CC BY
69
УДК 616.36-099-074:535.379
СОСТОЯНИЕ ПРОЦЕССОВ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ПРИ ОСТРОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ
С.А. Кантюков*, Л.В. Кривохижина*, Р.Р. Фархутдинов**
*Челябинская государственная медицинская академия, г. Челябинск; **Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа
В данном исследовании изучено состояние процессов свободно-радикального окисления (СРО) в крови и гомогенате печени методом регистрации железоиндуцированной хемилюминесценции и определением продуктов перекис-ного окисления липидов (ПОЛ) при остром экспериментальном токсическом поражении печени четыреххлористым углеродом. Показано, что в первые часы острого отравления возрастает интенсивность хемилюминесценции и накапливаются продукты ПОЛ в ткани печени и крови, обусловленное снижением общей антиокислительности, появлением свободных радикалов, увеличением количества гидроперекисей липидов. Снижение показателей хемилюминесценции в гомогенате печени к 2-3-м суткам интоксикации относительно первых часов обусловлено возрастанием скорости окисления, повреждением клеток печени, но не усилением мощности общей антиокислительной системы. Характер изменений СРО в крови и печени в динамике ее острого повреждения различен.
Ключевые слова: поражение печени, свободно-радикальное окисление, хемилю-минесценция.
Классическая модель острого токсического гепатита, индуцированная тетрахлорметаном (СС14), привлекает внимание исследователей разнонаправ-ленностью действия, приводящего к нарушению многих функций печени: синтетической, дезин-токсикационной, нарушению прооксидантно-анти-оксидантного равновесия, гиперпродукции про-воспалительных цитокинов и других [3, 5]. В литературе указывается, что повреждение печени тетрахлорметаном обусловлено взаимодействием между ядом и цитохромом Р-450 с образованием активных метаболитов СС14 в гепатоцитах; активацией макрофагальных клеток печени с усилением образования активных форм кислорода [3, 5, 6].
С учетом того, что симптомы интоксикации у животных при воздействии четыреххлористого углерода начинают проявляться уже в первые часы после введения, а к 6-8-му ч крысы впадали в коматозное состояние, необходимо изучение ранних этапов окислительного напряжения в организме при остром поражении печени, что и послужило целью исследования.
Методы исследования. Острое повреждение печени у крыс вызывали введением через зонд в полость желудка СС14, смешанного с оливковым маслом, из расчета 0,25 мг препарата на 100 г массы тела - опытная группа. В контрольной группе крысы получали оливковое масло. Состояние процессов свободно-радикального окисления в плазме крови и ткани печени оценивали с помощью методов использованных нами ранее в работе [2]. Показатели активновсти ферментов аспартатамино-трансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы
(АЛТ) определяли с использованием стандартных наборов. Цитоморфологические исследования проводились на кафедре патологической анатомии Башкирского государственного медицинского университета. Результаты обрабатывали методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ «Statistika v. 6.0 for Windows» [1, 4]. Для описания результатов использовали М-среднее значение признака, m-стандартную ошибку среднего, s-среднее квадратичное отклонение, характеристику выборки представляли в формате М ± m. Для анализа нормальности распределения данных применяли критерий Шапиро-Уилка. Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием параметрических (Стьюдента) и непараметрических (Манна-Уитни) критериев. Отличия считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты исследования. Через 3-6 ч после отр авления цитоморфологические исследования выявили вакуолизацию, набухание гепатоцитов, полнокровие сосудов, а через 9-12 ч обнаруживались дистрофические изменения и участки некроза в центральных и промежуточных долях печени. В последующем у крыс развивались явления, характерные для липидной дистрофии печени. Острая интоксикация тетрахлорметаном вызывала значительное повышение амино-трансферазной активности в сыворотке крови. На 1-е и 2-е сутки после введения тетрахлометана активность АСТ и АЛТ повысилась в 7 и в 10 раз соответственно. Через 72 ч активность АСТ и АЛТ снижалась относительно первых суток воздействия, но оставалась выше
контрольных значений. Максимальная гибель животных была на 24-36-й ч и составила 30 %.
