CC BY
94
УДК: 616-006. 68: 616.15]-092.9
состояние про- и антиоксидантной активности сыворотки крови у крыс с КАрЦИносАркомой WALKER-256
А.в. Ефремов1, Е.в. овсянко1, д.д. Цырендоржиев2, с.в. мичурина1, Ю.в. пахомова1
новосибирский государственный медицинский университет1 научный центр клинической и экспериментальной медицины Со РАМИ, г. новосибирск2 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52, e-mail: [email protected]
Исследована динамика про- и антиоксидантной активности, а также состояние перекисного окисления липидов в сыворотке крови крыс-самцов линии Вистар с перевиваемой карциносаркомой Walker-256. Суспензию клеток перевиваемой карциносаркомой Walker-256 вводили в мышцу бедра в дозе 106 клеток. Для получения сыворотки крови крыс декапитировали под эфирным наркозом, спустя пять суток с момента перевивки опухоли, на 3, 7 и 14-е сут эксперимента. Для оценки баланса в системе «оксиданты-антиоксиданты» были произведены расчеты коэффициента соотношения между показателями про- и антиоксидантной активности сыворотки крови крыс. На всех сроках развития карциносаркомы Walker-256 наблюдалось повышение коэффициента соотношения про- и антиоксидантной активности сыворотки крови крыс, свидетельствующее о смещении баланса в системе «оксиданты-антиоксиданты» в сторону оксидантов, что говорит о развитии окислительного стресса.
Ключевые слова: карциносаркома Walker-256, прооксидантная и антиоксидантная активность.
PRO-AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF BLOOD SERUM IN RATS WITH WALKER-256 CARCINOSARCOMA A.E. Efremov1, E.V. Ovsyanko1, D.D. Tsyrendorzhiev2, S.VMichurina1, Yu.V. Pakhomova1 Novosibirsk State Medical University1 Research Center of Clinical and Experimental Medicine, Siberian Branch of the RAMS, Novosibirsk2 52, Krasny avenue, 630091-Novosibirsk, e-mail: [email protected]
Changes in pro-and antioxidant activity and lipid peroxidation in blood serum were studied in male Wistar rats with inoculated Walker-256 carcinosarcoma. Cell suspension of inoculated Walker-256 carcinosarcoma was injected into a femoral muscle at a dose of 106cells. In order to obtain blood serum, rats were decopitated under ether narcosis 5 days after tumor inoculation, on days 3, 7 and 14. The ratio between pro-and antioxidant activity parameters in blood serum of rats was calculated to assess the balance in the oxidants-antioxidants system. The increase in the ratio between pro-and antioxidant activity of blood serum was observed at all stages of Walker-256 carcinosarcoma, indicating the balance displacement in the oxidants-antioxidant system towards oxidants, that is evidence of oxidative stress.
Key words: Walker-256 carcinosarcoma, prooxidant and antioxidant activity.
В сыворотке крови содержится большое количество провоспалительных факторов, которые, в свою очередь, встречают противодействие со стороны антивоспалительной активности сыворотки [7]. Существуют методические подходы, которые позволяют оценивать общую флогогенную активность сыворотки крови по ее способности усиливать кислородзависимую биоцидность лейкоцитов, в результате которой активируются процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ). С другой стороны, усиление свободнорадикальных реакций в физиологических условиях в тканях уравновешивается активностью внутри- и внеклеточных антиоксидантов, формируя определенный оптимальный
уровень про- и антиоксидантного равновесия [4]. Для объективной оценки активности патологического процесса с усилением реакции свободнорадикального окисления необходимо учитывать механизмы компенсации с определением состояния антиоксидантного статуса. В патогенезе как самих опухолевых заболеваний, так и осложнений их лечения важную роль играет соотношение про- и антиоксидантного статуса организма.
Целью исследования было изучение степени нарушения баланса «оксидант-антиоксидант» в организме крыс в динамике развития саркомы Walker-256 и оценка состояния про- и антиоксидантного статуса в сыворотке крови.
Материал и методы
Исследование проводили на крысах-самцах линии Вистар, массой 180-200 г, полученных из вивария ЦНИЛ университета. Эксперименты были выполнены с соблюдением принципов гуманности в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздрава СССР от 12.08.77). Суспензию клеток перевиваемой карциносаркомой Walker-256 вводили в мышцу бедра в дозе 106 клеток, концентрация была выбрана в соответствии с существующими рекомендациями [8]. Размеры опухоли измеряли штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях и их перемножением определяли объем новообразования. Животных держали при фиксированном световом режиме (свет - темнота 12:12 с включением освещения в 8.00 и выключением в 20.00) и максимально стандартизированной окружающей температуре. В каждой группе было 7-10 крыс. Для получения сыворотки крови их декапитировали под эфирным наркозом, спустя пять суток с момента перевивки опухоли, на 3, 7 и 14-е сут экспериментальных исследований.
