра «Биола», (Россия). Определение уровня антитромбина III проводилось при помощи спектрофотометра СФ-46 (Россия).

Все цифровые данные, полученные в ходе исследования, подвергались статистической обработке. Данные исследований представлены в виде m [25 %^75 %], где m - медиана в выборочной совокупности, [25 % ^75 %] - 25-й и 75-й перцентиль. Достоверность различий оценивали при помощи непараметрического U критерия Манна-Уитни. Различия считались достоверными при уровне статистической значимости р<0,05. Для обработки и хранения полученного экспериментального материала создавали базы данных с использованием редактора электронных таблиц Microsoft Excel 2010. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли при помощи программ математической статистики Jmp Statistical Discovery v 6.1.2 и Biostat 5.03 на персональном компьютере.

Результаты и обсуждение

Из полученных результатов следует, что после однократного воздействия ГГ в плазме крови регистрировалась активация сосуди-сто-тромбоцитарного звена системы гемостаза, характеризующаяся повышением АДФ-инду-цированной агрегации тромбоцитов на 43,8% (р<0,001). В коагуляционном звене гемостаза отмечалась гиперкоагуляция по внутреннему и внешнему путям, что проявлялось в укорочении активированного парциального тромбо-пластинового времени (АПТВ) на 7,7% (р<0,01) и протромбинового времени (ПВ) на 6,0% (р<0,01). На конечном этапе свертывания крови также регистрировалась гиперкоагуляция, что характеризовалось укорочением времени полимеризации фибрин-мономерных комплексов (ВПФМ) на 15,4% (р<0,001).

Кроме того, было зафиксировано снижение количества фибриногена на 20,7% (р<0,001), увеличение содержания РФМК на 50% (p<0,001), а также снижение антитромбинового резерва плазмы крови на 16,2 % (р<0,001).

Анализ результатов экспериментов показал, что реакцией системы гемостаза в ответ на однократное воздействие ГГ сильной интенсивности является выраженная активация сосу-дисто-тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза, сопровождающаяся признаками развития состояния тромботической готовности (на основании выявленной гиперкоагуляции и высокого уровня маркеров внутрисосудистого

свертывания крови, а также снижения антикоа-гулянтного резерва плазмы крови [10]).

Таким образом, со стороны системы гемостаза в ответ на однократное общее воздействие ГГ сильной интенсивности отмечалось резкое смещение гемостатического потенциала в сторону тромбинемии, что может быть расценено как дистрессорный ответ.

Состояние системы гемостаза, зарегистрированное после 30-кратного воздействия ГГ, характеризовалось активацией сосудисто-тромбоци-тарного звена, что проявлялось повышением агрегационной активности тромбоцитов на 20,3 % (р<0,001). Со стороны плазменного гемостаза отмечалась гиперкоагуляция по внутреннему пути (укорочение АПТВ на 8,8 % (р<0,001)), кроме того, было зафиксировано повышение концентрации фибриногена на 23,3 % (р<0,01).

Как видно из той же таблицы, гепарин-ко-факторная активность антитромбина III в тромбин-гепариновом тесте (АРП-антитромбино-вый резерв плазмы) увеличивалась на 8,7% (р<0,001). Уровень антикоагулянта антитромбина III повышался на 10,8% (р<0,01), а фибрино-литическая активность, оцениваемая по спонтанному лизису эуглобулинов, увеличивалась на 24,4% (р<0,05).