Острое поражение печени с первого часа после введения ССЬ4 сопровождается активацией свободно-радикального окисления в крови и максимальной активацией на 24-й ч - спонтанная хе-милюминесценция (СП ХЛ) возрастает более чем в 5 раз.
С первого часа поражения печени в плазме крови возрастали амплитуда быстрой вспышки (А) и светосумма свечения (8). Возрастает количество первичных продуктов ПОЛ (ДК) и вторичных продуктов ПОЛ (ТБК-активных продуктов) (табл. 1). Максимальное увеличение ДК наблюдается на 24-й ч, а максимальное увеличение ТБК АП - на 48-й ч.
Следует отметить, что в динамике развития окислительного напряжения между интенсивностью СП ХЛ и накоплением первичных и вторичных продуктов ПОЛ отсутствует зависимость. Динамика накопления гидроперекисей липидов (А) соответствует динамике накопления первичных и вторичных продуктов. Первоначально повышаются гидроперекиси липидов (А), а через 12-24 ч возрастают первичные и вторичные продукты ПОЛ (рис. 1, 2).
Кроме того, динамика накопления в плазме крови гидроперекисей липидов соответствует динамике изменений окисляемости липидов (рис. 3).
С первого часа острого повреждения печени в ней активируется СРО - возрастает СП ХЛ, амплитуда быстрой вспышки и светосумма свечения, сокращается период индукции, на 3-й ч повреждения увеличиваются ТБК-активные продукты (табл. 2), что свидетельствует о снижение мощно-
сти антиоксидантной защиты, возрастания гидроперекисей липидов, повышения окисляемости липидов.
В контрольной серии (интактная группа) имеется достоверная обратная корреляция средней силы (г = -0,73) между СП ХЛ и периодом индукции (ПИ - интегративный показатель мощности антиокислительной системы). Данная связь сохраняется в течение первого часа острого поражения печени.
Но далее с 3-го до 24-го ч повреждения связь между спонтанной ХЛ и ПИ не обнаруживается. На 24-48-й ч повреждения обратные взаимоотношения между ПИ и СП ХЛ восстанавливаются (рис. 4).
В контрольной серии установлена положительная достоверная связь (г = 0,6; р < 0,05 ) между спонтанной ХЛ и амплитудой быстрой вспышки; между спонтанной ХЛ и светосуммой свечения (г = 0,65; р < 0,05), сохраняющиеся до 1-го ч острого повреждения печени. Затем эти связи нарушаются.
Отсутствие положительных или отрицательных взаимосвязей между спонтанной ХЛ, мощностью анитиокислительной системы (ПИ), наличием гидроперекисией липидов (А), окисляемостью липидов (8) может быть связано с усилением скорости окисления липидов, провоцируемое появлением свободных металлов переменной валентности. Это находит отражение в накоплении ТБК-актив-ных продуктов, а именно, на фоне снижения амплитуды быстрой вспышки и светосуммы свечения (24-48 ч) наблюдается повышение количества ТБК-активных продуктов.
Нарушение свободно-радикального окисления в ткани печении при ее остром повреждении
Таблица 1
Изменение хемилюминесценции плазмы крови и содержания в ней продуктов перекисного окисления липидов при отравлении СС14
Условия эксперимента Свечение плазмы (отн. ед.) ДК ед. Е/мл ТБК-АП ед. Е/мл
СП А 8
Контроль (п = 30) 0,313 ± 0,07 7,51 ± 0,54 21,4 ± 1,3 0,09 ± 0,007 0,04 ± 0,008
Отравление СС14 (п = 60) 1 час 0,58 ± 0,04 *** 9,72 ± 0,47 *** 27,4 ± 1,2 *** 0,17 ± 0,01 ** 0,06 ± 0,003
3 часа 0,78 ± 0,06 *** 11,19 ± 0,61 *** 28,3 ± 0,9 *** 0,18 ± 0,008 *** 0,122 ± 0,005 ***
12 часов 1,08 ± 0,05 *** 12,74 ± 0,49 *** 29,7 ± 0,6 *** 0,18 ± 0,009 *** 0,13 ± 0,007 ***
24 часа 1,68 ± 0,08 *** 13,31 ± 0,45 *** 33,5 ± 1,3 *** 0,23 ± 0,006 *** 0,15 ± 0,004 ***
48 часов 1,54 ± 0,07 *** 13,48 ± 0,36 *** 32,6 ± 1,4 *** 0,23 ± 0,005 *** 0,15 ± 0,007 ***
72 часа 0,98 ± 0,05 *** 12,43 ± 0,48 *** 31,0 ± 1,1 *** 0,22 ± 0,008 *** 0,13 ± 0,008 ***
Примечания: СП - спонтанная хемилюминесценция; А - амплитуда быстрой вспышки; 8 - светосумма хемилюминесценции; ДК - диеновые конъюгаты; ТБК-АП - ТБК-активные продукты. Здесь и в табл. 2-3: * р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001 относительно контроля.
