CC BY
34
УДК 577.115:577.15:612.73/.74:612.118.221.3
состояние процессов липопероксидации, антиоксидантной защиты и осмотическая устойчивость эритроцитов при физической нагрузке различной напряженности
А. В. Еликов, П. И. Цапок
Кировская государственная медицинская академия, г. Киров
Изучено состояние процессов липопероксидации, антиоксидантной защиты, содержание холесте-рола и фосфолипидов в эритроцитах, а также устойчивость эритроцитов к осмотическому гемолизу у разноадаптированных белых крыс при выполнении умеренной и максимальной физической нагрузки. Исследования проведены на 40 взрослых белых беспородных крысах-самцах. Мышечная деятельность дозировалась в виде плавательной нагрузки с грузом, составляющим 10% от массы тела. Показана зависимость процессов липопероксидации, состояния антиоксидантной защиты, содержания холесте-рола, фосфолипидов в эритроцитах и устойчивости эритроцитов к осмотическому гемолизу от напряженности физической работы и тренированности животных.
Ключевые слова: липопероксидация, антиоксидантная защита, холестерол, фосфолипиды, эритроциты, осмотический гемолиз, адаптация, физическая нагрузка.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время физическая нагрузка прочно вошла в систему лечебно-профилактических, оздоровительных и реабилитационных мероприятий. Показано благоприятное влияние адекватной мышечной деятельности на состояние органов и систем [10]. В то же время чрезмерная мышечная нагрузка приводит к истощению и поломке компенсаторно-приспособительных механизмов, что и формирует состояние острого физического перенапряжения, в основе которого ведущая роль принадлежит активации процессов липопероксидации (ЛПО) и снижению ресурсов антиоксидантной защиты (АОЗ) [3, 8]. Изучение состояния процессов ЛПО и АОЗ дает возможность оценить общее функциональное состояние организма при адаптации к мышечной деятельно-
сти [4]. Особую ценность приобретает исследование адаптации на клеточном уровне, что в определенной мере представляется возможным при использовании эритроцитов в качестве биологического материала.
Цель исследования — изучить процессы ЛПО, АОЗ и устойчивость эритроцитов к осмотическому гемолизу у разноадаптирован-ных к мышечной деятельности животных в зависимости от напряженности задаваемой мышечной работы.
Материалы и методы
ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили 40 взрослых беспородных белых крыс-самцов. Мышечная деятельность дозировалась в виде плавательной нагрузки с грузом, составляющим 10% от массы тела: умерен-
ная — без признаков утомления (20 минут), напряженная — при развитии явных признаков утомления (90 минут) [7]. Состояние тренированности у животных вызывали ежедневными в течение месяца умеренными плавательными нагрузками. Результаты сравнивали с контрольной группой. Животные были распределены на группы: 1-я — контроль; 2-я — нетренированные животные после умеренной физической нагрузки; 3-я — тренированные животные в состоянии покоя; 4-я — тренированные животные после умеренной физической нагрузки; 5-я — нетренированные животные после напряженной физической нагрузки.
Сразу после выполнения физической нагрузки животных декапитировали в состоянии кратковременного эфирного наркоза. Цельную кровь центрифугировали при 3000 об./мин в течение 15 минут. Биохимические исследования проводили в эритроцитах, трижды отмытых 0,85% раствором №С1 и обработанных согласно методикам.
Для определения холестерола (ХС) и фосфолипидов (ФЛ) эти продукты предварительно экстрагировались смесью гептан-изопропанол. Содержание ХС определяли в гептановой фазе по реакции с хлорным железом по методу Златкиса — Зака, ФЛ — при длине волны максимального поглощения 220 нм на спектрофотометре SHIMADZU 1240 (Япония). Определение общих липидов (ОЛ) и общего белка (ОБ) проводили после обработки эритроцитов общепринятыми методами. для изучения процессов ЛПО использовали определение содержания малонового диальдегида (МДА) как вторичного продукта ЛПО по реакции с тио-барбитуровой кислотой спектрофотометри-чески при длине волны 535 нм. Для определения первичных продуктов ЛПО измеряли интенсивность хемилюминесценции (ХЛ), инициированной пероксидом водорода,
в присутствии избытка ионов двухвалентного железа, за 30 и 60 секунд, а также максимальную вспышку ХЛ за исследуемое время на хемилюминометре Emilite 1105 [9]. Оценку общей антиоксидантной активности (АОА) осуществляли хемилюминесцентным методом, посредством определения соотношения уровень максимальной вспышки/све-тосумма за 30 секунд (Im/S). Определение диеновых конъюгатов (ДК) проводили в геп-тановой фазе, после предварительной экстракции смесью гептан-изопропанол при длине волны 233 нм. Антирадикальную активность (АРА) определяли по степени обесцвечивания раствора 2,2-дифенил-1-пикрил-гидразила при добавлении субстрата [2]; а-токоферола — с а-пиридилдиацитилом.
