CC BY
55
© Багмут И.Ю.
УДК 614.777:543.39:547.42
СОСТОЯНИЕ ОБМЕНА ЬТРИПТОФАНА В УСЛОВИЯХ ПОДОСТРОГО ОПЫТА ПОД ВЛИЯНИЕМ ОЛИГОЭФИРЦИКЛОКАРБОНАТА В СУБТОКСИЧЕСКИХ ДОЗАХ*
Багмут И.Ю.
Харьковская академия последипломного образования, г. Харьков
На 40 статевозрлих щурах популяцП Всстар в пщгострому дослдд/ вивчено дю малих субтоксических доз ксенобо-тика - олггеф1рц1клокарбоната марки П-803 з розрахунку 1/10; 1/100 /1/1000ЛД50 на оргамзм. У сировац кров1 дослдних / контрольних тварин визначали вмсст I-триптофану та його метаболтв - серотонну, мелатонну, 5 -окандолуксусной кислоти (5-О1УК), тваринного ¡ндкана, в печнц активнссть ферменту триптофан-2,3-доксигенази (ТДО). У сировац кров1 визначався також один з кнцевих продукт/в окисного дезамнування амно-кислот, богенних амнвв, пуринових азотистих основ та н - ам1ак (N43). Встановлено, що ксеноботик в 1/10 / 1/100 ЛД50 знижував вмст у плазм! кров1 мелатонну ¡триптофану на л пдвищення серотонну, 5-О1УК, ¡нд'кана, ам1аку та ативнот в печнц ферменту ТДО. Результати свдчать, що олггоеф1рц1клокарбонат в 1/10 / 1/100 ЛД50 призводить до глибокого порушення блкового, нейромед1аторного, гормонального, кофакторного обмнвв в орга-н1зм1 щур1в.
Ключовi слова: ксенобютики, 1_-триптофан, серотонш, мелатонш, 5-оксшдолуксусна кислота (5-О1УК), тваринний Ыдикан, печЫка, сироватка крс^ щурiв.
Данная работа является фрагментом НИР ХНМУ «Вивчення механiзмiв бюлоггчног ди простых полiефiрiв у зв'язку з проблемою охорони навколишнього середовища», государственный регистрационный номер 0110и001812.
Вступление
За последние десятилетия синтезированы десятки, а то и сотни тысяч новых химических веществ, зачастую химически стойких, высокоактивных, обладающих выраженной биотропностью, к которым человек эволюционно не адаптирован [7,3]. Возник значительный разрыв между высокой способностью современной цивилизации создавать новый химический потенциал и ограниченными возможностями по нейтрализации вредного его воздействия на флору и фауну. Такая ситуация обеспечивает реальные условия для формирования различных экологически обусловленных заболеваний и патологических состояний. Вместе с тем, механизмы действия многих химических соединений и их комбинаций в большинстве случаев остаются не изученными [4]. Необходимость всестороннего и глубокого изучения патохимических механизмов формирования патологических состояний, тесно сопряжена с разработкой профилактических мероприятий и коррекцией структурно-метаболических нарушений, которые возникают в условиях длительного субтоксического воздействия на организм химических веществ [8]. Особенно актуальной эта задача становится для новых и совершенно не изученных химических соединений, способных оказывать не только непосредственное токсическое действие на организм, но и формировать развитие возможных отдаленных эффектов-мутагенеза, канцерогенеза, атерогенеза, иммунологической недостаточности, тератогенеза и др. В связи с этим, изучение патофизиологических механизмов действия на организм малых субтоксических доз ксенобиотиков является первоочередной задачей в составлении прогноза потенциальной опасности новых химических соединений, которые находятся на стадии опытного производства и внедрения в народное хозяйство. Это
в полной мере относится и к новому химическому соединению промышленности полиоксипропиленпо-лиолов - олигоэфирциклокарбонату, который нашел широкое применение в различных отраслях народного хозяйства для получения эпоксидных смол, лаков, эмалей, пластмасс, пенопластов, термопластов и др. [4,8,9]. Учитывая вышесказанное, целью работы являлось изучение влияния субтоксических доз олиго-эфирциклокарбоната, в условиях длительного поступления в организм, на обмен незаменимой аминокислоты 1_ - триптофан в подостром опыте.
