Состояние кишечной микробиоты и сенсибилизация к белкам коровьего молока как триггеры функциональных расстройств желудочно-кишечного тракта у детей первого полугодия жизни Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

СОСТОЯНИЕ КИШЕЧНОЙ МИКРОБИОТЫ И СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ К БЕЛКАМ КОРОВЬЕГО МОЛОКА КАК ТРИГГЕРЫ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ РАССТРОЙСТВ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ПОЛУГОДИЯ ЖИЗНИ

Корниенко Е. А.1, Козырева Л. С.1, Нетребенко О. К.2

1 ГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет Минздрава России

2 ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России

THE INTESTINAL MICROBIOTA AND SENSITIZATION TO COW'S MILK PROTEIN AS TRIGGERS OF FUNCTIONAL DISORDERS OF THE GASTROINTESTINAL TRACT IN CHILDREN IN THE FIRST SIX MONTHS OF LIFE

Kornienko E. A.1, Kozyreva L. S1, Netrebenko O. K.2

1 Saint-Petersburg state pediatric medical University of Ministry of healthcare of Russia

2 Russian national research medical University n.a. N.I. Pirogov

Корниенко Елена Александровна — д.м.н., профессор, заведующая кафедрой гастроэнтерологии Факультета послевузовского и дополнительного профессионального образования (ФП и ДПО)

Козырева Людмила Сергеевна — ординатор кафедры гастроэнтерологии Факультета послевузовского и дополнительного профессионального образования (ФП и ДПО)

Нетребенко Ольга Константиновна -профессор кафедры госпитальной педиатрии им. академика В.А. Таболина педиатрического факультета

Резюме

Функциональные расстройства (ФР) ЖКТ — частая проблема у детей первых месяцев жизни, механизм их окончательно не ясен, обсуждается важная роль кишечной микробиоты и воспаления.

Целью данной работы была комплексная оценка состояния кишечной микробиоты и сенсибилизации к белкам коровьего молока у здоровых детей первого полугодия жизни в зависимости от вида вскармливания.

Материал и методы: 80 практически здоровых детей: 20 на грудном вскармливании (КГ), 60 на искусственном (30 получали смесь «Нестожен с пробиотиками» — ОГ, 30 смесь без про- и пребиотиков — ГС) включались в исследование в возрасте 2-3 мес. и наблюдались в течение 3 мес. Исходно и через 3 мес. исследованы уровни кальпротек-тина, КЦЖК в кале, IgE и IgG4 к БКМ в копрофильтратах и посев кала на дисбактериоз.

Результаты: Уровень КЦЖК не коррелировал с данными микробиологического исследования кала. Динамика КЦЖК в двух группах была сходной, но уровень всех КЦЖК был выше в группе, получавших смеси с пробиотиками (9,12+1,56 мг/г), достоверно превышая группу без пробиотиков (4,2±0,57 мг/г). Около 70% детей на искусственном вскармливании было сенсибилизировано к БКМ, к 7 мес. уровень IgE достоверно снижался. Средний уровень каль-протектина снижался во всех группах и не имел достоверных отличий, но сопоставление показателей у каждого больного обнаружило сильную связь между высоким уровнем кальпротектина и высоким уровнем IgE, а также слишком высоким (выше 9 мг/г) или слишком низким (ниже 2,9 мг/г) уровнем КЦЖК.

Заключение: исследование подтвердило роль функционального состояния кишечной микробиоты и сенсибилизации к БКМ в развитии кишечного воспаления. Смесь «Нестожен с пробиотиками» оказывает профилактическое воздействие за счет формирования более зрелого микробиоценоза, противовоспалительного эффекта и нормализации кишечных функций.

Ключевые слова: функциональные расстройства ЖКТ, короткоцепочечные жирные кислоты, сенсибилизация к белку коровьего молока, кальпротектин, пробиотики.

Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2016; 136 (12): 22-31

Summary

Functional disorders (FD) of the gastrointestinal tract — a common problem in children during the first months of life, the mechanism is not completely clear, discussed the important role of the intestinal microbiota and inflammation.

The aim of this work was a comprehensive assessment of the intestinal microbiota and sensitization to cow's milk protein in healthy children of first six months of life, depending on the type of feeding.

Корниенко

Елена Александровна

Kornienko Elena A. elenkornienk@yandex.ru

Material and methods: 80 healthy children: 20 breast-fed, 60 (30 received mixture "Nestozen with probiotics", 30 mix without Pro — and prebiotics -) were included in the study at age 2-3 months. was observed within 3 months. At baseline and after 3 months. studied the levels of calprotectin, short-chain fatty acids in feces, IgE and IgG4 to cow's milk protein in coprofi ltrates and sowing of a feces on a dysbacteriosis

Results: the short-chain fatty acids Level did not correlate with the data of microbiological studies of feces. Dynamics of short-chain fatty acids in the two groups were similar, but the level of all short-chain fatty acids was higher in the group receiving the mixture of probiotics (9,12+1,56 mg/g), significantly higher than the group without probiotics (4,2±0.57 mg/g). About 70% of children bottle-fed were sensitized to cow's milk protein, for 7 months. the level of IgE was significantly reduced. The average level of calprotectin was reduced in all groups and had significant differences, but a comparison of every patient found a strong relationship between high calprotectin level and high IgE levels and also too high (above 9 mg/g) or too low (less than 2.9 mg/g) level of short-chain fatty acids

Conclusion: the study confirmed the role of the functional state of the intestinal microbiota and sensitization to cow's milk protein in the development of intestinal inflammation. A mixture of "Nestozen with probiotics" have a preventive effect due to the formation of a more Mature microbiota, anti-inflammatory effect and normalization of intestinal functions.

Key words: functional gastrointestinal disorders, short-chain fatty acids, sensitization to cow's milk protein, calprotectin, probiotics

Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2016; 136 (12): 22-31

Функциональные расстройства (ФР) желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) — одна из наиболее частых проблем у детей раннего возраста. По данным мета-анализа, проведенного Y. Vandenplas с соавт. в 2015 [1], средняя распространенность младенческих срыгиваний у детей первых месяцев жизни составляет 26%, младенческих кишечных колик 21%, у 15% детей наблюдаются функциональные запоры. В структуре ФР ЖКТ, согласно полученным нами данным, доминируют младенческие срыгивания и младенческие кишечные колики, причем более чем у 70% детей они сочетаются друг с другом [2].