Изучена активность ферментов-антиок-сидантов: супероксиддисмутазы (СОД) (К. Ф. 1.15.1.1) — по ингибированию реакции восстановления нитросинего тетразолия супероксидным анион-радикалом, после обработки эритроцитов по методу Е. Е. Дубининой и соавт. [1]; каталазы (К. Ф. 1.11.1.6) — по скорости утилизации пероксида водорода при длине волны 260 нм; глутатионперокси-дазы (ГП) (К. Ф. 1.11.1.9) — по изменению содержания восстановленного глутатиона в пробах до и после инкубации с субстратом с помощью цветной реакции с ди-тиобис-нитробензойной кислотой при длине волны 412 нм; глутатионредуктазы (ГР) (К. Ф. 1.6.4.2.) — на каталитическом НАДФ • Н-зависимом преобразовании окисленной формы глутатиона в восстановленную, интенсивность которого оценивалась по скорости снижения экстинкции проб при длине волны 340 нм, на которой раствор НАДФ • Н имеет максимум светопоглощения (тест Варбурга) [6].
Определение проницаемости эритроци-тарных мембран (осмотической стойкости эритроцитов) проводили по следующей ме-
тодике [5]. Взвесь эритроцитов добавляли в пробирки, содержащие 1,8% раствор мочевины и 0,85% раствор NaCl в соотношении: 1 - 40:60; 2 - 45:55; 3 - 50:50; 4 - 55: 45; 5 - 60: 40; 6 - 65 : 35; 7 - чистый раствор мочевины. После инкубации и центрифугирования определяли оптическую плотность всех растворов, пересчитывая этот показатель в процентах от эталона (7-я пробирка).
Полученный цифровой материал обработан методом вариационной статистики на IBM с использованием программ Biostat и Statistica 6.0 с определением M±m. Достоверность разницы определяли по t-критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при p<0,05.
Результаты и их обсуждение
Анализ показателей, характеризующих процессы ЛПО и АОЗ в эритроцитах, представлен в таблице 1.
Установлено незначительное усиление процессов ЛПО у тренированных животных в состоянии покоя, что проявлялось увеличением интенсивности ХЛ и содержания ДК. Однако активность ферментов-антиоксидан-тов, за исключением каталазы, у животных 3-й группы была на 10,1—15,1% выше по сравнению с контролем. Параллельно установлено также большее содержание в эритроцитах тренированных животных и неферментативного антиоксиданта — а-токофе-рола. Коэффициент ХС/ФЛ у тренированных
Исследуемый показатель Группа
1-я 2-я 3-я 4-я 5-я
Каталаза, ммоль/мл/мин 9,78±0,23 8,96±0,27 6,24± 0,17 8,42±0,21 * 2,95±0,09 *
СОД, % ингиб. 57,4±3,1 53,7±2,9 63,6±3,4 68,2±3,6 26,2±1,3 *
ГП, мкмоль/мл/мин 48,4±2,8 44,2±2,7 53,3±2,9 60,8±3,0 * 17,3±1,4 *
ГР, мкмоль/мл/мин 0,53±0,04 0,58±0,03 0,61±0,04 0,67± 0,05 0,32±0,02 *
ХЛ, (Im), кФотон 22,1±1,1 23,2±1,3 24,1±1,4 27,4±1,8 25,4±1,5
ХЛ, (S30), кФотон 321,2±10,0 362,5±12,2 * 339,2±11,4 389,1±12,3 * 479,2±14,8 *
ХЛ, (S60), кФотон 403,2±17,3 446,8±19,3 434,2±19,8 486,3±20,4 * 605,9±21,6 *
АОА, (Im/S30) 0,069±0,004 0,064±0,003 0,071±0,004 0,070±0,005 0,053±0,002 *
АРА, % ингиб. 58,1±0,9 56,3±1,0 59,4±1,1 58,3±0,9 43,2±0,8 *
МДА, мкмоль/г ОЛ 8,7±0,6 9,9±0,8 7,8±0,7 6,3±0,5 21,3±1,6 *
ДК, у. е./г ОЛ 0,47±0,05 0,58±0,06 0,54±0,05 0,35±0,03 * 0,87±0,06 *
а-токоферол, мг/л 4,3±0,2 3,9±0,3 5,1±0,4 5,0±0,4 1,8±0,2 *
ХС (мкмоль/г ОБ)/ФЛ (у. е./г ОЛ) 76,2±5,8 56,6±4,7 * 51,7±4,3 46,1±3,8 117,6±8,6 *
Примечание. * — различия по сравнению с состоянием покоя статистически достоверны.