Материалы и методы исследования
Программа исследования предусматривала проведение подострого токсикологического опыта на половозрелых белых крысах популяции Вистар, массой 180-200 г. В соответствии с условиями эксперимента животные ежедневно на протяжении 45 суток утром до кормления с помощью металлического зонда подвергались пероральной затравке водными растворами олигэфирциклокарбоната марки П-803 из расчета 1/10; 1/100 и 1/1000 ЛД50. Контрольная группа получала соответствующие объемы питьевой воды. На основании параметров острой токсичности П-803 относится к малотоксичным соединениям (4 класс опасности), не обладающим кумулятивными свойствами и видовой чувствительностью. Среднесмер-тельная доза (ЛД50) для белых крыс была установлена на уровне 18,75 г/кг массы животного, а коэффициент кумуляции (Кк) на уровне 7,82. Выбор данного ксенобиотика для научных исследований был обоснован отсутствием прогностической характеристики потенциальной опасности для теплокровных животных и человека, большими объемами производства, широким контактом населения с данным ксенобиотиком, а также необходимостью обоснования гигиенических нормативов в качестве предельно
* Цитування при атестацй кадрю: Багмут И.Ю. Состояние обмена 1-триптофана в условиях подострого опыта под влиянием олигоэфирциклокарбоната в субтоксических дозах // Проблеми екологп I медицини. - 2014. - Т. 18, № 1-2. - С. 50 -53
допустимых концентраций в объектах окружающей среды. Проведение подострого опыта сопровождалось соблюдением биоэтики и принципов «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для научных и других целей» -Страсбург, 1985 г. Всего было использовано в экспериментальной части работы 40 белых крыс, по 10 в каждой опытной и контрольной группе.
Исследование обмена триптофана предусматривали определение в сыворотке крови опытных и контрольных животных содержания L-триптофана и его метаболитов - серотонина, мелатонина, 5 - оксиндо-луксусной кислоты (5-ОИУК), животного индикана, в печени активность фермента триптофан-2,3-диоксигеназы (ТДО). В сыворотке крови определялся также один из конечных продуктов окислительного дезаминирования аминокислот, биогенных аминов, пуриновых азотистых оснований и др. - аммиака (NH3). Определение аммиака в сыворотке крови осуществлялось методом ионообменной хроматографии на ионитах. После разделения субстратов на иони-тах регистрация концентрации NH3 осуществлялась на автоматическом анализаторе аминокислот Т-339 (Чехия). Триптофан и его метаболиты обмена - серо-тонин, 5- ОИУК определялись по Atack C., Magnusson T. [10]. Мелатонин исследовался иммуноферментным методом с помощью моноклональных антител. Для этих целей использовался набор реактивов Melatonin ELJSA (Hamburg). Kat-N2RE 54021. О функциональном состоянии процессов превращения аминокислот в толстом кишечнике под влиянием микрофлоры и обезвреживающей функции печени судили по количеству конечного продукта обмена триптофана - животного индикана в сыворотке крови общепринятым методом [2]. Известно, что L-триптофан является стабилизатором фермента ТДО. Способствуя образованию устойчивого конформационного состояния, ТДО печени обладает абсолютной субстратной специфичностью по отношению к L-триптофану и катализирует необратимую ключевую реакцию катаболизма аминокислоты по кинурениновому пути ее обмена с образованием N-формилкинуренина, а в последствии одного из ключевых конечных метаболитов - НАД+. Этот фермент ускоряет встраивание молекулярного кислорода непосредственно в молекулу L-триптофана, а катализируемая им реакция является скорость лимитирующей стадией превращения субстрата. Активность ТДО определяли по Badawе А.А. - В., Evans M.[11 ]. Статистическую обработку результатов исследования выполняли с использованием критерия Стьюдента-Фишера.
