CC BY
23
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
DOI: 10.23868/201906023
состояние rig-i- и nf-кв-сигнальных путей в мононуклеарных клетках цельной крови практически здоровых лиц и реконвалесцентов пневмонии, подвергнутых митогенной стимуляции
И.В. Терехов1, В.С. Никифоров2, С.С. Бондарь1, Н.В. Бондарь3, В.К. Перфенюк4
1 Тульский государственный университет, Тула, Россия
2 Северо-Западный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
3 Орловский государственный университет им. И.С. Тургенева, Орел, Россия
4 Саратовский государственный медицинский университет им В.И. Разумовского, Саратов, Россия
condition of rig-i- and nf-kb-signal pathways in mononuclear cells of whole blood of practically healthy people and reconvencents of pneumonia affected by mitogenic stimulation
I.V. Terekhov1, V.S. Nikiforov2, S.S. Bondar1, N.V. Bondar3, V.K. Parfenyuk4
1 Tula State Medical University, Tula, Russia
2 Northwestern Medical University n. a. I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia
3 Orel State University, Orel, Russia
4 Saratov State Medical University n. a. V.I. Rasumoskij, Sairatov, Russia e-mail: trft@mail.ru
В противовирусной и антимикробной защите организма ключевую роль играют ЯЮ-!- и 1\1Р-кВ-сигнальные пути. ЯЮ-!-сигнальный путь активирует интерферон-регулируемые факторы !ЯР3 и !ЯР7, а центральный компонент 1\1Р-кВ-сигнального пути — ядерный фактор транскрипции ЫР-кВ, определяет продукцию клетками эндогенных антимикробных пептидов и ин-терферонов. Одним из ключевых регуляторов ЯЮ^-сигнального пути является митохондриальный протеин МДУБ, интегрирующий сигналы с рецепторов, распознающих паттерны патоген-ности. Влияние различных факторов, таких как, бактериальные токсины, свободные радикалы, активные формы кислорода, приводит к дисфункции МДУБ, нарушению противовирусной резистентности и прогрессированию вирусной инфекции. Вместе с тем, несмотря на важную роль протеинов ИЫ-сигнального пути и компонентов ЫР-кВ-сигнального пути в обеспечении резистентности организма к инфекциям и в саногенезе, их значение в постклиническую фазу изучено недостаточно полно.
Цель исследования — оценить содержание компонентов ЯЮ-!- и ЫР-кВ-сигнальных путей в мононуклеарных клетках цельной крови практически здоровых лиц и реконвалесцентов пневмонии после воздействия комплексного митогена.
Методом иммуноферментного анализа определяли содержание в мононуклеарных клетках цельной крови компонентов ЫР-кВ-сигнального пути (р50, р65, с-Яе!, 13е!В, 1\1Р-кВ2), протеинкиназы ингибитора ядерного фактора транскрипции ЫР-кВ (!кВ), протеинов РЮ-!-сигнального пути (ТАК1, ТВК1, ТЯ!М25, ТМЕМ173, РЫР125, !ЯР3, !ЯР7, МДУБ), ЯЮ-!-зависимой хеликазы (ШР2), оценивали уровень фосфо-рилирования протеинкиназы р38 и !кВ, а также продукцию клетками цельной крови ИЛ-4, ИЛ-12, РДЫТЕБ, кателициди-на и интерферонов (ИФНр и ИФНа). Установлено, что в субклиническую фазу внебольничной бактериальной пневмонии в мононуклеарных клетках цельной крови после стимуляции комплексным митогеном, содержащим липополисахарид, по сравнению с практически здоровыми лицами, снижалось содержание Яе!В, МДУБ, 014X58, !ЯР7, отмечалось дефосфо-рилирование протеинкиназы р38. Напротив, концентрации !кка, !ККр, уровень фосфорилирования !кВа, содержание протеинов ТЯ!М25, ТМЕМ173, 0Т1ГО5, ЯЫР125 и ТВК1 были повышены. Эти изменения сопровождались статистически значимым снижением продукции ИЛ-4, ИЛ-12, ЯДЫТЕБ, кате-лицидина и ИФНр на фоне повышения уровня ИФНа.