Прооксидантную активность (ПОА) сыворотки крови определяли с помощью лейкоцитарных тестов [6], общую антиоксидантную активность (АОА) сыворотки крови определяли с помощью хемилюминометра (ХЛ) по степени торможения суммарной ХЛ светимости, запускаемой 3 % Н2О2 [3]. Состояние ПОЛ оценивали по уровню малонового диальдегида (МДА) [5] и диеновых конъюгатов (ДК) [2] в сыворотке крови. Для оценки баланса в системе «оксиданты-антиоксиданты» были произведены расчеты коэффициента соотношения (КС) между показателями ПОА и АОА сыворотки крови крыс. Расчет данного параметра обусловлен тем, что в научной литературе активно используется термин «окислительный стресс», который отражает дисбаланс в системе «оксиданты-антиоксиданты» в сторону усиления окислительных процессов [4].
Анализ данных вели на PC CPU Intel P-II 750 МГц Celeron в среде Windows по программе SPSS 16.0 и Microsoft Excel версии 1998. Тестирование параметров распределения проводилось
с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. При работе с базой данных велось определение средних арифметических величин и стандартных ошибок средних арифметических (М ± т). Значимость различий средних арифметических ранжированных критериев при нормальном распределении оценивалась с помощью ^критерия Стьюдента. За достоверность различий принималось значение р<0,05.
Результаты и обсуждение
Среднее значение общей ПОА сыворотки крови интактных крыс составило 0,28 ± 0,003 усл.ед (рис. 1). В динамике развития карци-носаркомы Walker-256 величина общей ПОА сыворотки крыс на всех сроках наблюдения достоверно превышала среднее контрольное значение. Так, на 3-и сут была отмечена максимально высокая величина общей ПОА сыворотки крови, в среднем она составляла 0,56 ± 0,01 усл.ед., что было в 2,3 раза выше, чем в контроле
0,6 п *
0,2
0,1
О 4------------------------------------------------------------------
3 7 14 сут
—О— Контроль —п— W -256
Рис. 1. Общая прооксидантная активность сыворотки крови в динамике развития саркомы Walker-256. Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с группой контроля
Рис. 2. Содержание малонового диальдегида в сыворотке крови крыс в динамике развития саркомы Walker-256. Примечание:
* - различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (р<0,05)
СОСТОЯНИЕ ПРО- и АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ У КРЫС
--------------------------------------------------------------------------- 59
(р<0,01). На последующих сроках наблюдения у крыс с карциносаркомой Walker-256 ПОА сыворотки крови снижалась: к 7-м и 14-м сут наблюдения ее средние значения превышали контроль соответственно в 1,6 и 1,5 раза и в среднем составили 0,38 ± 0,005 и 0,33 ± 0,004 усл.ед. (в обоих случаях р<0,05) (рис. 1).
В результате определения вторичных, стабильных продуктов ПОЛ в динамике развития карциносаркомы Walker-256 был выявлен примерно одинаковый характер изменений в содержании МДА и ДК в сыворотке крови крыс. Так, уровень МДА в сыворотке крови крыс контрольной группы в среднем составил 0,06 ± 0,004 нг/ мл. В то же время на 3-и сут развития карциносаркомы Walker-256 уровень МДА в сыворотке крови крыс достоверно возрастает и достигает 0,077 ± 0,006 нг/мл (р<0,05). Однако на 7-е сут его содержание было ниже контроля, но статистически не значимо, а к 14-м сут наблюдения достигает контрольных значений - 0,039 ± 0,015 и 0,056 ± 0,005 нг/мл соответственно (рис. 2). Уровень ДК в сыворотке крови крыс контрольной группы в среднем составил 0,39 ± 0,028 нг/ мл. Так же как и МДА, к 3-м сут у животных с карциносаркомой Walker-256 уровень ДК в сыворотке крови достоверно возрастал до 0,44 ± 0,015 нг/мл (р<0,05). На последующих сроках исследования уровень ДК в сыворотке крови постепенно снижался. Содержание ДК на 7-е сут в среднем составило 0,41 ± 0,046 нг/мл, а к 14-м сут наблюдения практически не отличалось от контрольных величин - 0,38 ± 0,025 нг/мл (рис. 3). Таким образом, при развитии карциносаркомы Walker-256 значительно повышалась общая ПОА в сыворотке крови крыс, что свидетельствовало об активации свободнорадикальных реакций ПОЛ, которые подтверждаются данными определения МДА и ДК.