Рис. 1. Динамика изменений амплитуды быстрой вспышки (гидроперекисей липидов) и диеновых конъюгатов в плазме крови
Рис. 2. Динамика изменений амплитуды быстрой вспышки (гидроперекисей липидов) иТБК-активных продуктов в плазме крови
Рис. 3. Динамика изменений амплитуды быстрой вспышки и светосуммы свечения в плазме крови
демонстрирует эксперимент по накоплению вторичных продуктов ПОЛ при аэробной инкубации гомогената печени (рис. 5, 6). При повреждении печени в течение 1-3-го ч образование ТБК-актив-ных продуктов при инкубации выше, чем в контроле. Более того, на 3-й ч повреждения образова-
ние вторичных продуктов ПОЛ ниже относительно 1-го ч повреждения.
На 12-24-й ч повреждения образование ТБК-активных продуктов одинаково и выше относительно контроля, но на 3-й ч инкубации достоверно не отличаются от значений в контрольных об-
Изменение хемилюминесценции гемогената печени и накопления ТБК активных продуктов при отравлении
Таблица 2
Условия эксперимента Хемилюминесценция гемогената ТБК-АП ед.Е/мл
СП А ПИ 8
Контроль (п = 30) 0,46 ± 0,01 7,05 ± 0,53 1,8 ± 0,2 102,6 ± 7,2 0,08 ± 0,001
Отравление СС14 (п = 60) 1 час 1,62 ± 0,15 *** 10,60 ± 0,6 *** 0,7 ± 0,3 * 141,4 ± 6,4 *** 0,2 ± 0,06
3 часа 1,22±0,06 *** 9,90 ± 0,5 *** 0,6 ± 0,1 * 134,9 ± 5,6 *** 0,18 ± 0,01 ***
12 часов 1,02 ± 0,03 *** 10,89 ± 0,3 *** 0,7 ± 0,1 * 140,9 ± 5,2 *** 0,18 ± 0,01 ***
24 часа 1,11 ± 0,06 *** 10,76 ± 0,3 *** 0,8 ± 0,07 * 128,0 ± 7,9 * 0,21±0,01 ***
48 часов 1,95 ± 0,08 *** 8,1 ± 0,25 0,6 ± 0,1 * 92,7 ± 10,2 0,21 ± 0,01 ***
72 часа 1,81 ± 0,07 *** 8,05 ± 0,2 *** 0,8 ± 0,1 * 109,4 ± 5,3 0,17 ± 0,02 ***
Примечания: СП - спонтанная хемилюминесценция; А - амплитуда быстрой вспышки; ПИ - период индукции; 8 - светосумма хемилюминесценции; ТБК-АП - ТБК-активные продукты.
Рис. 4. Динамика изменений спонтанной ХЛ и периода индукции в гомогенате печени при остром поражении
разцах (рис. 5). На 72-й ч повреждения на 2-3-й ч инкубации снижено образование вторичных продуктов ПОЛ как относительно 48-го часа повреждения, так и относительно контроля (рис. 6). Итак, с увеличение времени острого повреждения печени в ней нарушается образование вторичных продуктов ПОЛ и именно в эти сроки наиболее низкие значения параметров (А и 8), характеризующих количество гидроперекисей липидов и липидов способных подвергаться окислению.