Патофизиологические механизмы развития ФР ЖКТ в настоящее время остаются предметом дискуссии. Основными причинами возникновения их в раннем возрасте считаются морфологическая и функциональная незрелость органов пищеварения, несовершенство центральной и вегетативной регуляции, а также особенности становления микробиоты кишечника [3].

Процесс естественной микробной колонизации кишечника новорожденного оказывает стимулирующее воздействие как на морфологическое созревание кишечного эпителия, так и на регуляцию иммунной системы. Под влиянием микробов и продуктов их метаболизма происходит активация мембранных Toll-like и клеточных Nod-like рецепторов, дендритных клеток, образование цитокинов и секреторного IgA. На этом фоне снижается проницаемость эпителия, укрепляется защитный барьер кишечника, что уменьшает проникновение чужеродных белков и риск сенсибилизации к ним [4]. Микробиоте кишечника принадлежит ведущая роль в формировании иммунологической толерантности, обусловленная переключением адаптивного иммунного ответа и направленной дифференци-ровкой Т-лимфоцитов с преимущественным образованием T-регуляторных клеток и выработкой IL-10. Этот механизм обеспечивает устойчивость

ребенка к аллергии и избыточной воспалительной реакции в дальнейшем.

Первоначально микробное заселение кишечника и иммунная активация сопровождаются некоторыми признаками воспаления в слизистой оболочке кишечника (СОК). Это слабое воспаление отражает процесс естественной адаптации и может быть признано «физиологическим». Одним из возможных маркеров воспаления в кишечнике может служить уровень кальпротектина в кале. Кальпротектин — воспалительный белок, который отражает степень гранулоцитарной инфильтрации слизистой оболочки, свойственной воспалению. Исследование кальпротектина в кале детей первых месяцев жизни с младенческими кишечными коликами и без них, проведенное J.H. Roads с соавт. [5], показало, что он повышен у всех детей (у здоровых новорожденных 197±46 мг/г при норме у взрослых — до 50 мг/г), что косвенно подтверждает наличие слабой степени воспаления СОК в этом возрасте. Однако у детей с коликами уровень кальпротектина оказался выше, чем в контрольной группе, более чем в 2 раза (413±71 мкг/г, p=0,042). Нами были получены аналогичные данные у детей с ФР в сравнении со здоровыми [2]. С помощью ПЦР в реальном времени нами было показано более частое присутствие условно-патогенных микробов с высоким воспалительным потенциалом: Cl.difficile, Klebsiella spp., у детей с ФР. На основании полученных данных был сделан вывод о важном значении альтерации кишечной микробиоты и связанным с ней воспалением в генезе ФР. То есть, в сложном процессе становления индивидуальной кишечной микробиоты возможны отклонения, сопровождающиеся развитием более выраженного воспаления, которое может оказывать влияние в том числе и на моторную функцию кишечника, объясняя появление запоров, срыгиваний или колик. Кроме того, при воспалении повышается проницаемость кишечного барьера, следствием чего может быть проникновение сквозь

него недорасщепленных пищевых белков и, что особенно важно, дисбиоз и связанное с ним воспаление могут нарушать процесс формирования иммунологической толерантности с риском развития пищевой аллергии.

Клинические проявления пищевой аллергии (ПА) могут быть очень сходны с симптомами ФР: те же срыгивания, колики, запоры или диарея. Далеко не всегда ПА сопровождается кожными симптомами, в раннем возрасте не редки изолированные гастроинтестинальные ее формы: аллергический проктоколит, аллергическая энтеропатия и аллергический энтероколит [6]. Дифференциальный диагноз гастроинтестинальных проявлений ПА и ФР ЖКТ может представлять большие сложности. Как правило, ПА характеризуется более выраженным упорством и тяжестью проявлений, сопровождается анемизацией, тромбоцитозом, экссудативной энтеропатией, появлением крови в стуле. То есть, при ней отсутствует главный критерий ФР — наличие периодически повторяющихся симптомов у здорового во всех других отношениях и нормально развивающегося ребенка, а также не происходит естественного ослабления и исчезновения симптоматики с возрастом. Тем не менее, патогенетическая общность ФР и ПА и их очевидная связь с кишечной микробиотой требуют изучения основополагающих микробиологических и иммунологических процессов на самых ранних стадиях их становления для комплексной оценки

факторов риска как формирования пищевой аллергии, так и симптомов ФР ЖКТ.

Как известно, отсутствие грудного молока у матери, ранний перевод ребенка на искусственное вскармливание является важным фактором риска развития как ФР, так и ПА. Появление в последние годы новых смесей, содержащих пробиотики и (или) пребиотики, открывает новые горизонты, поскольку они могут оказывать влияние на процесс становления кишечной микробиоты ребенка. По данным ряда авторов, Ь.геШеп в составе детской молочной смеси эффективны в профилактике ФР ЖКТ [7]. Наше собственное исследование подтвердило эффективность Ь.теы1ет1 как в каплях, так и в составе смеси, у детей с уже имеющимися ФР, что проявлялось достоверным улучшением клинической симптоматики, снижением уровня фекального кальпротектина и улучшением микробиологических показателей, по данным ПЦР в реальном времени [2]. Возможно, применение стратегии превентивного раннего назначения про-и пребиотиков может быть эффективной мерой профилактики не только ФР ЖКТ, но и пищевой аллергии у детей, находящихся на искусственном вскармливании.

Целью данной работы была комплексная оценка состояния кишечной микробиоты и сенсибилизации к белкам коровьего молока у клинически здоровых детей первого полугодия жизни в зависимости от вида вскармливания.

Материал и методы

Под нашим наблюдением находились 80 практически здоровых детей в возрасте от 1 до 6 мес. Дети включались в исследование в возрасте 2-3 мес. и наблюдались в течение 3 мес. Критериями включения в исследование были отсутствие острых и хронических заболеваний и каких-либо явных проявлений аллергии. Критериями исключения были недоношенность и наличие признаков какой-либо острой или хронической патологии, в том числе аллергической.

