CC BY
51
© С. С. Гулямов
ташкентская медицинская академия
СОСТОЯНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АППАРАТА ДЕСНЫ У ДЕТЕЙ С ХРОНИЧЕСКИМ КАТАРАЛЬНЫМ ГИНГИВИТОМ
Резюме. При помощи иммуногистохимического исследования биоптатов межзубных сосочков изучено состояние локального иммунитета десны у детей с хроническим катаральным гингивитом в возрасте 12-14 лет. Полученные результаты показали, что при хроническом катаральном гингивите наблюдается иммунный ответ цитотоксического типа без явной недостаточности в его реализации.
Ключевые слова: дети; хронический катаральный гингивит; десна; эпителий; иммуногистохимическое исследование; дендритные клетки; интраэпителиальные лимфоциты.
УДК: 616.311.2-002-053.2:612.017
Воспалительные заболевания пародонта в связи с их широкой распространенностью и прогрессирующим течением представляют собой актуальную проблему современной стоматологии [1]. Эпидемиологические мониторинговые исследования и клинические данные свидетельствуют о том, что ущерб, наносимый болезнями пародонта в молодости, невосполним, а в среднем возрасте эти заболевания приводят к значительному разрушению парадонта [2]. Имеются данные, подтверждающие тот факт, что гингивит и пародонтит являются последовательными стадиями одного и того же хронического воспалительного процесса [3, 4]. Это подчеркивает важность диагностики и эффективного лечения хронического катарального гингивита на ранних сроках его возникновения.
Вопросы этиологии и патогенеза многих заболеваний, приводящих к повреждению тканей пародонта, остаются недостаточно ясными. По мнению большинства авторов, в основе патогенеза заболеваний тканей пародонта лежит сочетанное воздействие микроорганизмов, эндо- и экзогенных факторов [5]. Микрофлора, вегетирующая в полости рта, рассматривается в качестве важнейшего специфического стимулятора запуска иммунных реакций в слизистой оболочке [6, 7, 8, 4], что определяет важность иммунологических факторов в развитии гингивита.
При стоматологических заболеваниях недостаточно иметь представление только о системном иммунитете. Необходимо оценить состояние иммунологического аппарата слизистой оболочки полости рта. Важность такого подхода продемонстрирована при аномалиях и пороках развития челюстно-лицевой области [9, 10]. Однако в литературе, посвященной изучению слизистой оболочки десны у детей при гингивите, эта проблема освещена недостаточно.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Установить роль иммунитета слизистой оболочки десневого края в развитии хронического катарального гингивита у детей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Обследованы 20 детей в возрасте от 12 до 14 лет, из них 5 клинически здоровых с интактным пародонтом и 15 больных с хроническим генерализованным катаральным гингивитом средней степени тяжести по классификации Н. Ф. Данилевского (1994), диагностированным на основании результатов общеклинических (опрос, осмотр) и параклинических методов (индексная оценка гигиенического состояния полости рта и тканей пародонта). Для заключения о гигиеническом состоянии полости рта использовали индексы Green-Vermillion (1967), Silness-Loe (1967). О состоянии тканей пародонта судили по следующим индексам: гингивита (Silness-Loe, 1967), папиллярно-маргинально-альвеолярному (модификация PARMA, 1967), комплексному пародон-тальному (Леус П. А., 1987); а также проб Писарева-Шиллера и формалиновой.
Биоптаты десневых межзубных сосочков (2-3 мм3) у лиц с интакт-ным пародонтом брали во время удаления зубов в переднем участке нижней челюсти по ортодонтическим или эстетическим показаниям, под проводниковой анестезией, у больных — при первичном обращении
до лечения, под инфильтрационной анестезией. Взятие небольшого объема тканей для исследования не наносило вреда здоровью пациентов и проводилось при получении информированного согласия их родителей. В течение 0,5 ч биоптаты, погруженные в ледяной физиологический раствор, доставляли в Центральную научно-исследовательскую лабораторию УМСА, на базе которой проводили исследования. Материал немедленно погружали в 6 % раствор кар-боксиметилцелюлозы (Sigma, USA) и замораживали погружением в жидкий азот [11]. Приготовление серийных срезов толщиной 5-7 мкм проводили на криостате. Из каждой полученной серии срезов один окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике [12] для последующего сопоставления гистоархитектоники с характером расположения и численностью иммунных клеток.