Среднее значение общей антиоксидантной активности (АОА) сыворотки крови интактных крыс составило 9,6 ± 0,08 усл.ед (рис. 4). В динамике развития карциносаркомы Walker-256 величина общей АОА сыворотки крыс на всех сроках наблюдения достоверно была ниже, чем у крыс контрольной группы. На 3-и сут эксперимента у животных с карциносаркомой Walker-256 величина общей АОА сыворотки крови была ниже контрольных величин в 1,3
крыс в динамике развития саркомы Walker-256. Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с группой контроля (р<0,05)
12 п
2
о---
3 7 14 сут
—О— Контроль —о— XV -256
Рис. 4. Общая антиоксидантная активность сыворотки крови в динамике развития саркомы Walker-256. Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с группой контроля
раза, в среднем составляя 7,38 ± 0,06 усл.ед. (р<0,05). На последующих сроках наблюдения общая АОА сыворотки крови продолжала снижаться, к 7-м и 14-м сут наблюдения средние величины общей АОА сыворотки крови крыс с карциносаркомой Walker-256 были ниже контроля соответственно в 2,4 и 1,6 раза и в среднем составили 4,0 ± 0,03 и 6,0 ± 0,05 усл.ед. (в обоих случаях р<0,01) (рис. 4).
В динамике развития саркомы Walker-256 выявлено закономерное снижение общей АОА сыворотки крови. При этом наиболее значимое снижение общей АОА сыворотки крови наблюдается к 7-м сут развития карциносаркомы Walker-256. Эти результаты согласуются с известными фактами о том, что опухолевая ткань способна к накоплению естественных и природных антиоксидантов, в результате чего в самой опухоли происходит подавление ПОЛ, а в нормальных тканях снижается антиоксидантная
3 7 14сут
—о— Контроль —о— -256
Рис. 5. Динамика коэффициента соотношения (Кс) ПОА и АОА сыворотки крови крыс на разных сроках развития саркомы Walker-256. Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с группой контроля
защита и повышается уровень активных метаболитов кислорода [1, 9].
При изучении КС ПОА и АОА сыворотки крови крыс было выявлено, что в группе интактных крыс КС ПОА и АОА сыворотки крови в среднем составил 2,48 ± 0,03 усл.ед. В динамике развития карциносаркомы Walker-256 величина КС ПОА и АОА сыворотки крови крыс значительно превышала контрольные цифры. Так, на 3, 7 и 14-е сут наблюдения карциносаркомы Walker-256 средние величины КС ПОА и АОА сыворотки крови крыс соответственно составили 7,42 ± 0,09, 9,53 ± 0,11 и 5,56 ± 0,07 усл.ед. Максимальное значение КС ПОА и АОА сыворотки крови крыс наблюдается к 7-м сут развития карциносарко-
мы Walker-256 (рис. 5). Таким образом, на всех сроках развития карциносаркомы Walker-256 наблюдалось достоверное повышение коэффициента соотношения (КС) ПОА и АОА сыворотки крови крыс, свидетельствующее о смещении баланса в системе «оксиданты-антиоксиданты» в сторону оксидантов, что говорит о развитии окислительного стресса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П. Антиоксиданты в химиотерапии опухолей: Обзор // Вопр. онкологии. 1990. № 10. С.1155-1162.
2. Гаврилов В.Б., Мишкогрудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лаб. дело. 1983. № 3. С. 33-35.
3. Журавлев А.И., Журавлева А.И. Сверхслабое свечение сыворотки крови и его значение в комплексной диагностике. М.: Медицина, 1975. 185 с.
4. Зенков Н.К., ЛанкинВ.З., МеньщиковаЕ.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001. 343 с.
5. Камилов Ф.Х., Винькова Г.А., Орлова Н.С. Активность перекисного окисления липидов и антиоксидантных ферментов в слезной жидкости и при посттравматическом увеите // Клин. лаб. диагн. 1999. № 7. С. 7-9.
6. Маянский Д.Н., Цырендоржиев Д.Д., Макарова О.П. и др. Диагностическая ценность лейкоцитарных тестов. Определение биоцидности лейкоцитов: Методические рекомендации. Ч. 2. Новосибирск, 1996. 47 с.
7. Маянский Д.Н., Урсов И.Г. Лекции по клинической патологии. Новосибирск, 1997. 249 с.
8. Хегай И.И., ПоповаН.А., Иванова Л.Н. Влияние экспрессии гена вазопрессина на рост карциносаркомы Walker-256 у крыс // Генетика. 2000. Т. 42, № 7. С.993-995.
9. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Lipid peroxidation, oxygen radicals, cell damage, and antioxidant therapy // Lancet. 1984. Р.1396-1398.
Поступила 9.12.08