В отличие от реакции системы гемостаза в ответ на однократное воздействие ГГ, состоя-

ние системы гемостаза, зарегистрированное после окончания 30-дневного цикла воздействия ГГ сильной интенсивности, характеризуется менее выраженной активацией сосудисто-тром-боцитарного звена при сохраняющейся гиперкоагуляции по внутреннему пути свертывания. При этом зарегистрированная на этом этапе гиперкоагуляция по внутреннему пути свертывания плазмы крови компенсировалась выраженной активацией фибринолитической системы крови. Стоит также учитывать, что после 30-кратного воздействия ГГ отсутствует повышение маркера внутрисосудистого свертывания - РФМК в плазме крови. Кроме того, на фоне менее выраженных по сравнению с однократным воздействием гиперкоагуляцион-ных сдвигов отмечался рост антикоагулянтной активности плазмы крови.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что к 30-му дню гипоксических воздействий практически исчезали все признаки состояния тромботической готовности, регистрируемой сразу по окончании однократной ГГ сильной интенсивности. Анализ полученных данных позволяет охарактеризовать состояние системы гемостаза после 30-кратных ежедневных тренировок ГГ как проявление долговременной адаптации к данному виду стрессора.

Таблица 1

Показатели системы гемостаза плазмы крови крыс после однократного и многократного воздействия гипоксической гипоксии (т [25 %^75 %])

Показатели Однократное воздействие ГГ (1 ч - 7000 м) 30-кратное воздействие ГГ (1 ч - 7000 м)

Контроль 1 Опыт 1 Контроль 2 Опыт 2

Тромбоциты, х109/л 473,0 [464,5-489,8] 492,5 [456,8-507,5] 495,0 [487,0-498,0] 508,5 [502,5-515,0]

Индуцированная АДФ-а-грегация тромбоцитов, макс. значение 27,4 [23,9-28,9] 39,4*** [37,6-40,5] 21,7 [21,3-22,9] 26,1*** [24,8-27,4]

АПТВ, с 18,1 [17,7-18,8] 16,7** [15,5-17,2] 16,0 [15,7-16,4] 14,6*** [12,6-15,3]

Протромбиновое время, с 26,0 [24,7-27,1] 24,4** [23,7-24,8] 21,7 [20,4-23,5] 21,2 [19,9-22,0]

Тромбиновое время, с 46,7 [45,2-48,0] 43,1 [40,7-45,7] 42,7 [39,8-43,6] 41,9 [39,8-44,0]

ВПФМ, с 59,1 [56,9-61,0] 50,0 *** [49,2-52,0] 62,5 [60,8-63,1] 61,9 [60,3-64,7]

Фибриноген, г/л 2,9 [2,8-2,9] 2,3*** [2,3-2,3] 3,0 [2,8-3,2] 3,7** [3,5-3,9]

РФМК, мг/100 мл 3,0 [3,0-3,1] 4,5*** [4,0-5,4] 3,0 [3,0-3,0] 3,0 [3,0-3,1]

Антитромбин III, % 94,5 [88,8-97,3] 89,0 [84,0-90,7] 102,5 [99,8-104,1] 113,6** [110,9-115,5]

Антитромбиновый резерв плазмы, % 87,9 [84,4-92,4] 73,7*** [71,9-83,0] 84,3 [82,0-87,5] 91,6*** [89,4-96,4]

Спонтанный эуглобули-новый фибринолиз, мин 600,0 [570,0-630,0] 540,0 [532,5-637,5] 615,0 [570,0-660,0] 465,0* [450,0-480,0]

Примечание: Обозначены статистически значимые отличия от соответствующих показателей группы контроля: * - при р < 0,05; ** - при р < 0,01; *** - при р < 0,001. АПТВ - активированное парциальное тромбопластиновое время; ВПФМ - время полимеризации растворимых фибрин-мономерных комплексов; РФМК - растворимые фибрин-мономерные комплексы. СТ - время коагуляции; а - угловая константа; MCF - максимальная амплитуда ТЭГ; CFT - время образования сгустка; МЬ - максимальный лизис.

Заключение

Выявлено, что реакцией системы гемостаза на однократное воздействие ГГ сильной интенсивности является активация сосудисто-тром-боцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза, сопровождающаяся признаками развития состояния тромботической готовности.