Воздействие на мононуклеарные клетки цельной крови комплексного митогена приводило к изменению соотношения компонентов сигнальных путей, определяющих антибактериальную и противовирусную резистентность организма. У больных
The key role in the antiviral and antimicrobial defense of the body is played by the RIG-I and NF-kB signaling pathways. The RIG-I signaling pathway activates interferon-regulated factors IRF3 and IRF7, and the central component of the NF-kB signaling pathway, the nuclear transcription factor NF-kB, determines the production of endogenous antimicrobial peptides and interferons by cells. One of the key regulators of the RIG-I signaling pathway is the mitochondrial protein MAVS, which integrates signals from receptors that recognize pathogenicity patterns. The influence of various factors, such as bacterial toxins, free radicals, reactive oxygen species, leads to MAVS dysfunction, impaired antiviral resistance and the progression of viral infection. However, despite the important role of the proteins of the RIG-I-pathway and the components of the NF-KB-signaling pathway in ensuring the body's resistance to infections and sanogenesis, their significance in the postclinical phase has not been fully studied.
The aim of the study was to evaluate the content of the components of RIG-I and NF-kB signaling pathways in mononuclear cells of whole blood of healthy individuals and pneumonia convalescents after exposure to a complex mitogen.
The enzyme-linked immunosorbent assay determined the content of components of the NF-kB signaling pathway (p50, p65, c-Rel, RelB, NF-kB2), protein kinases of the NF-kB nuclear transcription factor inhibitor (IkB), and RIG-I- proteins in mononuclear cells of whole blood the signal path (TAK1, TBK1, TRIM25, TMEM173, RNF125, IRF3, IRF7, MAVS), RIG-I-dependent helicase (LGP2), the level of phosphorylation of protein kinase p38 and IkB, as well as the production of whole blood cells IL-4, IL-, were evaluated 12, RANTES, cathelicidin and interferons (IFN-p and IFNa). It was established that in the subclinical phase of community-acquired bacterial pneumonia in mononuclear cells of whole blood after stimulation with a complex mitogen containing lipopolysaccharide, the content of RelB, MAVS, DHX58, and IRF7 decreased compared to practically healthy individuals, p38 protein kinase dephosphory-lation was noted. In contrast, the concentrations of IKKa, IKKp, the level of phosphorylation of kBa, the protein content of TRIM25, TMEM173, OTUD5, RNF125 and TBK1 were increased. These changes were accompanied by a statistically significant decrease in the production of IL-4, IL-12, RANTES, cathelicidin and IFN-p against the background of an increase in the level of IFNa.
The effect on the mononuclear cells of whole blood of a complex mitogen led to a change in the ratio of the components of the signaling pathways that determine the antibacterial and antiviral defense of the body.
In patients with pneumonia, against the background of mitogenic stimulation, the production of cathelicidin, RANTES and
пневмонией на фоне митогенной стимуляции была снижена продукция кателицидина, RANTES и ИФНр, обнаружены дефицит транскрипционного фактора RelB семейства NF-кВ и увеличение содержания протеинов OTUD5 и RNF125.
ключевые слова: RIG-I-сигнальный путь, RelB, RNF125, OTUD5, NF-кВ-сигнальный путь, пневмония.
введение
В поддержании противовирусной и антимикробной защиты организма ключевую роль играют RIG-I- и NF-кВ-сигнальные пути. RIG-I-сигнальный путь активирует интер-ферон-регулируемые факторы IRF3 и IRF7, а центральный компонент NF-кВ-сигнального пути — ядерный фактор транскрипции NF-кВ, определяет продукцию клеткой эндогенных антимикробных пептидов и интерферонов-альфа (ИФНа) и бета (ИФНр). Цитоплазматические рецепторы RIG-I-сигнального пути, такие как RIG-I, MDA5, LGP2 (DHX58), способны распознавать компоненты вирусного генетического материала, в частности двуцепочечные РНК (дцРНК). Регулируя активность одного из ключевых протеинов системы противовирусного ответа — MAVS, через ряд адапторных белков (протеинов TMEM173 (STING), ТВК1, TRAF3) они активируют факторы IRF3 и IRF7, стимулируя продукцию интерферонов I класса [1]. В данной системе роль отрицательной обратной связи играют протеины RNF125 и OTUD5, обеспечивая деградацию адапторных молекул TRAF3, а также RIG-I хеликаз [2, 3].
Ядерный фактор транскрипции NF-кВ так же является необходимым компонентом противовирусной защиты, активируя транскрипцию интерферон-индуцируемых генов и стимулируя продукцию ИФНр [4]. Кроме того, NF-кВ играет ключевую роль в антибактериальной защите, активируя продукцию эндогенных антимикробных пептидов, включая кателицидин (LL37), интерлейкины (ИЛ) 4 и 12, хемокины (RANTES, MCP-1), участвуя в формировании воспалительной реакции в ответ на активацию толл-подобных рецепторов, распознающих компоненты грам-положительных и грамотрицательных бактерий и грибов. Недостаточная активация NF-кВ в ответ на бактериальную стимуляцию и связанный с этим дефицит цитокинов и антимикробных пептидов, приводит к прогрессированию заболевания, сопровождаясь развитием осложнений, а также переходом инфекции в хроническую форму [4]. В то же время, клиническое завершение инфекционного процесса не определяет полного восстановления внутриклеточных регуляторных механизмов гомеостаза, с чем, очевидно, связаны рецидивы инфекционных заболеваний у реконвалесцентов, а также случаи суперинфекции, вызываемой широко распространенными вирусами гриппа А [5-7]. Однако, несмотря на важную роль указанных сигнальных путей в обеспечении резистентности организма к инфекциям, их значение в процессах саногенеза в настоящее время исследовано недостаточно полно.
