CC BY
61
УДК 616.831-005.4: т. Ф. СЕРГЕЕВА
577.115.4-085-092.4
Е. И. ДЕМИНА Е. И. ЕРЛЫКИНА
Нижегородская государственная медицинская академия
СОСТОЯНИЕ
ПРО- И АНТИОКСИДАНТНЫХ СИСТЕМ В ТКАНИ МОЗГА И КРОВИ ПРИ КРАТКОСРОЧНОМ ГИПОКСИЧЕСКОМ
ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИИ______________________
Изучены интенсивность процессов свободнорадикального окисления и антиоксидант-ный потенциал в нервной ткани и крови при гипоксии мозга и краткосрочном гипо-барическом прекондиционировании. Установлено, что острое нарушение гемодинамики мозга приводит к росту интенсивности свободнорадикального окисления, сопровождающемуся дестабилизацией мембранных структур нервной клетки, нарушением функционирования нейрональных ферментов и выходом их в кровь. Гипобарическое пре-кондиционирование защищает мембраны клеток головного мозга, создавая тем самым условия для оптимальной работы мембраносвязанных ферментов и адаптации к гипоксии.
Ключевые слова: гипоксия, свободнорадикальное окисление, гипобарическое прекондиционирование, мембраны.
Несмотря на различие этиологических факторов и пусковых механизмов развития ишемии/гипоксии головного мозга, одним из эфферентных звеньев нарушения структуры и функции нейронов является образование активных форм кислорода (АФК) с последующей индукцией свободнорадикальных реакций и дестабилизацией биологических мембран клеток. Характерные особенности метаболизма нервных клеток — высокая интенсивность аэробных процессов и, соответственно, чрезвычайная чувствительность к развитию гипоксии вследствие высокого содержания в нервной ткани фосфолипидов, поли-ненасыщенных жирных кислот и недостаточности антиоксидантных защитных систем в головном мозге, большая часть из которых содержится в крови [1-4].
Цель работы — изучение интенсивности процессов свободнорадикального окисления и антиоксидантного потенциала в нервной ткани и крови при гипоксии мозга и краткосрочном гипобарическом прекондиционировании.
Материал и методы исследования
Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 150- 180 г. Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию осуществляли в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755).
Ишемию мозга создавали путем билатерального лигирования общих сонных артерий. Операцию проводили под наркозом: нембутал внутрибрюшинно в
дозе 30 мг/кг массы тела животного. Ткань мозга исследовали через 30 минут после оперативного нарушения гемодинамики головного мозга.
Для выделения митохондриальной фракции мозга применяли метод дифференциального центрифугирования [5].
УФ-спектроскопию диеновых и триеновых конъюгатов (ДК и ТК) проводили по методу Shenstone [6]. Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли по методу Smith [7].
Интенсивность процессов свободнорадикального окисления (СРО) оценивали с помощью метода индуцированной Н2О2- и Бе2+-хемилюминесценции в течение 30 секунд. Были изучены следующие показатели: светосумма свечения — S (отражает содержание радикалов RO2 • , соответствующих обрыву цепи СРО; на интенсивность этого процесса оказывают влияние вещества, обладающие как антиоксидант -ным, так и прооксидантным действием); интенсивность максимальной вспышки — I (отражает по-
max ' г
тенциальную способность биологического объекта к СРО); коэффициент K (характеризует антиокси-дантный потенциал) [8].
Активность креатинкиназы (КК), гексокиназы (ГК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), супероксиддис-мутазы (СОД) и каталазы измеряли спектрофотометрическим методом, активность нейрональной енолазы — с помощью иммуноферментного анализа [9—14]. Концентрацию белка определяли по методу Bredford [15].
Гипобарические тренировки осуществляли при 310 мм рт. ст. в течение одного или четырех дней с экспозицией животных в барокамере по 60 минут ежедневно.
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (104) 2011 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (104) 2011
Содержание продуктов СРО и активность ферментов антиоксидантной защиты в мозге животных в условиях острой ишемии
Условия эксперимента ДК Ед. опт. пл./ мг ОЛ ТК Ед. опт. пл./ мг ОЛ МДА Ед. опт. пл./ мг ОЛ СОД Ед. акт./ г тк. в мин. Каталаза Ед. акт./ г тк. в с
Интактные животные 0,323±0,02 п = 6 0,127 ±0,01 п=6 0,417±0,06 п = 6 33,66 ±2,04 п=6 1,47 ±0,09 п = 6
Ишемия, 30 минут 0,56±0,03* п = 6 0,34 ±0,01* п=6 0,73±0,2* п = 6 24,1 ±0,76* п = 6 0,36 ±0,02* п = 6
Примечание. * — статистически значимые различия в сравнении с интактными животными; р<0,05.