Установлено, что в ходе ежедневных гипок-сических тренировок исчезают признаки тром-ботической готовности, зафиксированные при однократном воздействии, регистрируется рост фибринолитической и антикоагулянтной активности крови.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что ежедневное применение тренировочного режима ГГ сильной интенсивности в течение 30 дней способствует повышению резистентности организма к дефициту кислорода и снижает риск развития тромбообразования.

Список литературы

1. Marotta S.F. Comparative effects of hypoxia, adrenocorticotropin and methylcholineon adrenocortical secretory rates. Proc Soc Exp Biol Med. 1972; 141(3): 923-927.

2. Макаренко А.Н., Карандеева Ю.К. Адаптация к гипоксии как защитный механизм при патологических состояниях. Вестник проблем биологии и медицины. 2013; 2 (100): 27-33.

3. Рачков А.Г., Курманбекова Г.Т., Айдаров З.А. Высокогорный тромбогеморрагический синдром, прогноз и пути коррекции. В кн.: Материалы международной конференции. Бишкек, 14-18 октября 1996 г. Бишкек; 1996: 419-420.

4. Шахматов И.И., Киселев В.И., Вдовин В.М. Состояние системы гемостаза при различных видах гипоксического воздействия. Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2010; 2: 131-137.

5. Шахматов И.И., Вдовин В.М., Бондарчук Ю.А., Алексеева О.В., Киселев В.И. Гипоксиче-ская гипоксия как фактор, активирующий систему гемостаза. Бюллетень сибирской медицины. 2007; 1: 67-73.

6. Турганбаева А.С., Шошенко К.О. Распределение сердечного выброса у бодрствующих крыс при снижении температуры тела на 2,3 С из-за охлаждения или гипоксии. Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 1996; 82 (12): 65-71.

7. Черешнев В.А., Юшков Б.Г., Климин В.Г., Лебедева Е.В. Иммунофизиология. Екатеринбург: УрО РАН; 2002: 260.

8. Мамадалиева Н.И., Саатов Т.С., Хайбулли-на З.Р., Умеров О.И. Влияние фармакоррекции на активность ферментов защиты от активных форм кислорода в сердце при адаптации к гипоксии различной интенсивности и длительности. Вестник Новосибирского государственного педагогического университета. 2014; 1 (17): 221-229.

9. Council Directive 86/609/EEC of 24 November 1986 on the Approximation of Laws, Regulations of the Member States Regarding the Protection of Animals Used for Experimental and Other Purposes Directive. Official Journal of the European Communities. 1986; L 358; 18/12/1986: 1-28.

10. Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. М.: Ньюдиамед; 2001: 306.

Контактные данные

Автор, ответственный за переписку: Москаленко Светлана Валерьевна, преподаватель кафедры нормальной физиологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул. 656038, г. Барнаул, пр-т Ленина, д. 40. Тел.: (3852) 566928. Email: sunrisemsv@gmail.com

Информация об авторах

Шахматов Игорь Ильич, д.м.н., заведующий кафедрой нормальной физиологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул.

656038, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126. Тел.: (3852) 566928. Email: iish59@yandex.ru

Киселев Валерий Иванович, д.м.н., профессор,

профессор кафедры нормальной физиологии

Алтайского государственного медицинского

университета, г. Барнаул.

656038, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126.

Тел.: (3852) 566928.

Email: vik@mail.ru

Бондарчук Юлия Алексеевна, к.м.н., доцент кафедры нормальной физиологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул.

656038, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126.

Тел.: (3852) 566928.

Email: bondarchuk2606@yandex.ru

Улитина Оксана Михайловна, к.м.н., доцент кафедры нормальной физиологии Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул.

656038, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126. Тел.: (3852) 566928. Email: oulitina@mail.ru

Алексеева Ольга Васильевна, к.м.н., доцент Алтайского государственного медицинского университета, г. Барнаул. 656038, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 126. Тел.: (3852) 566928. Email: alekseeva0506@mail.ru