Учитывая актуальность дальнейшего изучения молекулярных механизмов развития патологических состояний, а также поиска новых терапевтических мишеней для повышения эффективности лечения инфекционной патологии, целью работы являлась оценка содержания компонентов RIG-I- и NF-кВ-сигнальных путей в монону-клеарных клетках цельной крови практически здоровых лиц и реконвалесцентов пневмонии после воздействия комплексного митогена.
материал и методы
Проведение клинического исследования было одобрено Локальным этическим комитетом медицинского института ФГБОУ ВО «Тульский государственный
IFNp was reduced, deficiency of the transcription factor RelB of the NF-kV family and an increase in the content of OTUD5 and RNF125 proteins were detected.
Keywords: RIG-I-like signaling pathway, RelB, RNF125, OTUD5, NF-kB, pneumonia.
университет» (Протокол № 2 от 01.09.2014). Все пациенты и доноры подписывали информированное согласие.
Материалом для исследования служила венозная кровь из периферической вены. В основную (опытную) группу входили 30 пациентов мужского пола (средний возраст — 26±5 лет) с бактериальной внебольничной пневмонией (ВП) нетяжелого течения (60-65 баллов по шкале PORT) на 15-17 сут. заболевания (непосредственно перед выпиской из клиники). Контрольную группу составили 1 5 практически здоровых доноров мужского пола (средний возраст — 27±6 лет).
Для оценки митоген-стимулированного уровня изучаемых факторов к 1 мл венозной крови, разбавленной средой DMEM в соотношении 1:5, добавляли комплексный лиофильный митоген, содержащий 2 мкг липополисахарида (ЛПС) и по 4 мкг конканавалина А и фитогемагглютинина Р, и инкубировали в течение 24 ч. при 37°С.
В работе использовали наборы для культивирования и митогенной стимуляции клеток цельной крови «Цитокин-Стимул-Бест» (ЗАО «Вектор Бест», Новосибирск) [7].
После инкубации из флаконов с образцами крови забирали 1 мл супернатанта для определения методом иммуноферментного анализа (ИФА) концентрации ИЛ 4, 6 и 12, хемокина, продуцируемого активированными Т-лимфоцитами (RANTES), эндогенного антимикробного пептида (кателицидина, LL37), ИФНа и ИФ^.
Для получения фракции мононуклеарных клеток крови (МНК) 4 мл клеточной суспензии после стимуляции образцов крови комплексным митогеном наслаивали на раствор фиколл-верографина (р=1,077, МедБиоСпектр, Россия) с последующим центрифугированием при 5000 об/мин. в течение 30 мин. Выделенные МНК дважды отмывали в фосфатно-соле-вом буфере и 1 мл клеточной суспензии, содержащей 5х106 клеток, лизировали, выдерживали на льду (при t=+4-5°C) в течение 15 мин., аликвотировали и замораживали при -76°С [7, 8].
В полученных лизатах методом ИФА оценивали содержание Е3-убиквитин-лигазы TRIM25, протеинкиназы TBK1, протеинов TMEM173, RNF125, OTUD5, TRAF3, изоформ а, ß, у киназы ингибитора ядерного фактора транскрипции NF-kB (IKKa, IKKß, iKKy), субъединиц р65, p50, c-Rel, RelB, NF-kB2 (р52) ядерного фактора транскрипции NF-kB и факторов IRF3, IRF7, MAVS, DHX58, IFIH1. Кроме того, определяли степень фосфорилиро-вания по серину в положении 32 ингибитора ядерного фактора транскрипции NF-kB (kBa), а также степень фосфорилирования по треонину/тирозину в положении 180/182 митоген-активируемой протеинкиназы р38.
ИФА проводили на анализаторе Personal LAB (Adaltis Italia S.p.A., Италия): разрешение фотометрирования не меньше 0,001 ед. оптической плотности (0,03%), точность измерения оптической плотности не меньше 0,5%.