Таблица 2
Показатели хемилюминесценции ткани мозга животных при острой ишемии и 1-дневном и 4-дневном режимах гипобарического прекондиционирования с последующим нарушением гемодинамики мозга
Условия опыта Интенсивность максимальной вспышки, 1тах, мВ Светосумма медленной вспышки, Б, имп. с./мг ОЛ Коэффициент К= 1/Б
Интактные животные 1,02±0,03 10,64±0,34 0,094
п=8 п=8 п=8
Ишемия, 30 минут 1,89±0,07* 17,22 ±0,98* 0,058
п =7 п=7 п=7
1,31 ±0,04* 14,43 ±0,11* 0,069
1-дневная тренировка п=8 п=8 п=8
1-дн. трен-ка + ишемия 1,53±0,03 15,37±0,33 0,065
п=7 п=7 п=7
4-дневная тренировка 1,14 ±0,03* 11,33±0,34 0,088
п=8 п=8 п=7
4-дн. трен-ка + ишемия 1,27±0,02 11,04±0,16 0,091
п=8 п=8 п=8
Примечание. * — статистически значимые различия в сравнении с интактными животными; р<0,05
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ БЮ-БТЛТ. Для оценки значимости различий выборок применялся критерий Стьюдента 1 и определялся уровень значимости р. Результаты представлялись как М±т.
Результаты и их обсуждение
Активация СРО служит одним из механизмов повреждения мембран нервных клеток при ишемии головного мозга [16].
Для оценки интенсивности СРО были изучены содержание продуктов перекисного окисления липидов (ДК, ТК, МДА) и активность антиоксидант -ных ферментов (СОД и каталазы) (табл. 1).
Как видно из табл. 1, при 30-минутной ишемии наблюдается увеличение концентрации ТК и ДК, МДА. В то же время отмечается уменьшение активности СОД и каталазы по сравнению с исходным уровнем. Кроме того, повышается параметр хемилюминесценции Б в крови и ткани мозга животных при гипоксии в 1,3 и 1,9 раза соответственно, что свидетельствует об усилении процессов СРО. По-видимому, несмотря на снижение доступа кислорода к мозгу, тенденция к активации СРО в мембранных структурах нервных клеток сохраняется. В экспериментах Биленко также были получены данные об усилении СРО при ишемии органов [2].
Повреждающая роль АФК зачастую связана не столько с их прямым действием на клеточные структуры, сколько с инициацией каскада процессов, ведущих к повреждению клеток [1, 3, 4]. В условиях острого нарушения гемодинамики мозга усиливается
влияние продуктов деградации мембран на структуру и свойства митохондриальных ферментов. Было установлено, что 30-минутная ишемия сопровождается ослаблением связи с компонентами мембраны ГК и КК — ферментов энергетического обмена, метаболизм которого существенно нарушается при остром дефиците кислорода. Кроме того, был выявлен рост активности ЛДГ в 2,7 раза и нейрональной енолазы на 26 % относительно исходного уровня в крови животных при остром нарушении мозгового кровообращения, что может быть обусловлено модификацией структуры мембран нервных клеток при гипоксии и выходом ферментов в кровь.
Одним из эффективных способов коррекции нарушений, возникающих при изменениях гемодинамики головного мозга, являются тренировки с помощью периодического варьирования уровня кислорода при гипобарической гипоксии. Ранее было установлено, что интервальное гипоксическое прекондици-онирование способствует формированию резистентности мозга к гипоксии [16].
Состояние мембран клеток после краткосрочных режимов тренировок животных с последующим нарушением гемодинамики мозга оценивали по параметрам биохемилюминесценции (табл. 2).
Как видно из табл. 2, проверка устойчивости тренированных животных к ишемии показала зависимость изменений в параметрах биохемолюминесценции от режима предварительной тренировки.
Установлен рост основных показателей (I и Б) в 1,5 раза относительно интактных животных после однодневной тренировки, хотя полученные данные несколько ниже, чем у контрольных животных. У животных с ишемией мозга после 4-дневного
режима гипобарического прекондиционирования не выявлено существенных изменений в значениях I
J max
и S по сравнению с тренированными животными и данный показатель приближается к исходному уровню.
Зарегистрированы изменения и в антиоксидант-ном потенциале ткани мозга в зависимости от продолжительности тренировочного режима. Если при однократной тренировке коэффициент К уменьшается в 1,4 раза относительно интактных животных, то при увеличении срока тренировок до 4-х дней он приближается к интактным животным.
Следовательно, 4-дневные интервальные гипоба-рические тренировки наиболее благоприятны, поскольку соотношение про- и антиоксидантных факторов в клетке восстанавливается до нормальных значений. При этом установлен рост активности мембраносвязанной КК и ГК относительно острой ишемии, что может быть результатом инициации редокс-сигнализации и АФК-опосредованной передачи сигнала. Это приводит к активации ядерных факторов транскрипции, которые принимают непосредственное участие в активации генов, кодирующих различные защитные системы: антиоксидант -ную систему клеток, систему белков срочного ответа, способных синтезироваться при гипоксии и ре-оксигенации: NF-kB, AP-1, HIF-16, HIF-Зб и др., Redox factor-1 (Ref-1), STAT. Активация факторов транскрипции ведет к дальнейшей индукции синтеза многочисленных белков с защитной функцией, активность которых способствует адаптации и выживаемости клеток при гипоксии и ишемии [1, 3, 4, 16].