Все пациенты были разделены на 3 группы в зависимости от вида вскармливания: в контрольную группу (КГ) вошли 20 практически здоровых детей на грудном вскармливании. Остальные 60 детей, находящихся на искусственном вскармливании в связи с отсутствием грудного молока у матери, были рандомизированы методом случайной выборки в 2 равные группы по 30 человек. Дети первой, основной, группы (ОГ) получали адаптированную смесь на основе цельного белка коровьего молока, в состав которой входят пребиотики: галак-тоолигосахариды и фруктоолигосахариды (ГОС/ ФОС) в соотношении 10:1 в количестве 0,4г/100мл и пробиотик Ь.теы1еп 106КОЕ/100 мл («Нестожен 1 с пробиотиками»), дети второй группы, сравнения (ГС) вскармливались адаптированной молочной смесью на основе цельного белка коровьего молока, которая не содержит про-и пребиотиков. Средний возраст на момент включения в исследование составил 2,9 ± 0,5 мес. в ОГ; 2,3 ± 0,41 мес. в ГС; 2,5 ± 0,51 мес. в КГ (р>0,05), то есть, не имел значимых

отличий. Дети 1 и 2 групп получали смеси в полном суточном объеме в течение 3 мес., после чего было проведено контрольное обследование. Дети КГ находились на исключительно грудном вскармливании, исследование повторили через 3 мес. Прикормы в ходе исследования дети не получали.

В течение 3 мес. ежедневно матери детей вели дневник с отметкой любых патологических симптомов (срыгиваний, беспокойства, плача, кожных реакций и т.д.), частоты и характера стула. Ежемесячно проводился врачебный осмотр ребенка и оценка физического развития.

Лабораторное исследование проводилось дважды: в начале и через 3 месяца, оно включало:

1. Бактериологическое исследование фекальной микробиоты (посев кала на дисбактериоз) в соответствии с требованиями Приказа МЗ РФ от 09.06.2003г № 231 (отраслевой стандарт).

2. Исследование уровня короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) в кале с помощью газо-жид-костной хроматографии, проводилось на кафедре гастроэнтерологии ФГУ «УФМЦ Управления делами Президента РФ» совместно с д.м.н. проф. М.Д. Ардатской.

3. Исследование кальпротектина в кале методом ИФА с использованием экспресс анализатора QuantumBlue (Швейцария).

4. Исследование уровня IgE и IgG4 к белкам коровьего молока (БКМ). Для количественного определения аллергенспецифических IgE антител к молочным белкам в копрофильтратах

Группа ОГ (П: =30) ГС (n =30) КГ (n: =20)

Признак Исх Чз 3м Исх Чз 3 м Исх Чз 3 м

Редкие 36,7% 20% 53,3% 46,7% 75% 50%

Срыгивания 3-4 раза в день 33,3% 0 26,7% 0 25% 0

Колики Редкие 33,3% 23,3% 40% 36,7% 70% 20%

3 раза в нед 30% 0 33,3% 0 0 0

Запоры 0 0 0 13,3% 0 0

Таблица 1.

Динамика частоты диспепсических расстройств в сравниваемых группах

использовался неконкурентный иммунофер-ментный анализ с применением специальных тест-систем фирмы АПегдорЬагша (Германия), исследование проводилось в лаборатории биохимии, иммунологии и аллергологии Клиники НИИ Питания РАМН (зав.лабораторией д.м.н.проф. Т.Б. Сенцова).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием компьютерных

программ «Statistica7 for Windows». Производился расчет средних значений признака (М), стандартных ошибок среднего признака (m). Для качественной оценки частоты и вероятности признака в группах рассчитывали Хи-квадрат, отношение шансов (ОШ), для оценки достоверности отличий использовали критерий Фишера. Различия считались достоверными при p<0,05. Для оценки корреляции использовали коэффициент Пирсона.

Результаты Клинические симптомы

На момент включения в исследование все дети ОГ были здоровы, тем не менее, у 11 из них отмечались редкие срыгивания (36,7%), а у 10 (33,3%) срыгива-ния бывали до 3-4 раз в день, то есть были пограничными по частоте для соответствия критериям ФР. Колики отсутствовали у большинства детей (11 чел., 36,7%), у 10 (33,3%) были редкими и у 9 (30%) — 3 раза в неделю, но реже 3 раз в день. На фоне приема смеси «Нестожен с пробиотиками» в целом наблюдалось уменьшение диспепсических симптомов. Через 3 мес. лишь у 6 детей (20%) наблюдались редкие срыгивания, у 7 (23,3%) — редкие кишечные колики, но никто из детей не развил симптоматику, соответствующую критериям функциональных расстройств (таблица 1). Следует отметить, однако, что у двоих из 30 детей этой группы в первые дни приема смеси возникли острые симптомы непереносимости: рвота и диарея, что стало причиной отмены смеси и перевода детей на смесь, содержащую высоко гидролизованный белок, на фоне чего у всех детей диспепсические симптомы прошли, что косвенно подтвердило их вероятную связь с белком коровьего молока. У остальных 28

детей переносимость смеси была хорошая, весовые прибавки в течение 3 мес. соответствовали норме. Ни у кого из детей не наблюдалось кожных симптомов аллергии. Средняя частота стула до начала приема смеси «Нестожен с пробиотиками» составила 2,8±0,6 раз в день, через 3 мес. — 3,2 ±0,4 раз в день, стул имел мягкую пастообразную консистенцию, что соответствовало характеру и частоте стула у детей КГ (рис.1).

В ГС на момент включения в исследование редкие срыгивания наблюдались у 16 (53,3%), 3-4 раза в день — у 8 (26,7%); колики до 3 раз в неделю — у 10 (33,3%), редкие — у 12 (40%). Через 3 месяца редкие срыгивания сохранялись у 14 детей (46,7%), редкие колики у 11 (36,7%). Один ребенок из этой группы был исключен из дальнейшего наблюдения в связи с появлением симптомов непереносимости (рвоты и диареи) и переведен на высоко гидролизованную смесь, также с положительной динамикой. Кожных проявлений аллергии не отмечено ни у одного из детей, весовые прибавки соответствовали возрасту. Средняя частота стула у детей ГС на момент включения в исследование составила 2,8 ± 0,5 раз

Рисунок 2.