Для определения исследуемых факторов в лизатах МНК использовали наборы реактивов: KH00221, KH00071 (Thermo Fisher Scientific, США), CSB-EL024461 HU, CSB-EL005420HU, CSB-EL011572HU, CSB-EL011574HU, CSB-EL019554HU, CSB-EL024148HU, CSB-EL017293HU, CSB-EL013526HU,
таблица 1. Уровень регуляторных факторов в МНК после воздействия комплексного митогена в группе реконвалесцентов ВП и в группе доноров
Контрольная группа
Основная группа
Факюр Ме 25% 75% Ме 25% 75% р
iKBa, ед./нг 0,29 0,27 0,30 0,33 0,32 0,37 0,002
p38, ед./нг 0,51 0,33 0,80 0,46 0,31 0,94 0,07
TRIM25, нг/мл 4,34 3,63 4,38 4,55 4,31 4,92 0,0014
TMEM173, нг/мл 4,42 3,52 4,59 4,75 4,22 5,17 0,0015
RNF125, нг/мл 3,53 2,63 4,37 4,41 4,09 4,74 0,025
TBK1, нг/мл 193,70 162,50 244,1 254,20 189,30 273,80 0,0045
IKKa, нг/мл 6,72 6,37 7,50 6,66 6,04 7,57 0,13
IKKß, нг/мл 5,32 5,27 5,49 5,74 5,37 5,76 0,00007
IKKy, нг/мл 5,36 4,78 5,91 5,62 5,49 5,76 0,0011
p50, нг/мл 5,42 5,20 5,61 5,27 5,16 5,73 0,89
p65, нг/мл 6,38 5,81 6,42 6,37 6,14 6,45 0,26
RelB, нг/мл 3,63 2,94 4,12 2,95 2,63 3,73 0,056
c-Rel, нг/мл 4,00 3,69 4,22 3,82 3,75 4,07 0,27
NF-kB2, нг/мл 3,73 3,66 3,77 3,66 3,57 3,77 0,07
IRF7, нг/мл 66,90 55,50 82,60 48,10 29,60 76,40 0,0007
IRF3, нг/мл 13,00 11,90 14,50 13,50 11,70 14,50 0,89
MAVS, нг/мл 4,46 3,90 4,66 3,92 3,51 4,43 0,004
DHX58, нг/мл 3,84 3,70 3,93 3,28 3,18 3,59 0,0000001
IFIH1, нг/мл 167,20 130,30 177,60 163,00 121,10 181,50 0,46
TRAF3, нг/мл 6,08 5,90 6,29 6,32 6,20 6,47 0,014
OTUD5, нг/мл 3,98 2,86 4,71 4,68 3,99 4,77 0,022
Примечания: р — статистическая значимость различий исследованных факторов в основной группе и группе контроля.
CSB-EL006884HU, CSB-EL011017HU, CSB-EL023754HU, CSB-EL019827HU, CSB-EL011822HU, CSB-EL011818HU, CSB-EL015760HU, CSB-EL023232HU (Cusabio Biotech, Китай), EK1111, EK1121, EK4101 (Panomix, США); в клеточных супернатантах: CSB-E14948h (Cusabio Biotech, Китай), SEA111 Hu, SEA222Hu (Cloud-Clone, США), MG51042 (IBL, Германия), BMS216, BMS287, BMS603 (Bender Medsystems, Австрия).
Подсчет клеток и анализ жизнеспособности выполняли на счетчике клеток TC20 (Bio-Rad, США). Жизнеспособность выделенных МНК превышала 90%.
Статистическую обработку осуществляли с применением программы Statistica 7.0. Результаты исследования представлены в виде: медиана выборки; 25 и 75 про-центили (25%, 75%). Статистическую значимость (р) межгрупповых различий в несвязанных выборках оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни, взаимосвязь между исследованными факторами — методом линейного корреляционного анализа.
результаты и обсуждение
Анализ уровня регуляторных факторов в МНК после воздействия комплексного митогена в группе рекон-валесцентов ВП и в группе доноров (табл. 1) показал у реконвалесцентов ВП статистически значимое повышение содержания адапторных протеинов, в том числе TRAF3 на 4,0%, TRIM25 на 4,8%, TMEM173 на 7,5%, OTUD5 на 17,6%, RNF125 на 24,9% и TBK1 на 31,2%.
На этом фоне было отмечено снижение содержания МАУБ на 12,1%, 0НХ58 на 14,6% и ^7 на 28,1%, при отсутствии значимых различий уровней ^3 и 1ПН1. Кроме того, в МНК наблюдалось повышение концентраций 1ККр на 7,9%, 1ККу на 4,9%, а также увеличение степени фосфорилирования 1кВа на 13,8%, сочетавшееся со снижением содержания Ре!В на 18,7% и уменьшением степени фосфорилиро-вания протеинкиназы р38 на 9,8%.