Результаты исследования и их обсуждение
Изучение влияния олигоэфирциклокарбоната П-803 на обмен скорость лимитирующей аминокислоты L-триптофана обнаружило, что ксенобиотик в 1/10 и 1/100 ЛД50 снижал содержание в плазме крови мелатонина и триптофана на фоне повышения серотонина, 5-ОИУК, индикана, аммиака и активности в печени фермента ТДО (табл.). Так, L-триптофан снижался на 39,04% и 21,64%, мелатонин на 73,79% и 53,23% при этом серотонин повышался на 721,42% и 560,71%, 5-ОИУК на 454,76% и 326,19%, индикан на 269,56% и
179,13%, аммиак повышался на: 128,34% и 92,3%, соответственно под влиянием 1/10 и 1/100 ЛД50. Известно, что триптофан является источником образования никотинамидных коферментных форм (НАД+ и НАДФ) витамина РР - ниацина, синтеза биогенного моноамина - серотонина, гормона - мелатонина, индуктора клеточной дифференцировки и пролиферации - 5 - оксииндолацетата, которые способны оказывать значительное влияние на обменные процессы различных органов и тканей организма [5]. Было убедительно показано влияние серотонина на медиатор-ные процессы в нервной системе, он выполняет роль местного регулятора функций периферических органов и тканей, является мощным сосудосуживающим агентом и стимулятором сокращения гладко-мышечных тканей.
Около 95% серотонина взрослого человека вырабатывается в энтерохромафинных клетках кишечника. Остальная часть его находится в тучных клетках соединительной ткани кожи, селезенки, печени, почках, легких, эпифизе, коре головного мозга, гипоталамусе, тромбоцитах крови и др. [5]. L-триптофан и непосредственный предшественник серотонин, являются субстратами для синтеза гормона эпифиза, обеспечивающего циркадные ритмы метаболических процессов в организме - мелатонина, который образуется путем ^ацетилирования и последующего метилирования 5-окситриптамина [6]. Этот гормон регулирует половое созревание, теплообмен, дыхание, водно-солевой обмен, бодрствование, циркадную динамику обменных процессов в различных органах и тканях организма в зависимости от времени суток, сезонов года, является иммуномодулятором и активным субстратом, обладающим антирадикальными и анти-перекисными свойствами и др. Вместе с тем, L- триптофан может превращаться в желудочно-кишечном тракте под влиянием микрофлоры толстого кишечника в индол, скатол, крезол и др. индольные производные. Конечным продуктом этих превращений, экскре-тируемых с мочой является в основном 5-оксииндолацетат, который выступает сильным мито-генным фактором дифференцировки и пролиферации быстро обновляющихся тканей [5,6]. Эти нарушения характеризовались и существенным повышением продукта окислительного дезаминирования аминокислот, биогенных моноаминов - аммиака ^Н3), а также животного индикана (Табл.). Известно, что главным, если не единственным механизмом, посредством которого активность ТДО влияет на синтез серотонина в организме, служит изменение уровня свободного L-триптофана [5,6]. Исследования обнаружили повышение активности ТДО и снижение содержания L-триптофана в сыворотке крови. В этих метаболических условиях открывается путь повышенного синтеза коферментных форм НАД+ и НАДФ необходимых для усиления окислительно-восстановительных процессов, дифференцировки и пролиферации, как результат защитно-приспособительных реакций организма, которые направлены на активацию восстановительных синтезов в условиях субтоксической токсификации.
Таблица
Влияние олигоэфирциклокарбоната П-803 на состояние обмена Ь-триптофана в условиях субтоксического длительного
поступления в организм.
Показатели
Группа наблюдения, ЛД50, М ±m
Том. i8, N 1-2 2014 р.