Динамика фекального кальпротектина у детей сравниваемых групп: ОГ — основная группа, ГС — группа сравнения, КГ — контрольная группа.

250

200

150

100

50

исх

чз 3 мес

ОГ

ГС

КГ

0

Рисунок 3.

Средний уровень суммарных КЦЖК в кале (мг/г) в зависимости от уровня кальпротектина

14

12

10

Рисунок 4.

Средний уровень соотношения изо^/Cn в зависимости от уровня кальпротектина

0,5

0,7

0,6

в день, то есть, соответствовала таковой в основной группе, но через 3 мес. у половины детей (15 человек) стул стал плотным, у 26 (86,7%) 1 раз в сутки, у 4 (13,3%) — 1 раз в 2 дня, то есть появилась наклонность к запорам. Средняя частота стула составила 0,9±0,3 раз в сутки, что было достоверно ниже, чем в основной и контрольной группах (рис.1).

У детей КГ на грудном вскармливании на момент включения в исследование также отмечались редкие срыгивания в 75% (15 детей), 3-4 раза

в день — у 5 (25%) детей. Колики частотой менее 3 раз в неделю наблюдались у 14 (70%) детей. Через 3 мес. срыгивания полностью отсутствовали у половины (50%), но изредка отмечались у 10 детей (50%). Колики сохранились у 4 детей (20%) через 3 мес. Кожных проявлений аллергии не наблюдалось. Средняя частота стула до начала исследования составила 4,5±0,6 раз в сутки, через 3 мес. — 3,1±0,5 раз в сутки (рис.1). Стул у большинства имел кашицеобразную консистенцию.

Микробиологические особенности фекал

Изучение динамики кишечной микробиоты, по данным посева кала (таблица 2) показало, что уровень бифидобактерий не имел достоверных отличий у детей всех трех групп ни в начале, ни в конце исследования, хотя отмечена некоторая тенденция к увеличению бифидобактерий во всех группах в динамике в среднем на 0,3 log 10 KOE/г. Количество лактобацилл имело тенденцию к снижению в ГС и практически не изменилось в ОГ и КГ. У детей на грудном вскармливании изначально был достоверно более низким уровень условно-патогенных энтеробактерий (2,6 log 10 KOE/г), при этом наблюдалось его дальнейшее снижение в течение 3

ьной микробиоты

мес. (2,0 log 10 KOE/г), достоверно ниже был также уровень энтерококков (5,7 log 10 KOE/г), который продолжал снижаться через 3 мес. (5,0 log 10 KOE/г), несколько более высоким был исходный уровень St.aureus (2,0 log 10 KOE/г). У детей ОГ отмечено более высокое содержание типичных E.coli (8,2 log 10 KOE/г), в группе сравнения — более высокое содержание условно-патогенных энтеробактерий (6,1 log 10 KOE/г), нарастание лактозонегативных E.coli (3,8 log 10 KOE/г) и грибов рода Candida (3,1 log 10 KOE/г). Уровень условно-патогенных энтеробактерий превышал 4 log 10 KOE/г у 73,3% детей ОГ и 46,7% ГС, при этом лишь у 25% КГ.

Уровень короткоцепочечных жирных кислот в кале

Исследование уровня КЦЖК в кале детей (таблица 3) показало, что у детей на грудном вскармливании (КГ) исходный уровень ацетата (С2) был достоверно выше, чем у детей на искусственном вскармливании (р<0,05), при этом уровень пропионата (С3) и бутирата (С4) был достаточно низок (0,32±0,12; 0,126±0,035 мг/г). Через 3 мес. во всех группах наблюдалось повышение уровня КЦЖК в целом (ЕС2-С6), в первую очередь, ацетата (С2), но степень прироста была разной. Самый высокий прирост отмечен в ОГ, где уровень С2 через 3 мес. составил 7,06±1,25, что высоко достоверно отличалось от исходного значения (р<0,01). Уровень ацетата в ОГ был достоверно выше (р<0,05) показателя КГ (5,35±1,34) и, особенно — ГС (3,37±0,56). Если принять во внимание, что нормальные значения С2 у взрослых, по данным М.Д. Ардатской [8] составляют 5,88±1,22 мг/г, а у детей первого полугодия жизни — 3,23 мг/г на грудном и 3,023 мг/г на искусственном вскармливании, то полученные нами данные свидетельствуют о более высоких значениях, в том числе, у здоровых детей на грудном вскармливании, которые приближаются к показателям взрослых.

Уровень пропионата (С3), как исходно, так и через 3 мес., также был выше рекомендуемых нормативов для раннего возраста (0,264 мг/г на грудном и 0,564 мг/г на искусственном вскармливании). У детей КГ он исходно составил 0,32±0,12 мг/г, через 3 мес. — 0,585 мг/г, а в ОГ — исходно 0,7±0,05 мг/г, а через 3 мес. — 1,47±0,325 мг/г, что было достоверно выше показателей других групп (р<0,05), приближаясь к нормативам взрослых (1,79±0,015).

Почти не отмечено прироста в ГС: исходно С3 был 0,4±0,097 мг/г, через 3 мес — 0,45±0,082 мг/г.

Уровень бутирата (С4) у детей КГ исходно соответствовал рекомендуемым нормативам (0,126±0,035 при норме 0,121 мг/г), но через 3 мес. он существенно возрос и составил 0,214±0,065 мг/г. У детей ОГ исходный уровень С4 был достоверно выше — 0,38±0,095 мг/г (р<0,05), продолжая незначительно повышаться (0,458±0,107 мг/г). Исходный уровень С4 в ГС не имел достоверных отличий от ОГ (0,304±0,179 мг/г), но в дальнейшем не увеличился, а несколько снизился (0,22±0,053 мг/г).