Заключение
Острая гипоксия приводит к росту интенсивности свободнорадикального окисления в нервной ткани, что сопровождается дестабилизацией мембранных структур нервной клетки, нарушением функционирования нейрональных ферментов и выходом их в кровь. Г ипобарическое прекондиционирование обладает защитным действием на мембраны клеток головного мозга, благодаря чему создаются предпосылки для оптимальной работы мембраносвязанных ферментов и адаптации к измененным условиям существования.
Библиографический список
1. Афанасьев, В. В. Патофизиология и нейропротективная терапия ишемического повреждения головного мозга /
В. В. Афанасьев, С. А. Румянцева, Е. В. Силина // Медицинский Совет. - 2008. - № 9-10. - С. 1-3.
2. Биленко, Н. В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов / Н. В. Биленко. - М. : Медицина, 1989. - 368 с.
3. Orellana, J. A. Modulation of brain hemichannels and Gap junction channels by pro-inflammatory agents and their possible role in neurodegeneration / J. A. Orellana // Antioxid. Redox. Signal. - 2009. - Vol. 11, № 2. - P. 369-399.
4. Suzaki, Y. Hydrogen peroxide stimulates c-Src-mediated big mitogen-activated protein kinase 1 (BMK1) and the MEF2C signaling pathway in PC12 cells: Potential role in cell survival following oxidative insults / Y. Suzaki // The Journal of Biological Chemistry. - 2002. - Vol. 277, № 11. - P. 9614-9621.
5. Диже, Г. П. Введение в технику биохимического эксперимента / Г. П. Диже. - Санкт-Петербург, 2003. - 86 с.
6. Shenstone, F. S. Spectrometric identification of organic compounds / F. S. Shenstone // Ultraviolet and visible spectroscopy of lipids. - N.-Y. , 1971. - P. 77-91.
7. Smith, J. B. Malondialdehyde formation as an indication of prostaglandin production by human platelets / J. B. Smith, C. M. Jngerman, M. G. Silver // J. lab. Clin. Med. - 1976. -Vol. 88, № 4. - P. 167-172.
8. Кузьмина, Е. И. Биохимия и биофизика микроорганизмов / Е. И. Кузьмина, Л. С. Нелюбин, М. К. Щепникова. -М. : Наука, 1983. - 189 с.
9. Koufen, P. Free radical-induced inactivation of creatine kinase: influence on the octameric and dimeric states of the mitochondrial enzyme (Mib-CK) / P. Koufen // Biochem. J. -1999. - Vol. 344. - P. 413-417.
10. Felgner, P. L. Purification of nonbindable and membrane bindable mitochondrial hexokinase from rat brain / P. L. Felgner, J. E. Wilson // Biochem. Biophys. Res. Communs. - 1976. -Vol. 68, № 2. - P. 592-597.
11. Хватова, Е. М. Метаболизм острой гипоксии / Е. М. Хватова, Н. В. Мартынов. - Горький, 1977. - 160 с.
12. Торопова, Н. Е. Оценка информативности нейрон-специфической енолазы, определяемой иммуноферментным методом / Н. Е. Торопова, Е. А. Дорофеева, С. П. Дворянинова, С. П. Васиева // Клинич. лабор. диагн. - 1995. - № 1. -
С. 15-17.
13. Nishikimi, M. The occurrence of superoxide anion in the reactions of reduced phenazine metasulfate and molecular oxygen / M. Nishikimi // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1972. -Vol. 146, № 2. - P. 849-854.
14. Aebi, H. Methoden der erymatiechen analyses / H. Aebi // Biochemistry. - 1970. - Vol. 2, № 2. - P. 636-647.
15. Bredford, T. Refinement of the coomassie blue method of protein quantitation. A simple and linear spectrophotometric assay for less than or equal to 0.5 to 50 microgram of protein / T. Bred-ford, T. Spector // Anal. Biochem. - 1978. - Vol. 86, № 1. -P. 142-146.
16. Лукьянова, Л. Д. Сигнальная функция митохондрий при гипоксии и адаптации / Л. Д. Лукьянова // Патогенез. -2008. - Т. 6, № 3. - С. 4-12.
СЕРГЕЕВА Татьяна Фёдоровна, кандидат биологических наук, ассистент кафедры биохимии им. Г. Я. Городисской.
ДЕМИНА Елена Ивановна, аспирант кафедры биохимии им. Г. Я. Городисской.
ЕРЛЫКИНА Елена Ивановна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой биохимии им. Г. Я. Городисской.
Адрес для переписки: 603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, 10, корп. 1.
Статья поступила в редакцию 13.07.2011 г.
© Т. Ф. Сергеева, Е. И. Демина, Е. И. Ерлыкина
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 1 (104) 2011 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