Состояние локального иммунитета слизистой оболочки оценивали по результатам иммуногистохи-мического исследования. Определение субпопуляци-онных маркеров иммуноцитов исследуемого отдела слизистой оболочки проводили непрямым биотин-экстравидин-пероксидазным методом [11, 13]. В качестве первичных антител использовали HLA-DR, CD20, CD3, CD4, CD8 («Сорбент», Россия) [14]. Локализацию первичных антител выявляли с помощью биотинилированных антител и экстравидин-пероксидазного комплекса (EXTRA-2 1 kit Lot 87H4885, Sigma, USA). Активность пероксидазы визуализировали в реакции с 3 -амино-9-этилкарбазолом (Sigma, USA): в местах нахождения антигена определялась красная окраска. Препараты заключали в гумми-сироп под покровные стекла и окантовывали парафином — [15]. Подсчет позитивно окрашенных клеток проводили при помощи микроскопа (ЛОМО, Россия) в пределах эпителия — в расчете на 100 эпи-телиоцитов по всей толще слоя, отмечали типичные места локализации; в собственной пластинке описывали наличие и характер расположения клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
По данным гистологического изучения биопта-тов здоровой десны межзубных сосочков на нижней челюсти в области центральных резцов, строение слизистой оболочки этого отдела полости рта соответствует возрастной норме. Слизистая оболочка межзубного сосочка представлена многослойным плоским ороговевающим эпителием, расположенным на собственной пластинке. Эпителий состоит из базального, шиповидного, плоского, зернистого и ороговевающего слоев. Базальный слой представлен 1-2 рядами цилиндрических клеток, расположенных на четко выраженной базальной мембране. Шиповидный слой состоит из крупных полигональ-
ных клеток, переходит непосредственно в зернистый слой, клетки которого имеют вытянутую форму и содержат зерна кератогиалина. Поверхностный слой эпителия хорошо выражен и представлен ороговевшими, лишенными ядер клетками.
По данным иммуногистохимического исследования биоптатов слизистой оболочки десны у детей с интактным пародонтом, HLA-DR-позитивные (HLA-DR+) клетки в толще эпителия представлены клетками с характерными отростками, присущими дендритным клеткам [16]. Дендритные клетки в количестве 2-3 локализуются в базальном слое и по всей толще шиповидного слоя. Клеточные отростки разветвлены и имеют различное направление. Кроме того, в базальном слое эпителия имеются HLA-DR+-клетки цилиндрической формы, без отростков, расположенные в один ряд на четко выраженной базальной мембране. Таким образом, наблюдается экспрессия HLA-DR-рецепторов базальными эпителиоцитами. В собственной пластинке отмечается множество HLA-DR+-клеток. Среди клеток, способных экспрессиро-вать HLA-DR-рецепторы и являющихся представителями собственной пластинки слизистой оболочки десны, — дендритные клетки, моноциты, макрофаги, эндотелиоциты [16]. По характерным отросткам четко определяются дендритные клетки, составлявшие подавляющее большинство.
У детей с интактным пародонтом СD20+-клетки (В-лимфоциты) не встречаются либо выявляются крайне редко. Такая картина соответствует нормальному состоянию слизистой оболочки [9, 17].
CD3-маркер характерен для Т-лимфоцитов, которые несут Т-клеточный рецептор, состоящий из альфа-, бета-цепей (альфа-, бета-Т-лимфоциты) [18]. В литературе остается неясным вопрос о наличии такой же молекулы у гамма-, дельта-Т-лимфоцитов, которые в основном представляют внутриэпите-лиальные Т-лимфоциты. Таким образом, CD3+-клетками, обнаруживаемыми внутри эпителия, по всей видимости, являются мигрировавшие из кровотока альфа-, бета-Т-лимфоциты. При исследовании клинически здоровой слизистой оболочки десны обнаружены единичные CD3+-клетки как в пределах эпителия, так и в собственной пластинке слизистой оболочки десны.
По нашим данным, CD4-экспрессией обладали клетки округлой формы и отростчатые клетки. Основываясь на данных литературы, согласно которым CD4+-лимфоциты могут иметь отростчатое строение, невозможно точно определить, относятся обнаруженные нами CD4+-клетки к Т-лимфоцитам либо к дендритным клеткам, которые также могут экс-прессировать CD4-молекулу [19]. Кроме того, такую же молекулу могут экспрессировать и моноциты,
макрофаги, обычно присутствующие в собственной пластинке слизистой оболочки десны у здоровых людей. Внутри эпителия насчитывается 2-5 CD4+-клеток, локализованных в основном в толще шипо-видного слоя и в базальном слое. На основании данных моноиммунофенотипирования Т-лимфоцитов мы не располагаем достаточным основанием, чтобы отнести CD4+-клетки, даже округлой формы и локализованные в пределах эпителия, только к Т-хелперной популяции (19). Среди выявленных нами CD4+-клеток могут быть CD4+ CD3-гамма-, дельта-Т-лимфоциты и CD4+ CD3+альфа-, бета-Т-лимфоциты, а также дендритные клетки, моноциты, макрофаги, что особенно важно с той точки зрения, что CD4+гамма-, дельта-Т-лимфоциты выполняют в слизистой оболочке регуляторную функцию [19].