Абсолютное суммарное количество изокис-лот (изоСпЕ) у детей на грудном вскармливании (0,09±0,039 мг/г) было выше нормативных показателей (0,048 мг/г) и увеличилось за 3 мес. (0,143 мг/г), такая же тенденция отмечена в ГС (0,09±0,023 мг исходно и 0,18±0.084 мг/г через 3 мес.), но у детей ОГ уровень изокислот снизился с 0,4±0,125 мг/г до 0,1±0,037 мг/г).

Анаэробный индекс увеличился у детей КГ (с -0,20±0,046 до -0,29±0,067) и в ОГ (с -0,165±0,04 до -0,29±0,024), в то же время в ГС он снизился с -0,42±0,07 до -0,26±0,06).

Таким образом, динамика КЦЖК у детей ОГ имела направленность, сходную с КГ и отличающуюся в некоторых аспектах от ГС, но уровень всех КЦЖК был выше в ОГ, превышая нормативы детей первых месяцев жизни и приближаясь к показателям детей более старшего возраста и взрослых.

Сопоставление уровня КЦЖК и микробиологических особенностей кишечного биоценоза, по данным посева кала, не выявили никакой корреляции ни в одной из групп.

Уровень специфических IgE и IgG4 к белкам коровьего молока (БКМ) в копрофильтратах

Исследование уровня специфических IgE и IgG4 к БКМ в копрофильтратах показало их повышение у большинства детей. В начале исследования IgE был повышен у 73,3% детей ОГ, 68% ГС и 60% КГ, через 3 мес. уровень IgE у детей на искусственном вскармливании снизился, но оставался повышенным у 66,67% ОГ и 56,25% ГС (таблица 4). Средний уровень IgE к БКМ составил при включении в исследование у детей ОГ 1,926±0,63 МЕ/мл (при норме менее 0,35 МЕ/мл), что соответствует умеренной степени (2 ст), через 3 мес. — 1,342±0,28 МЕ/мл. В ГС исходный уровень был ниже 1,02±0,29

МЕ/мл, через 3 мес. — 0,84±0,27 МЕ/мл. Разница не достоверна (р>0,05). То есть, в обеих группах отмечалось снижение уровня специфических 1дЕ с возрастом. Дальнейшее наблюдение за 51 ребенком обеих групп в течение еще 6 мес. (до 1г) продемонстрировало продолжение снижения уровня аллергенспецифических 1дЕ, который достигал нормальных значений в среднем к возрасту 7,17±0,043 мес. (таблица 5). Эта динамика, вероятно, отражает процесс формирования иммунологической толерантности к БКМ. Более высоким средний уровень 1дЕ стал через 3 мес.(таблица 4) у детей КГ

Таблица 2.

Динамика изменений состава фекальной микробиоты, по данным посева, у детей сравниваемых групп (log 10 КОЕ/г)

Жирным шрифтом отмечены достоверные изменения

(p<0,05)

Микроорганизмы ОГ (n=30) ГС (n=30) КГ (n=20)

исх Чз 3 м Исх Чз 3 м Исх Чз 3 мес

Бифидобактерии 10,2 10,5 10,5 10,7 10,2 10,5

Лактобациллы 6,4 6,2 6,1 5,7 6,1 6,2

Клостридии 2,1 2,3 2,6 2,6 3,7 2,7

Энтерококки 6,8 6,8 6,8 7,0 5,7 5,3

E.coli типичн. 8,1 8,2 5,9 6,9 5,8 6,2

E.coli лактозонег. 1,8 2,9 3,1 3,8 3,3 2,3

УП энтеробактерии 4,2 4,2 6,1 4,3 2,6 2,0

Staph.aureus 0,7 1,5 1,6 1,9 2,0 1,8

Candida

3,0

2,3

2,2

3,1

1,9

1,6

Таблица 3.

Уровень КЦЖК в кале детей сравниваемых групп в динамике (мг/г)

Жирным шрифтом отмечены достоверные изменения

(р<0,05)

Показатели ОГ (n =30) ГС (n: =30) КГ (n =20)

Исходн Через 3 мес Исходн Через 3 мес Исходн Через 3 мес

С2 2,5±0,75 7,06±1,25 1,6±0,29 3,37±0,56 4,5±1,35 5,35±1,34

С3 0,7±0,05 1,47±0,325 0,4±0,097 0,45±0,082 0,32±0,12 0,585±0,087

С4 0,38±0,095 0,458±0,107 0,304±0,179 0,22±0,053 0,126±0,035 0,214±0,065

ИзоСпЕ 0,4±0,125 0,1±0,037 0,09±0,023 0,18±0,084 0,09±0,039 0,143±0,034

£ С2-С6 4,27±0,96 9,12±1,56 2,37±0,5 4,2±0,575 6,04±0,94 6,9±0,67

Анаэробный -0,165±0,04 -0,29±0,024 -0,42±0,07 -0,26±0,06 -0,20±0,046 -0,29±0,067

индекс

Таблица 4. Показатели ОГ ГС КГ

Динамика IgE и IgG4 к БКМ Исх Через 3 мес Исх Через 3 мес Исх Через 3 мес

и к казеину в кале детей на искусственном вскармливании IgE к БКМ 1,926± 0,63 1,342±0,28 0,98±0,29 0,84±0,27 1,151±0,47 3,32±0,96

IgE к казеину 2,29±0,73 1,41±0,33 0,66±0,18 0,64±0,29 1,437±0,79 2,043±0,6

IgG4 к БКМ 173,15±19,63 113,44±11,6 194,28±23,04 195,9±24,93 80,54±15,2 62,8±6,3

Таблица 5.

Динамика аллергенспеци-фических ^Е к молочным белкам у детей первого года жизни на искусственном вскармливании (МЕ/мл) Жирным шрифтом отмечены достоверные изменения по сравнению с исходным уровнем (р<0,05)

Таблица 6.

Динамика специфических IgG4 к молочным белкам у детей первого года жизни на искусственном вскармливании (и/мл). Жирным шрифтом отмечены достоверные изменения по сравнению с исходным уровнем (р<0,05)

Таблица 7.