Таким образом, у реконвалесцентов ВП под воздействием комплексного митогена происходила дисрегуляция RIG-I-сигнального пути, проявляющаяся повышением уровня их негативных регуляторов на фоне дефицита протеинов МАУБ, ОНХ58 и ^7. Повышенный уровень факторов RNF125 и 0Т1Ю5, являющихся отрицательными регуляторами противовирусного ответа, в сочетании со снижением содержания протеина МАУБ, позволяет предполагать формирование у обследованных больных условий для снижения противовирусной защиты при повторном контакте с патогеном.
При определении содержания эффекторных молекул в МНК после воздействия комплексного митогена в группе реконвалесцентов ВП и в группе доноров (табл. 2) было обнаружено статистически значимое повышение у реконвалесцентов ВП продукции ИФНа на 14,0%, при снижении продукции 1_1_37 на 12,5%, RANTES на 24,1%, ИЛ-6 на 12,0%, а ИФНр на 61,7%. Полученные данные указывают на дефицит у обследованных больных факторов неспецифической антимикробной
таблица 2. Уровень эффекторных факторов в МНК после воздействия комплексного митогена в группе реконвалесцентов ВП и в группе доноров
Контрольная группа
Основная группа
Факюр Ме 25% 75% Ме 25% 75% р
LL37, нг/мл 5,53 5,17 6,02 4,84 4,41 5,18 0,0000001
RANTES, пг/мл 18,70 12,10 20,00 14,20 11,50 20,00 0,034
ИЛ-12, пг/мл 20,20 17,20 22,20 18,90 17,10 25,80 0,58
ИЛ-4, пг/мл 21,70 19,40 24,10 23,10 17,60 24,10 0,55
ИЛ-6, пг/мл 17,50 16,70 18,30 15,40 13,60 18,10 0,036
ИФНа, пг/мл 64,10 59,60 71,90 73,10 67,70 92,90 0,0000001
ИФНр, пг/мл 22,00 13,50 26,60 8,40 7,80 13,70 0,0007
Примечания: р — статистическая значимость различий исследованных факторов в основной группе и группе контроля.
таблица 3. Взаимосвязь между компонентами ЯЮ-!- и ЫР-кВ-сигнальных путей в группе контроля
LL37 MAVS ИФНа ИФНр STING TRIM25 I IRF7 RelB
LL37 — 0,5 -0,67 0,36 -0,68 -0,76 -0,89 0,94
MAVS 0,5 — -0,97 0,71 -0,64 -0,52 -0,09 0,19
ИФНа -0,67 -0,97 — -0,66 0,75 0,67 0,31 -0,4
ИФНр 0,36 0,71 -0,66 — -0,01 0,05 0,03 0,2
STING -0,68 -0,64 0,75 -0,01 — 0,98 0,57 -0,49
TRIM25 -0,76 -0,52 0,67 0,05 0,98 — 0,71 -0,62
IRF7 -0,89 -0,09 0,31 0,03 0,57 0,71 — -0,97
RelB 0,94 0,19 -0,4 0,2 -0,49 -0,62 -0,97 —
таблица 4. Взаимосвязь между компонентами ЯЮ-!- ЫР-кВ-сигнальных путей в основной группе
LL37 MAVS ИФНа ИФНр STING TRIM25 IRF7 RelB
LL37 — 0,35 0,47 0,49 0,0 0,39 -0,02 -0,03
MAVS 0,35 — 0,26 0,37 -0,11 0,0 -0,02 -0,14
ИФНа 0,47 0,26 — 0,16 -0,12 -0,01 0,75 -0,29
ИФНр 0,49 0,37 0,16 — 0,21 -0,19 -0,42 -0,35
STING 0,0 -0,11 -0,12 0,21 — 0,46 -0,23 0,05
TRIM25 0,39 0,0 -0,01 -0,19 0,46 — 0,04 0,24
IRF7 -0,02 -0,02 0,75 -0,42 -0,23 0,04 — -0,39
RelB -0,03 -0,14 -0,29 -0,35 0,05 0,24 -0,39 —
и противовирусной резистентности, а также регуляторов иммуно-воспалительного ответа.
Для изучения особенностей взаимосвязей между компонентами RIG-I- и NF-кВ-сигнальных путей был применен корреляционный анализ (табл. 3, 4).