Таким образом, снижение на 48-72-м ч острого повреждения печени относительно первого часа показателей А и 8, на фоне повышения СП ХЛ, вероятно, обусловлено несколькими механизмами - увеличением интенсивности окисления, уменьшением пула легкоокисляемых липидов, и возможно, повреждением молекулярных структур гепатоцитов.
Интенсивность окисления возрастает с первого часа и наибольшая - на 48-й ч повреждения. Это подтверждается соответствующим коэффициентом, рассчитываемым по соотношению: в числителе количество ТБК-АП х 100, в знаменателе сумма количественных значений хемилюмино-граммы (СП +А + 8). Кроме того, с увеличением срока повреждения снижается способность гомо-гената клеток печени к образованию ТБК-активных продуктов (табл. 3.)
Важный аспект, имеющий практическое значение - насколько характер изменений СРО в крови отражает характер изменений в поврежденной печени. Следует отметить, что при общей активации СРО динамика изменений параметров хемилюминесценции в печени и крови различна и изменения в крови не идентичны изменениям в печени.
Рис. 5. Накопление ТБК-активных продуктов при аэробной инкубации гомогената печени. Стрелками указаны достоверные изменения относительно контроля
Рис. 6. Накопление ТБК-активных продуктов при аэробной инкубации гомогената печени. Стрелками указаны достоверные изменения относительно контроля, кружком - относительно 48-го часа повреждения
Прирост вторичных продуктов ПОЛ на 3-й ч инкубации гомогената ткани печени
Таблица 3
Прирост 1-й ч 3-й ч 12-й ч 24-й ч 48-й ч 72-й ч
ТБК - АП, поврежд. поврежд. поврежд. поврежд. поврежд. поврежд.
% 430 ± 35,2 333 ± 10,5 316 ± 8,5 271 ± 10 294 ± 15,6 283 ± 21,7 ***
Контроль 650 ± 33,5
Примечание. Достоверность указана относительно первого часа повреждения. Доказательство усиления скорости образования ТБК-активных продуктов является к 48-му часу повреждения.
Таким образом, острое повреждение печени приводит к активации свободно-радикального окисления. В течение первого часа острого возрастание хемилюминесценции в ткани печени и крови обусловлено снижением общей антиокислительной активности, наличием свободных радикалов, повышением гидроперекисей липидов, возрастанием пула легкоокисляемых липидов. Снижение амплитуды быстрой вспышки и светосуммы свечения в гомогенате печени к 48-72-му ч относительно первых часов повреждения обусловлено возрастанием скорости окисления, повреждением клеток печени, но не возрастанием мощности общей антиокислитель-ной способности. Характер изменений СРО в крови и печени в динамике ее острого повреждения различен.
Литература
1. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. - М.: Практика, 1999. - 438 с.
2. Кантюков, С.А. Состояние процессов свободно-радикального окисления при термической
травме разной степени тяжести / С.А. Кантюков, Л.В. Кривожижина, Р.Р. Фархутдинов // Вестник ЮУрГУ. Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». - 2010. - Вып. 24. -№ 24 (200). - С. 117-124.
3. Костюк, В.А. Роль ковалентного связывания и ПОЛ в повреждении печени четырехлори-стым углеродом / В.А. Костюк // Биохимия. -1991. - № 10. - C. 1878-1885.
4. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение прикладных программ STATISTIKA / О.Ю. Реброва. - М.: Медиа Сфера, 2006. - 312 с.
5. Kaplowitz, M.D. Biochemical and cellular mechanisms of toxic liver injury / M.D. Kaplowitz // Semin Liver Dis. - 2002. - № 4. - P. 137-144.
6. Fausto, N. Liver regeneration / N. Fausto // Hepatology. -2000. - V. 32(1). - P. 19-31.
7. Kaplowitz, M.D. Biochemical and cellular mechanisms of toxic liver injury / M.D. Kaplowitz // Semin Liver Dis. - 2002. - № 4. - P. 137-144.
Поступила в редакцию 16 мая 2011 г.