Соответствие высокого уровня кальпротектина и уровня ^Е к БКМ

n=51 Возраст, мес БКМ Казеин ß-лактоглобулин а-лактоальбумин Козье молоко

2,5±1,02 1,02±1,18 0,47±0,4 0,48±0,43 0,47±0,39 0,79±1,16

4,9±0,48 0,84±0,8 0,6±0,51 0,63±0,77 0,75±1,33 0,58±0,82

6,15±0,39 0,4±0,48 0,27±0,38 0,33±0,42 0,32±0,73 0,33±0,47

7,2±0,43 0,27±0,49 0,17±0,15 0,21±0,18 0,13±0,16 0,16±0,16

n=51 Возраст, мес БКМ Казеин ß-лактоглобулин а-лактоальбумин Козье молоко

2,9±1,1 198,7±83,9 200,0±100,6 179,3±66,4 195,8±90,6 190,2±50,4

5,1±0,39 247,9±126,5 167,25±59,26 171,9±78,13 213,3±78,6 246,76±99,9

6,15±0,4 173,84±102,63 101,13±41,8 108,76±65,03 105,74±65,9 153,45±104,9

7,2±0,4 126,9±36,6 95,0±38,97 104,6±52,12 93,67±40,72 117,4±75,5

Показатели Исходные Через 3 мес.

Кальпротектин, мг/г 317,2 ± 68,8 526,8 ± 97,0

IgE к БКМ, МЕ/мл 3,0±1,3 4,4±1,4

(3,32±0,96 МЕ/мл, р>0,05), что объясняется значительным повышением его у 4 детей на грудном вскармливании. Матери этих детей употребляли много молока, у детей сохранялись срыгивания, кашицеобразный стул со слизью.

Уровень IgG4 к БКМ был повышен у 33,3% детей КГ, 63,3% детей ОГ и 87,5% детей ГС, через 3 мес. он

оставался положительным у 40% детей ОГ, 81,25% детей ГС и лишь у 1 ребенка КГ. Доминировала слабая степень повышения IgG4. Средний уровень IgG4 изначально составил в КГ 80,54±15,2 и/ мл, в ОГ 173,15±19,6 и/мл, в ГС — 194,28±23,04 и/ мл (при норме менее 100 и/мл). Через 3 мес. уровень IgG4 в ОГ снизился почти до нормы в ОГ

(113,44±11,6 U/мл), но оставался на прежнем уровне в ГС (195,9±24,93 U/мл). Дальнейшее наблюдение в течение 6 мес. показало снижение IgG4, уровень которого нормализовался у большинства детей после 6 мес. (таблица 6).

Сопоставление уровня специфических IgE и IgG4 к различным белкам коровьего молока продемонстрировало почти равную частоту сенсибилизации

Уровень кальпротектина в кале

Уровень кальпротектина в кале детей всех трех групп незначительно отличался: в ОГ он составил 197,0±32,8 мг/г, в ГС — 212,2±30,8 мг/г, в КГ — 191,4±46,2 мг/г (p>0,05). Через 3 мес. кальпротектин снизился во всех группах, но в КГ он был самым низким — 124,0±62,3 мг/г, хотя у 4 детей КГ наблюдалось его повышение. Это были дети, у которых отмечено значительное нарастание IgE к БКМ. В ОГ через 3 мес. средний уровень кальпротектина составил 155,9±35,9 мг/г, в ГС — 183,6±41,2 мг/г (рис.2), однако различия были не достоверны (p>0,05).

Сопоставление результатов исследования уровня кальпротектина с уровнем IgG4 не выявило корреляции между ними, но у детей с наиболее высоким уровнем кальпротектина (выше 300 мг/г) обнаружен высокий уровень специфических IgE к БКМ, причем в динамике оба показателя даже нарастали (таблица 7). У 3 детей, которые имели симптомы острой непереносимости смесей, были выявлены высокие уровни кальпротектина (700800 мг/г) и высокие уровни IgE к БКМ (3,5-7,5 МЕ/ мл), что, в совокупности с положительным эффектом от перевода на высоко гидролизованную смесь, позволило расценить появившиеся у них диспепсические симптомы как проявления аллергии к БКМ.

Повышение уровня кальпротектина коррелировало у большинства детей с повышением уровня IgE к БКМ. Установлена сильная связь между этими показателями — коэффициент Пирсона (С)

к казеину, р-лактоглобулину и а-лактоальбумину (таблицы 5 и 6). Установлена перекрестная сенсибилизация и к белкам козьего молока.

При сопоставлении показателей у каждого ребенка, корреляции между уровнем специфических ^Е и IgG4 к БКМ не выявлено, что свидетельствует о разных иммунологических механизмах ответа.

составил 0,667. Отношение шансов этих показателей (OR) составило 4,7 (ДИ = 1,99-60,57; s=0,87). Критерий Хи-квадрат = 8,57 (p<0,01), с поправкой Йейтса — 6,563 (p<0,05). Точный критерий Фишера при этом составил 0,00922 (p<0,05).

Обнаружена корреляция между высоким уровнем кальпротектина и повышением уровня КЦЖК и соотношения изоСп/Сп. У детей с симптомами острого аллергического энтероколита уровень суммарных КЦЖК превышал 11,0 мг/г.

Риск повышения кальпротектина при значительном повышении КЦЖК, особенно С2, (выше 9) был достоверно повышен, Хи-квадрат = 8,824 (p<0,01), с поправкой Йейтса — 6,455 (p<0,05). Точный критерий Фишера при этом составил 0,00828 (p<0,05). Установлена сильная связь между этими показателями — коэффициент Пирсона (С) составил 0,757.

Риск повышения кальпротектина обнаружен также при слишком низком уровне КЦЖК (менее 2,9 мг/г): Хи-квадрат = 6,343 (p<0,05), с поправкой Йейтса — 4,237 (p<0,05). Точный критерий Фишера при этом составил 0,02301 (p<0,05). Установлена средняя связь между этими показателями — коэффициент Пирсона (С) составил 0,543.

Корреляции между уровнем кальпротектина и микробиологическими особенностями фекальной микробиоты, по данным посева кала, не выявлено.