Результаты корреляционного анализа в группе контроля (табл. 3) обнаружили сильную отрицательную корреляцию между компонентами RIG-I- и NF-кВ-сигнальных путей, в частности, между IRF7 и RelB, LL37 и ИФНа. Сильная положительная корреляция была отмечена между RelB и LL37, STING и ИФНа, MAVS и ИФНр, а также между ключевыми регуляторами противовирусной защиты — факторами STING и TRIM25, при умеренной положительной корреляции между IRF7, TRIM25 и STING. Умеренная отрицательная корреляция была выявлена между ИФНа и ИФНр, что ассоциировалось с разнонаправленной
корреляцией протеина БТ!МЭ с транскрипционными факторами Яе!В и !ЯР7.
У реконвалесцентов ВП, по сравнению с практически здоровыми донорами, отмечалось уменьшение силы взаимосвязи между !ЯР7 и Яе!В, БТНМё, ТЯ!М25, а также ИФНа и __37 и усиление корреляции между продукцией __37 и интерферонами (табл. 4).
Использование митогена позволило смоделировать ответ МНК на компоненты бактериального патогена при развитии повторной инфекции у реконвалесцентов ВП, что достаточно часто встречается в клинической практике [5]. Данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о том, что предшествующий инфекционный процесс оказывает существенное влияние на изменение реактивности МНК, характер взаимосвязей компонентов ПЮ-!-сигнального пути с компонентами ядерного фактора транскрипции ЫР-кВ, а также на продукцию цитокинов
и факторов неспецифической резистентности. На этом фоне воздействие митогена сопровождалось снижением продукции LL37, ИФНр, ИЛ-6 и RANTES. Указанные изменения были связаны с относительным дефицитом IRF7 и Re^ и повышением содержания в МНК протеинов RNF125 и OTUD5, что, в целом, определяет усиление отрицательной обратной связи, ограничивающей активность RIG-I-сигнального пути.
С учетом результатов ранее проведенного исследования следует отметить, что коэффициент митогенной стимуляции в отношении компонентов NF-кВ, т. е. соотношение факторов NF-^2, р50, р65, Re^ и c-Rel в условиях стимуляции и спонтанной клеточной активности, в основной группе составил 13,5; 7,5; 8,8; 4,5; 7,2 ед. соответственно, тогда как в группе контроля — 11,9; 6,3; 8,6; 4,8; 8,4 ед. [7]. Указанное обстоятельство позволяет говорить о снижении активности NF-кВ у реконвалесцен-тов ВП в сравнении с практически здоровыми лицами. Уменьшение содержания в МНК RIG-I-зависимой хели-казы LGP2 (DHX58) опосредует снижение эффективности распознавания хеликазой IFIH1 длинных отрезков дцРНК, и, тем самым, снижает эффективность противовирусного ответа. С учетом повышения в МНК уровня убиквитин-лигазы RNF125, способствующей деградации IFIH1, интегральный эффект митогенной стимуляции у реконвалесцентов ВП в отношении противовирусной резистентности представляется отрицательным.
Изменение соотношения компонентов ядерного фактора транскрипции NF-кВ, в частности, повышение уровня киназ !1<Ва при снижении содержания фактора Re^ и степени фосфорилирования протеинкиназы р38, ассоциируется с уменьшением продукции RANTES, LL37, ИЛ-6. В свою очередь, снижение содержания в МНК фактора IRF7 при неизменном уровне IRF3 повышает вероятность формирования гомодимеров IRF3:IRF3, что в условиях повышенной активности протеинкиназы ТВК1 и определяет стимуляцию продукции ИФНа [9-11].
Таким образом, воздействие на клетки цельной крови реконвалесцентов ВП митогена сопровождается разобщением RIG-I- и NF-кВ-сигнальных путей, приводящим к снижению продукции LL-37 и ИФНр, что может рассматриваться в качестве проявлений дисрегуляции молекулярных механизмов врожденного иммунного ответа, обусловленной перенесенным патологическим процессом [9, 12, 13].
Подобные изменения на молекулярном уровне определяют вероятность формирования у реконва-лесцентов ВП при повторном инфицировании менее эффективного иммунного ответа, в сравнении с практически здоровыми лицами [7, 10, 14, 15]. Очевидно, что у части реконвалесцентов ВП организм может оказаться уязвимым к повторной бактериальной
ЛИТЕРАТУРА:
1. Kato H., Oh S.W., Fujita T. RIG-I-Like Receptors and Type I Interfer-onopathies. J. Interferon Cytokine Res. 2017; 37(5): 207-13.
2. Kell A.M., Gale M. RIG-I in RNA virus recognition. Virology 2015; 479-80: 110-21.
3. Komuro A., Bamming D., Horvath C.M. Negative regulation of cytoplasmic RNA-mediated antiviral signaling. Cytokine 2008; 43(3): 350-8.