Таблица 1
Биохимические показатели, характеризующие ЛПО и АОЗ в эритроцитах у разноадаптированных крыс в состоянии покоя и после плавательной нагрузки
(m±m; п=8)
животных был существенно ниже (на 47,4%) по сравнению с контролем. Данный фактор является важным аспектом в адаптации к мышечной деятельности, поскольку существенно повышает текучесть мембран эритроцитов, что существенно облегчает выполнение ими газотранспортной функции. В то же время отмечена большая устойчивость эритроцитов тренированных животных к гемолизу, что, по нашему мнению, связано с большей эффективностью работы системы АОЗ у тренированного организма. Полученные данные об устойчивости эритроцитов к осмотическому гемолизу представлены в таблице 2.
После выполнения умеренной физической нагрузки в эритроцитах наблюдали сдвиги, характеризующие разную эффективность функционирования системы АОЗ у животных 2-й и 4-й групп. У нетренированных животных установлено снижение активности ферментов-антиоксидантов (на 6,4— 8,4%) и содержания а-токоферола (на 9,3%) на фоне увеличения содержания продуктов ЛПО. У тренированных крыс возрастала активность ферментных антиоксидантов (на 7,2—34,9%) на фоне снижения содержания ДК и МДА (на 19,2—35,2%). Сдвиги АОА и АРА
после выполнения физической нагрузки также зависели от степени тренированности животных: незначительно снизились у крыс во 2-й группе и практически не изменились у животных 4-й группы по сравнению с состоянием покоя. После выполнения физической нагрузки отмечено снижение коэффициента ХС/ФЛ, однако достоверные сдвиги данного показателя наблюдались у нетренированных животных. Установлена тенденция к снижению осмотической устойчивости эритроцитов, в большей степени выраженной у нетренированных животных. Подобные различия в исследуемых показателях также связаны с эффективной работой системы АОЗ у тренированных животных, а также более выраженным снижением коэффициента ХС/ФЛ у нетренированных, поскольку ХС выполняет важную структурную функцию в клеточных мембранах.
Максимальная физическая нагрузка характеризовалась декомпенсированным усилением процессов ЛПО на фоне резкого снижения показателей АОЗ у животных 5-й группы. Данные изменения в эритроцитах мы связываем с усиленным транспортом кислорода к работающей скелетной мышце, что определяет неизбежную генерацию до-
Таблица 2
Показатели устойчивости эритроцитов к гемолизу в зависимости от тренированности и объема мышечной деятельности (M±m; п=8)
Группа №
1-я 2-я 3-я 4-я 5-я пробирки
3,8±0,2 4,3±0,2 3,0±0,2 3,1±0,2 14,7±0,8 * 1
6,8±0,5 7,9±0,5 5,2±0,3 5,4±0,4 34,3±1,6 2
27,1±1,8 30,1±1,9 20,1±1,5 21,6±1,6 73,5±2,7 3 К §
53,6±2,2 58,4±2,3 43,3±1,9 44,2±2,0 96,2±0,9 4 £ и и
93,2±1,2 98,7±0,2 84,2±2,8 85,3±2,9 100 5 Ш
100 100 97,4±0,8 98,1±0,6 100 6
Примечание. * — различия в серии с состоянием покоя статистически достоверны.
полнительных количеств активных форм кислорода и усиление свободнорадикальных реакций. Отмечено существенное увеличение коэффициента ХС/ФЛ на фоне резкого снижения устойчивости эритроцитов к гемолизу. Данные изменения носят достоверный характер и могут быть использованы в качестве критерия напряженности выполняемой физической работы.