Обсуждение

Проведенное нами исследование, целью которого было установление факторов риска и механизмов развития симптомов ФР ЖКТ, а также способов их профилактики, подтвердило правильность существующей «воспалительной» гипотезы. Мы еще раз подтвердили повышение уровня фекального каль-протектина, являющегося показателем воспаления в кишечнике, у всех детей первых месяцев жизни с последующим его снижением. Нами не установлено корреляции уровня кальпротектина с обнаружением того или иного микроба в микробиологическом спектре, доступном при проведении стандартного бактериологического исследования кала. Это объясняется, вероятно, ограниченными возможностями культурального метода. Гораздо большее значение имеет функциональное состояние микробиоты, о котором можно судить по уровню активных микробных метаболитов. Важнейшими продуктами бактериального метаболизма являются КЦЖК, прежде всего уксусная (С2), про-пионовая (С3) и масляная (С4), которые образуются у детей на грудном вскармливании в результате

микробного гидролиза галактоолигосахаридов женского молока. Галакто- и фруктоолигосаха-риды молочной смеси также метаболизируются кишечными бактериями с образованием КЦЖК. Концентрация КЦЖК у взрослого человека в норме составляет 70-140 ммоль/л в проксимальных отделах толстой кишки и 20-70 ммоль/л — в дис-тальных. Среднее содержание в кале у здоровых взрослых равно С2: С3: С4 = 5,88:1,8:1,75 мг/г [8]. Ацетат является основным метаболитом гетеро-ферментативного брожения, свойственного бифи-добактериям, и обнаруживается в стуле здоровых детей с первых дней жизни. Он выполняет важные энергетические задачи, всасываясь в кровь и попадая в клетки различных органов и тканей, обеспечивая от 5 до 15% общего калоража. Пропионат и бутират продуцируются строгими анаэробами, которые появляются в кишечнике ребенка позднее, поэтому в первые месяцы жизни их концентрация в кале незначительна. Однако в дальнейшем их уровень нарастает, составляя у взрослых до 1/3 всех КЦЖК кала [10]. Бутират используется в качестве

источника энергии колоноцитами и оказывает прямое воздействие на процессы регенерации кишечного эпителия, укрепляя его барьерные функции. Бутират обладает противовоспалительным действием, ингибируя нуклеарный фактор воспаления ОТкВ и препятствуя деацетилированию гистонов [11], то есть обладает эпигенетическим противовоспалительным эффектом.

Нормальная микробиота кишечника продуцирует основные КЦЖК с минимальным количеством их изоформ. При нарушении микробиоценоза и преобладании протеолитических микробов количество жирных кислот с большим молекулярным весом и их изоформ возрастает, это может быть диагностическим маркером дисбиоза кишечника [11]. Исследование спектра КЦЖК в кале детей, страдающих коликами, обнаружило достоверные различия по сравнению с контрольной группой [12]. Различия касались кислот с более длинными цепями, преобладали их изоформы (С15, П7, а17). Наше исследование продемонстрировало изменение спектра КЦЖК, которое происходит в первые месяцы и существенно зависит от вида вскармливания и выбора смеси. Мы обнаружили одинаковые тенденции у детей на грудном вскармливании и в группе детей, получавших смесь с пре-и пробиотиками («Нестожен с пробиотиками»): увеличение нормальных КЦЖК с доминированием С2, но при этом значимое увеличение С3 и С4. На этом фоне наблюдалось снижение изокислот и нарастание анаэробного индекса. То есть, благодаря присутствию в составе смеси комплекса олиго-сахаридов и пробиотика L.reuteri, наблюдалось быстрое формирование функционально активного микробиома, который по своему метаболическому спектру приближается к нормальным показателям взрослого, что свидетельствует о более зрелой ми-кробиоте, увеличении строгих анаэробов и уменьшении протеолитической микробиоты, свойственной детям первых месяцев жизни. Формирование зрелого биоценоза сопровождалось снижением уровня кальпротектина, что подтверждало противовоспалительный эффект складывающихся микробно-тканевых взаимодействий. При этом наблюдалось уменьшение диспепсических симптомов и улучшение консистенции и частоты стула, который соответствовал показателю детей на грудном вскармливании. Включение в смесь пробиотика Ь.геШеп оказывает дополнительное воздействие в профилактике ФР, поскольку многочисленные исследования этого штамма продемонстрировали его антимикробное антагонистическое, противовоспалительное действие и способность нормализовать моторную функцию ЖКТ [13-16].

При низком уровне КЦЖК уровень кальпротектина оставался более высоким, этим объясняется более медленная динамика его снижения у детей группы сравнения, получавших смесь без про-и пребиотиков. Но и слишком высокий уровень КЦЖК (в среднем 11 мг/г) сопровождался высоким уровнем кальпротектина. Это можно объяснить процессом брожения и повреждающим воздействием высоких концентраций КЦЖК на слизистую оболочку кишечника, что было показано ранее в экспериментах на животных [17].

Повышение кальпротектина коррелировало, по нашим данным, и с относительно более высоким уровнем изокислот, что свидетельствует об активности протеолитической микробиоты, обладающей мощным провоспалительным потенциалом. Возможно, слишком высокие концентрации КЦЖК негативно отражаются и на барьерных функциях кишечника, поскольку у этих детей мы наблюдали высокий уровень IgE к БКМ и появление клинических симптомов энтероколита. По нашему мнению, норматив содержания КЦЖК должен быть расширен, при этом отклонением от нормы можно считать как снижение ниже 2,9 мг/г, так и повышение выше 9,0 мг/г.