4. Green R., Ireton R.C., Gale M. Jr. Interferon-stimulated genes: new platforms and computational approaches. Mamm. Genome 2018; 29(7-8): 593-602.
5. Hakansson A.P., Bergenfelz C. Low NF-кВ Activation and Necrop-tosis in Alveolar Macrophages: A New Virulence Property of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 2017; 216(4): 402-4.
6. Лебедева М.Н., Грищенко А.В. Особенности течения повторных вне-больничных пневмоний у военнослужащих по призыву. Военно-медицинский журнал 2009; 330(7): 24-8. [Lebedeva M.N., Grishchenko A.V. Peculiarities of the course of the repeated out-hospital pneumonia by compulsory-duty servicemen. Military Medical Journal 2009; 330(7): 24-8 (In Russ.)].
инфекции в связи с дефицитом продукции хемокинов, в частности, RANTES и ИЛ-6, а также эндогенных антимикробных пептидов [16, 17].
заключение
Воздействие на МНК комплексного митогена приводит к существенным изменениям взаимосвязей ключевых компонентов сигнальных путей, определяющих антибактериальную и противовирусную защиту организма. У реконвалесцентов ВП после стимуляции МНК комплексным митогеном, в состав которого входит ЛПС, отмечается снижение продукции кателицидина, RANTES и ИФНр, определяющееся, очевидно, меньшей экспрессией соответствующих генов, по сравнению с практически здоровыми лицами,. Данные изменения ассоциированы с повышением содержания в клетках факторов негативной регуляции RIG-I- и NF-кВ-сигнальных путей, в частности, убиквитинлигазы RNF125, а также снижением содержания Re^ и уровня фосфорилирования протеинкиназы р38.
Перенесенный инфекционно-воспалительный процесс сопровождается изменениями реактивности МНК цельной крови, которые могут способствовать развитию суперинфекции и повторной пневмонии. Проведенный анализ показал возможные направления повышения неспецифической резистентности организма к бактериальным и вирусным патогенам: ограничение биодеградации фактора Re^, повышение содержания в МНК фактора TRIM25, увеличение степени фосфори-лирования протеинкиназы р38, стимуляция биодеградации Е3-убиквитинлигазы RNF125 и деубиквитиназы OTUD5 [18-21].
Одним из способов воздействия на указанные триггеры может стать облучение клеток крови низкоинтенсивными микроволнами частотой 1 ГГЦ, которое приводит к повышению содержания в клетке Re^ и TRIM25 [7]. Активируя сигнальный путь JAK/STAT, микроволновое излучение стимулирует повышение содержания в клетке противовирусных регуляторов, включая IFIH1, MAVS и STING, что сопровождается увеличением продукции LL37 и интерферонов [8, 22-24]. Микроволны также повышают экспрессию рецепторов, распознающих паттерн патогенности, в том числе локализующихся в цитоплазме клетки, и усиливают фосфорилирование протеинкиназы р38 [13].
Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности дальнейшего исследования молекулярных внутриклеточных механизмов иммунореабилитации больных, перенесших ВП, а также путей повышения эффективности процессов саногенеза с целью предупреждения развития суперинфекции и повторных случаев заболеваний пневмонией.
7. Терехов И.В., Никифоров В.С., Бондарь С.С. Изменение содержания компонентов IL/TOLL-сигнального пути и NF^ в моно-нуклеарных клеток цельной крови под влиянием низкоинтенсивного электромагнитного излучения частотой 1 ГГц. Гены и клетки 2017; 12 (2): 90-6. [Terekhov I.V., Nikiforov V.S., Bondar S.S. Ickovich V.O. Changes in the content of components of IL/TOLL-signal pathway and NF^ in mononuclear cells of whole blood under the influence of low-intensity electromagnetic radiation of 1 GHz. Genes & Сells 2017; 12 (2): 90-6. (In Russ.)].
8. Терехов И.В., Бондарь С.С., Хадарцев А.А. Лабораторное определение внутриклеточных факторов противовирусной защиты при внебольничной пневмонии в оценке эффектов низкоинтенсивного СВЧ-излучения. Клиническая лабораторная диагностика 2016; 61(6): 380-4. [Terekhov I.V., Bondarl S.S., Hadarcev A.A. Determination of intracellular factors of antiviral protection in community-acquired pneumonia in assessing the effects of low-intensity microwave radiation. Clinical Laboratory Diagnostics 2016; 61(6): 380-4 (In Russ.)].
9. Wong E.T., Tergaonkar V. Roles of NF-kappaB in health and disease: mechanisms and therapeutic potential. Clin. Sci. (Lond) 2009; 116(6): 451-65.