Выводы
1. Адаптация к умеренной регулярной мышечной деятельности связана с увеличением ресурсов АОЗ организма и устойчивости эритроцитов к осмотическому гемолизу, а также снижением коэффициента ХС/ФЛ.
2. Напряженная мышечная деятельность характеризуется декомпенсированным усилением процессов ЛПО, значительным возрастанием коэффициента ХС/ФЛ на фоне резкого снижения ресурсов АОЗ и устойчивости эритроцитов к осмотическому гемолизу.
3. Содержание продуктов ЛПО (ДК, МДА), интенсивность ХЛ, АОА, АРА, активность в эритроцитах ферментов-антиоксидантов, содержание а-токоферола, коэффициент ХС/ФЛ, а также устойчивость эритроцитов к осмотическому гемолизу являются надежными критериями напряженности выполняемой физической работы.
Библиографический список
1. Дубинина Е. Е. Активность и изофермент-ный спектр супероксиддисмутазы эритроцитов и плазмы крови человека/Е. Е. Дубинина, Л. А. Сальникова, Л. Ф. Ефимова// Лабораторное дело.— 1985.— № 11.— С. 678—681.
2. Еликов А. В. Метод определения антирадикальной активности эритроцитов/
А В. Еликов, П. И. Цапок//Инф. листок № 24-025—05 Кировского ЦНТИ.— Киров, 2005.— 3 с.
3. Еликов А. В. Свободнорадикальные процессы при мышечной деятельности/ А В. Еликов, П. И. Цапок//Биохимия: от исследования молекулярных механизмов до внедрения в практику и производство: Матер. научно-практ. конф. биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири.— Оренбург, 2003.— С. 39—41.
4. Еликов А. В. Состояние процессов липо-пероксидации и антиоксидантной защиты при адаптации к мышечной деятельности/А. В. Еликов, П. И. Цапок// Пермский медицинский журнал.— 2009.— Т. XXVI.— № 4.— С. 111—115.
5. Камышников В. С. Клинико-биохимиче-ская лабораторная диагностика: справочник. В 2-х т. 2-е изд.— Минск: Интерпрес-сервис, 2003.— 953 с.
6. Медицинские лабораторные технологии: справочник/Под ред. А. И. Карпищенко.— СПб.: Интермедтехника, 2002.— 600 с.
7. Полтырев С. С. Внутренние органы при физических нагрузках/С. С. Полтырев, В. Я. Русин.— М.: Медицина, 1987.— 111 с.
8. Терехина Н. А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная система/ Н. А. Терехина, Ю. А. Петрович.— Пермь, 2005.— 58 с.
9. Цапок П. И. Хемилюминесцентный метод определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови/ П. И. Цапок, А А. Галкин//Инф. листок № 175—98 Кировского ЦНТИ.— Киров, 1998.— 3 с.
10. Berreklouw S. Упражнения, направленные на укрепление сердечно-сосудистой системы, диета и миокардиальный крово-ток//Русский медицинский журнал.— 1995.— Т. 2.— № 1.— С. 40—41.
A. V. Elikov, P. I. Tsapok
LIPOPEROXIDATION, ANTIOXIDANT PTOTECTION STATES, OSMOTIC ERYTHROCYTE RESISTANCE IN PHYSICAL
ACTIVITY OF DIFFERENT TENSION
The state of lipoperoxidation, antioxidant protection processes, cholesterol and phospholipid content in erythrocytes as well as erythrocyte resistance to osmotic hemolysis were studied in white rats of different adaptation subjected to moderate and maximal physical activity. Investigations were performed on 40 adult male white outbred rats. Muscular activity was dosed in the form of swimming activity with the load making 10% of the body weight. Dependence of lipoperoxidation processes, antioxidant protection states,
cholesterol and phospholipid content in erythrocytes and erythrocyte resistance to osmotic hemolysis on the physical activity tension and training level of animals was shown.
Keywords: lipoperoxidation, antioxidant protection, cholesterol, phospholipids, erythrocytes, osmotic hemolysis, adaptation, physical activity.
Контактная информация: Еликов Антон Вячеславович, канд. мед. наук, доцент кафедры биологической химии Кировской государственной медицинской академии, 610027, г. Киров, ул. Карла Маркса, 112, тел. 8 (8332) 67-83-58 Материал поступил в редакцию 12.02.2011