Контроль 1/10 1/100 1/1000
L-триптофан (мкм/л) 68,4±3,2 41,7±2,8* 53,6±3,5* 49,6±4,3
Серотонини (мкм/л) 0,56±0,04 4,6±0,52* 3,7±0,46* 0,53±0,05
5-ОИУК (мкм/л) 0,42±0,02 2,33±0,18* 1,79±0,14* 0,38±0,04
Мелатонин (пкг/л) 178,5±7,3 46,8±4,10* 83,5±6,2* 184,7±8,5
Индикан (мкм/л) 2,3±0,26 8,5±0,76* 6,42±0,57* 2,17±0,24
Аммиак (нмоль/л) 24,7±1,54 56,4±4,3* 47,5±3,3* 26,4±2,5
ТДО (нмоль кинурени-на/мг белка-1час) 36,5±2,7 71,6±5,8* 63,7±4,9* 35,6±3,2
Примечание:*различия достоверные, р<0,05
Регуляция ТДО осуществляется по типу обратной связи конечными продуктами кинуренинового пути обмена 1_-триптофана - НАД+ и НАДФ+. Активация фермента сопряжена с повышением содержания субстрата окисления - 1_-триптофана. Положительными активаторами фермента ТДО являются ионы Си2+, гематин, ферригем и б-аминолевуленовая кислота (б-АЛК). Гемин, при этом, является коферментом ТДО. Существенное повышение активности ТДО позволяет судить о снижении белоксинтетической функции синтеза гемоглобина, в результате чего гем окисляется кислородом в гемин, являющийся коферментным активатором данного фермента, а с другой стороны -окисленная форма гема (гемин) тормозит активность митохондриального энзима б-аминолевуленат-синтазы, катализирующей первую реакцию синтеза гема из сукцинил~КоА из глицина - б-аминолеву-леновой кислоты.
Обнаруженные изменения в обмене 1_-триптофана и активности ТДО может свидетельствовать о нарушении сопряженных метаболических процессов, связанных с анаболическими и катаболическими превращениями белков, нейромедиаторов, гормонов, индукторов дифференцировки и пролиферации, конечных метаболитов обмена и др. Значительная часть метаболита 1_-триптофана, биогенного амина -серотонина, подвергается окислительному дезамини-рованию с образованием аммиака, Н2О2, альдегида, 5-ОИУК, при этом превращение триптофана может быть связано и с синтезом мелатонина, уровни которого были существенно ниже под влиянием 1/10 и 1/100 ЛД50 олигоэфирциклокарбоната. Серотонин занимает промежуточное положение между гормонами и нейромедиаторами. Этот медиатор суживает арте-риолы и повышает артериальное давление, усиливает перистальтику кишечника, оказывает антидиуретическое действие. В центральной нервной системе серотонин выполняет функцию медиатора и является источником синтеза в эпифизе гормона мелатонина. Литературные источники свидетельствуют, что мела-тонин в неонатальном периоде развития влияет на дифференциацию центров головного мозга, контролирующую функцию гонад и надпочечников в «критическом» периоде развития [5,6]. Он угнетает секрецию гонадотропинов в гипоталамусе и обусловливает антагонистические взаимоотношения между этим органом и половыми железами, являясь физиологическим ингибитором преждевременного полового созревания. Ему принадлежит важная роль в работе механизма «биологических часов», периодичности активации и ингибирования функций организма в разное время суток, сезонов года [1,5,6].
Результаты динамики серотонина и мелатонина указывают о серьёзной дисфункции нейроэндокрин-ной системы в регуляции структурно-метаболических процессов и механизмах развития патологических состояний. Уровень одного из конечных продуктов об-
мена L-триптофана - животного индикана был значительно повышен под влиянием 1/10 и 1/100 ЛД50 олигоэфирциклокарбоната, что подтверждает увеличение образования конечного токсичного продукта распада L-триптофана - индола. Эти данные свидетельствуют о нарушении процессов, которые связаны с пищеварением белков на фоне возможного изменения микробиологического профиля кишечника, сопряженных с развитием гнилостных процессов и дис-бактериозом [2]. Вместе с тем, исследования показывают на активацию детоксикационной функции печени, что подтверждалось увеличением в сыворотке крови индола, связанного в виде эфиросерной кислоты с калием или натрием (индикан). Известно, что одним из метаболитов обмена L-триптофана является 3-гидроксиантраниловая кислота, обладающая анти-оксидантными свойствами. Она отличается способностью восстанавливать а-токоферол, ассоциированный с липопротеидами низкой плотности (ЛПНП). Анализ полученных результатов обмена L-триптофана и усиление активности ТДО при токсифи-кации олигоэфирциклокарбонатом, способно вносить определенный вклад в условия формирования кооперативного взаимодействия оксидантно-антиоксидантного гомеостаза, который может быть сопряжен с усилением свободно-радикальных процессов, активацией перекисного окисления липидов, окислительной модификацией белков и развитием мембранной патологии.