10. Sweeney S.E. Targeting interferon regulatory factors to inhibit activation of the type I IFN response: implications for treatment of autoimmune disorders. Cell. Immunol. 2011; 271(2): 342-9.
11. Honda K., Takaoka A., Taniguchi T. Type I interferon gene induction by the interferon regulatory factor family of transcription factors. Immunity 2006; 25: 349-60.
12. Czerkies M., Korwek Z., Prus W. et al. Cell fate in antiviral response arises in the crosstalk of IRF, NF-kB and JAK/STAT pathways. Nat. Commun. 2018; 9(1): 493.
13. Терехов И.В., Хадарцев А.А., Бондарь С.С. и др. Экспрессия TOLL- и NOD-подобных рецепторов, уровень в мононуклеарных клетках цельной крови регуляторных факторов противовирусной защиты и продукция интерферона под влиянием низкоинтенсивного микроволнового излучения частотой 1 ГГц. Вестник новых медицинских технологий. Электронное издание 2016; 10(3): 223-33. URL: http:// www.medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2016-3/2-22.pdf (дата обращения: 17.09.2016). [Terekhov I.V., Khadartsev A.A., Bondar' S.S. et al. The expression of TOLL- and NOD-like receptors, the level of whole blood in mononuclear cells of regulatory factors of antiviral protection and the production of interferon under the influence of low-intensity microwave radiation at a frequency of 1 GHz. Bulletin of new medical technologies. Electronic edition 2016; 10(3): 223-33 (In Russ.)].
14. Maier B.B., Hladik A., Lakovits K. et al. Type I interferon promotes alveolar epithelial type II cell survival during pulmonary Streptococcus pneu-moniae infection and sterile lung injury in mice. Eur. J. Immunol. 2016; 46(9): 2175-86.
15. Stephan A., Batinica M., Steiger J. et al. LL37: DNA complexes provide antimicrobial activity against intracellular bacteria in human macrophages. Immunology 2016; 148(4): 420-32.
16. Culley F.J., Pennycook A.M., Tregoning J.S. et al. Role of CCL5 (RANTES) in viral lung disease. J. Virol. 2006; 80(16): 8151-7.
17. Palaniappan R., Singh S., Singh U.P. et al. CCL5 modulates pneumococcal immunity and carriage. J. Immunol. 2006; 176(4): 2346-56.
18. Gack M.U., Shin Y.C., Joo C.H. et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiq-uitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature 2007; 446(7138): 916-20.
19. Wertz I.E., Dixit V.M. Signaling to NF-kappaB: regulation by ubiquiti-nation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2010; 2(3): a003350.
20. Bodur C., Kazyken D., Huang K. et al. The IKK-related kinase TBK1 activates mTORC1 directly in response to growth factors and innate immune agonists. EMBO J. 2018; 37(1): 19-38.
21. Marinho F.V., Benmerzoug S., Oliveira S.C. et al. The Emerging Roles of STING in Bacterial Infections. Trends Microbiol. 2017; 25(11): 906-18.
22. Терехов И.В., Хадарцев А.А., Бондарь С.С. Состояние рецептор-зависимых сигнальных путей в агранулоцитах периферической крови реконвалесцентов внебольничной пневмонии под влиянием микроволнового излучения. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры 2016; 93(3): 23-8. [Terekhov I.V., Hadarcev A.A., Bondar S.S. The state of receptor-dependent signaling pathways in peripheral blood agranulocytes of convalescents of community-acquired pneumonia under the influence of microwave radiation. Questions of balneology, physiotherapy and physiotherapy 2016; 93(3): 23-28. (In Russ.)].
23. Бондарь С.С., Логаткина А.В., Терехов И.В. Влияние низкоинтенсивного микроволнового излучения частотой 1 ГГц на состояние MAPK/ SAPK-сигнального пути в мононуклеарных лейкоцитах. Биомедицинская радиоэлектроника 2016; 10: 28-36. [Bondar S.S., Logatkina A.V., Terekhov I.V. The effect of low-intensity 1 GHz microwave radiation on the state of the MAPK/SAPK signaling pathway in mononuclear leukocytes. Biomedical Electronics 2016; 10: 28-36. (In Russ.)].
24. Солодухин К.А., Никифоров В.С., Бондарь С.С. и др. Влияние низкоинтенсивного СВЧ-облучения на внутриклеточные процессы в мононуклеарах при пневмонии. Медицинская иммунология 2012; 14(6): 541-4. [Terekhov I.V., Soloduhin K.A., Nikiforov V.S. The effect of low-intensity microwave irradiation on intracellular processes in mononuclear cells in pneumonia. Medical immunology 2012; 14(6): 541-544. (In Russ.)].
Поступила: 09.03.2019