Наше исследование установило высокий процент повышения антител (как IgE, так и IgG4) к БКМ у здоровых детей при отсутствии кожных и гастроинтестинальных симптомов аллергии. Вероятно, повышение специфических IgG4, которое, по нашим данным, не коррелирует с уровнем кальпротектина, клиническими симптомами и проходит после 6 мес. может быть объяснено поступлением материнских IgG и отражает естественный процесс иммунной защиты. Но повышение аллергенспецифических IgE сопровождается повышением фекального кальпротектина и коррелирует с нарушениями функционального состояния микробиоты, нами установлена сильная связь между этими показателями. Более того, у 3 детей с выраженными диспепсическими симптомами, потребовавшими отмены смеси, были обнаружены самые высокие показатели кальпротектина и IgE, а также положительный эффект от перевода на высоко гидролизованную смесь. Несмотря на то, что кожных аллергических проявлений не было ни у одного из этих детей, возникшие у них га-строинтестинальные симптомы, вероятно, были проявлением аллергии к БКМ. Очевидно, при повышении специфических IgE в копрофильтрате можно говорить о сенсибилизации к БКМ, которая сопровождается воспалением слизистой оболочки кишечника и способствует его поддержанию. Поскольку повышение IgE к БКМ было обнаружено более чем у половины детей, но не сопровождалось в большинстве случаев какими-либо симптомами, а в дальнейшем уровень IgE снижался, нормализуясь после 7 мес., вероятно, подобная сенсибилизация к БКМ также может расцениваться как некое пограничное состояние, развивающееся в процессе адаптации и отражающее не всегда гладкое формирование иммунологической толерантности. Оно, как и физиологическое воспаление кишечника, идет параллельно с процессом становления микробиома. Нормальное формирование микробиоты и ее функциональной активности в течение первого полугодия жизни сопровождается как угасанием воспаления, так и снижением IgE. В случаях нарушения этих процессов уровень IgE и кальпротектина нарастают и это, как правило, сопровождается изменением функционального состояния микробиоты. Об этом можно судить по уровню микробных метаболитов (мы установили корреляцию воспаления с очень высоким или очень низким уровнем КЦЖК). Как результат, у ребенка могут появляться диспепсические расстройства,

которые клинически соответствуют критериям ФР ЖКТ.

Таким образом, наше исследование подтвердило роль функционального состояния кишечной микробиоты и сенсибилизации к БКМ в развитии кишечного воспаления как причины симптомов

Литература

1. Vandenplas Y., Abkari A., Bellaiche M., et al. Prevalence and health outcomes of functional gastrointestinal symptoms in infants from birth to 12 months of age. — J. Pe-diatr.Gasroenterol.Nutr. — 2015 — v.61 (5) — P. 531-537.

2. Корниенко Е. А., Кубалова С. С. Роль лактазной недостаточности и кишечной микрофлоры в развитии функциональных расстройств желудочно-кишечного тракта у детей первого полугодия жизни. — Вопросы современной педиатрии. —2013. — 12(4) ю — с. 159-165

3. Hyman P. E., Milla P. J., Bennig M. A., et al. Childhood functional gastrointestinal disorders: neonate/toddler. — Am.J.Gastroenterol. — 2006- v.130 (5). — p.1519-1526.

4. Adlerberth I. Establishment of the gut microbiota in Western infants — Acta PediatricaK> — 2009 — p.220-230.

5. Roads J. M., Fatheree N. J., Norori J., et al. Altered fecal microflora and increased fecal calprotectin in infant colic. — J. Pediatr. — 2009. — v.155(6). — p.823-828.

6. Коростоецее Д. С., Галенко Л. А., Корниенко Е. А., Трусоеа О. В., Камаее А. В., Макарова И. В. Желудочно-кишечные проявления пищевой аллергии: патогенез, клинические формы, принципы терапии. — Российский аллергологический журнал. — 2014 — № 3 — с. 11-21.

7. Indrio F., Di Mauro A., Riezzo G. et al. Prophylactic use of probiotics in the prevention of colic, regurgitation and functional constipation: a randomized clinical trial // JAMA Pediatr. doi: 10.100/jamapediatrics.2013.4367.

8. Дисбактериоз кишечника у детей. Определение метаболической активности анаэробной микрофлоры по содержанию летучих жирный кислот в кале и слюне для характеристики дисбиотических состояний кишечника и ротовой полости у детей (метод га-зо-жидкостной хроматографии). Пособие для врачей. —«Прототип», Москва. — 2005. — 55с.

ФР ЖКТ. Вскармливание смесью с пробиотком L.reuteri, содержащей также пребиотический комплекс олигосахаридов, оказывает профилактическое воздействие за счет формирования более зрелого микробиоценоза, противовоспалительного эффекта и нормализации кишечных функций.

9. Scheiwiller J., Arrigoni E., Brouns F., Amado R. Human fecal microbiota develops the ability to degrade type 3 resistant starch during weaning — J. Ped.Gasroenterol. Nutr. — 2006. — v.43. — p.584-591.

10. Hamer H. M., Jonkers D., Venema K., et al. Review article: the role of butyrate on colonic function. — Aliment. Pharmacol.Ther. — 2008. — v.27. — p.104-110.

11. Малкоч А. В., Бельмер С. В. Кишечная микрофлора и значение пробиотиков для ее функционирования — Лечащий врач. — 2006. — № 4. — с. 60-65.

12. Lehtonen L., Korvenranta H., Eerola E. Intestinal microflora in colicky and noncolicky infants: bacterial cultures and gas-liquid chromatography, J. Ped. Gasroenterol. Nutr.,1994 — v.19. — p.310-314.

13. Ma D., Forsythe P., Bienenstock J. Live Lactobacillus reuteri is essential for the inhibitory effect on tumor necrosis factor alpha-induced interleukin-8 expression — Inf. Immun. — 2004. — v.72(9). — p.5308-5314.

14. Kamiya T., WangL., Forsythe P., et al. Inhibitory effects of Lactobacillus reuteri on visceral pain induced by colorectal distension in Spague-Dawley rats. — Gut. — 2006. — v.55. — p.191-196.

15. Ma X., Mao Y. K., Wang B., et al. Lactobacillus reuteri ingestion prevents hyperexcitability of colonic DRG neurons induced by noxious stimuli. — Am.J. Physiol. Gas-trointest.Liver Physiol. — 2009. — v.296. — G868-G875.

16. Wang B., Mao Y. K., Diorio C., et al. Luminal administration ex vivo of live Lactobacillus species moderates mouse jejunal motility within minutes. — 2010 as doi: 10.1096/fj.09-153841

17. Nafday S. M., PengW. C.L., Babyatsky M. W., et al. Short-chain fatty acids induce colonic mucosal injury in rats with various postnetel ages. — Pediatric Research. — 2005. — v.57 (2). — p.201-204.