Выводы
Изучение обмена L-триптофана у экспериментальных животных свидетельствует, что олигоэфир-циклокарбонат в 1/10 и 1/100 ЛД50 приводит к глубокому нарушению белкового, нейромедиаторного, гормонального, кофакторного обмена, сопровождающихся эндотоксемией, которая подтверждалась увеличением в сыворотке крови содержания аммиака и производного индола - индикана, что является неблагоприятным показателем оценки состояния гомеостати-ческой функции организма. Исследования показывают, что действие ксенобиотика может сопровождаться политропными нарушениями со стороны различных органов, систем и функций, в основе которых лежит свободнорадикальная патология и оксидативный стресс.
Литература
1. Аржевицкая И.А. Основы физиологии обмена веществ и эндокринной системы. - Высшая школа, М.: - 1983, -271 с.
2. Воронина Л.Н., Десенко В.Ф., Кравченко В.Н. и соавт. Руководство к лабораторным и семинарским занятиям по биологической химии. - Харьков. - «Основа», -1996. - 430 с.
3. Жуков В.И., Мясоедов В.В., Стеценко С.А. Эколого-гигиеническая характеристика азотсодержащих поверхностно-активных веществ как загрязнителей водоемов. - Харьков: «Торнадо», 2000. - 180 с.
4. Жуков В.И., Попова Л.Д., Зайцева О.В., Кратенко Р.И. и др. Простые и макроциклические эфиры: научные основы водных объектов. - Харьков, «Торнадо» 2000. -438 с.
5. Науменко Е.В., Попова Н.К. Сератонин и мелатонин в регуляции эндокринной системы. - Новосибирск, «Наука» 1975. - 213 с.
6. Строев Е.А. Биологическая химия. - М.: Высшая школа. 1986. - 470 с.
7. Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Щербань Н.Г., Евдокимов В.И., и др. Научные основы обоснования прогноза потенциальной опасности детергентов в связи с регламентацией в воде водоемов. - Белгород, 2001. - 442 с.
8. Цыганенко А.Я., Шаповал Л.Г., Зовский В.Н., Щербань Н.Г., и др. Эколого-гигиеническая характеристка детергентов на основе алкилфенолов, изозонилфенолов и
вторичных спиртовых фракций С10-20 как загрязнителей водоемов - Белгород. - «Белвитамины», 2000. -170 с.
9. Щербань Н.Г., Жуков В.И., Мясоедов В.В., Капустник В.А. Биохимические механизмы радиомиметических эффектов поверхностно-активных веществ. - Харьков, - «Раритеты Украины», 2012. - 120 с.
10. Atack C. Procedure for the isolation of noradrenaline, adrenaline, dopamine, 5-hydroxytryptamine and histamine from the same tissue sample using a single column of strongly acidic cation exchange resin / C. Atack, T.A Mag-nusson. // «Acta pharmacol et toxicol».-1978.-V.42.-P.35-57.
11. Badawe A. The effect of chemical porphyrogens and drugs on activity of rat liver tryptophan pyrrolase / A. Badawe, M. Evans // Biochem J. - 1973. - Vol.136 - P.885-892.
ENGLISH VERSION: STATE OF EXCHANGE OF L-TRYPTOPHAN IN THE SUBACUTE EXPERIMENT UNDER INFLUENCE OF OLIGOETHERCYCLOCARBONAT IN THE SUBTOXIC DOSES*
Bagmut I.Yu.
Kharkov Academy of Postgraduate Education, Kharkov, Ukraine
The effects of small doses of sub-toxic xenobiotic - oligoethercyclocarbonat type P-803 at the rate of 1/10; to 1/100 and 1/1000 of the body LD50 investigated were in 40 adult Wistar rats in the subacute experiment. In the blood serum of experimental and control animals the content of L-tryptophan and its metabolites - serotonin, melatonin, 5 - oxigindola-cides acid (5-OIAA), animal indican in liver enzyme activity tryptophan-2,3-dioxygenase (TAR) were were determined. The serum is also one of the end products of oxidation deaminationof amino acids, biogenic amines, purine nitrogenous bases, etc. - ammonia (NH3). It was established that xenobiotic 1/10 and 1/100 of reduced content of LD50 in plasma of melatonin and tryptophan against increase of serotonin, 5-OIAA, indican, ammonia and enzyme activity in liver TAR. The results indicate that oligoethercyclocarbonat 1/10 and 1/100 LD50 leads to profound disruption of protein, neurotransmitter, hormone, cofactor metabolism in rats.
Keywords: xenobiotics, L-tryptophan, serotonin, melatonin, 5 blood serum of rats.
Introduction
Over the past decade synthesized dozens or even hundreds of thousands of new chemicals are often chemically resistant, high-level, with pronounced biotropicality to which a man is not evolutionarily adapted [7, 3]. A significant gap between high ability of modern civilization to create a new chemical potential and limited capacity to neutralize its harmful effects on the flora and fauna originated. This situation provides the real conditions for the formation of various environment-related diseases and conditions. However, the mechanisms of action of many chemical compounds and combinations thereof, in most cases remain unexplored. [4] The need for extensive study pathochemical mechanisms of pathological states, is closely connected with the development of prevention and correction of structural and metabolic abnormalities that occur in long-term effects on the sub-toxic chemicals [8]. Particularly relevant for the task is new and completely unstudied chemical compounds capable of not only the direct toxic effect on the body, but also of shaping the development of possible long-term effects of mutagenesis, carcinogenesis, atherogenesis, immune deficiency, teratogenesis, etc. In this regard, study of pathophysio-logical mechanisms of action on the organism of small subtoxic doses of xenobiotics is the first priority in making a forecast of the potential dangers of new chemical compounds, which are at the stage of pilot production and implementation of the national economy. This fully applies to the new chemical compound industry polyoxy-
- oxigindolacides acid (5-OIAA), animal indican, liver,
propylene - oligoethercyclocarbonat, which is widely used in various industries for epoxy resins, lacquers, enamels, plastics, foams, thermoplastics, etc. [4, 8, 9]. Given the above, the purpose of the work was to study the effect of sub-toxic doses oligoethercyclocarbonat, in long-term uptake, the exchange of essential amino acid L-tryptophan in subacute experience.
Materials and methods
The research program included a subacute toxicology experiment on mature white Wistar rats weighing 180200 g in accordance with the conditions of the experiment the animals daily for 45 days in the morning before feeding with a metal probe exposed to aqueous solutions of oral priming oligoethercyclocarbonat type P-803 based 1/10; To 1/100 and 1/1000 of LD50. The control group received the appropriate volume of drinking water. On the basis of acute toxicity parameters P-803 refers to a low-toxic compounds (Hazard Class 4), non-cumulative properties and species sensitivity. Of the mean dose (LD50) to albino rats was set at 18,75 g/kg of animal weight and cumulation coefficient (CC) at the level of 7,82. Selecting this xenobiotic for research was justified lack of prognostic characteristics of the potential hazard to warmblooded animals and humans, large volumes of production, wide track undelivered xenobiotic population and the need to justify the hygienic standards as maximum allowable concentrations in the environment. Conducting subacute experience accompanied by the observance of
* To cite this English version: Bagmut I.Yu.. State exchange l-tryptophan of the subacute experiment under infuense oligoethercyclocarbonat in the subtoxic doses / / Problemy ekologii ta medytsyny. - 2014. - Vol 18, № 1-2. - P. 53 -55.
Том. 18, N 1-2 2014 р.