В эпителии слизистой оболочки здоровой десны насчитывалось 2-4 CD8+-клетки в базальном слое и прилежащих рядах шиповидного слоя, преимущественно в проекциях сосочков собственной пластинки слизистой оболочки [9]. В собственной пластинке отмечалось незначительное количество CD8+-клеток, распределенных равномерно. Исходя из данных литературы о фенотипе гамма-, дельта-Т-клеток, который может быть следующим: CD3-CD4-CD8+ [20], большинство выявленных нами CD8+-клеток, вероятно, представляет собой часть гамма-, дельта-Т-лимфоцитов, осуществляющих эффектор-ную функцию — внутриэпителиальный «надзор» [18]. Это подтверждает и локализация CD3+-клеток по всей толще эпителия, в отличие от расположения CD8+-клеток, сосредоточенных в базальном слое и прилежащих к нему нескольких рядах шиповидного слоя, а также близко к базальной мембране со стороны собственной пластинки слизистой оболочки.
Таким образом, преобладающими клетками-эффекторами локального иммунитета здоровой слизистой оболочки десны являются внутриэпителиаль-ные CD8+гамма-, дельта-Т-клетки, CD3-молекула, не присущая внутриэпителиальным гамма-, дельта-Т-клеткам, характерна для альфа-, бета-Т-лимфоцитов и позволяет судить о миграции Т-клеток.
При исследовании биоптатов десны, взятых у пациентов с хроническим катаральным гингивитом, выявлены HLA-DR+-дендритные клетки. Дендритные клетки в количестве 8-12 расположены внутри эпителия. Их характерная локализация в базальном слое эпителия в виде скоплений свидетельствует об усиленной миграции дендритных клеток из эпителия и накоплении у базальной мембраны как у достаточно труднопреодолимого препятствия. В толще шиповидного слоя количество этих клеток меньше, их отростки расположены в основном биполярно и направлены к поверхности эпителия и базаль-
ной мембране, что свидетельствует об активации их передвижения [16]. В собственной пластинке наблюдается значительное увеличение количества HLA-DR+-клеток по сравнению с нормой, отражающее их интенсивный приток при хроническом катаральном гингивите. Отростки дендритных клеток ориентированы по ходу соединительнотканных волокон, что также служит признаком движения.
CD20+-клетки при хроническом катаральном гингивите единичны, выявляются в эпителии и собственной пластинке слизистой оболочки. Учитывая, что представление антигенов для В-клеток происходит в лимфоидных органах (для слизистой оболочки полости рта ими являются подслизистые лимфоидные фолликулы, регионарные лимфатические узлы, миндалины), в нашем исследовании оценка роли В-клеточного ответа в патогенезе хронического катарального гингивита сводится к констатации отсутствия В-клеточной инфильтрации слизистой оболочки межзубного сосочка, а отсутствие В-клеток внутри эпителия подтверждает целостность базальной мембраны.
CD3+-клетки в количестве 4-6 расположены внутри эпителия, в основном в базальном слое и середине шиповидного слоя. Изредка встречаются скопления CD3+-клеток (до 10-11) в базальном слое эпителия. В собственной пластинке слизистой оболочки CD3+-клетки расположены близко к базальной мембране.
У детей с хроническим катаральным гингивитом наблюдается увеличение числа CD3+Т-лимфоцитов, что характеризует роль клеточных эффекторов локального иммунитета как ведущую в патогенезе этой формы заболевания.
CD4+-клетки при хроническом катаральном гингивите внутри эпителия единичны. В собственной пластинке слизистой оболочки слабую экспрессию CD4+ проявляют также и отростчатые клетки. Уменьшение количества CD4+-клеток может свидетельствовать о снижении их регуляторной функции [18].
CD8+-клетки (7-11 клеток на 100 эпителиоци-тов) располагались равномерно по базальному слою и прилегающим рядам шиповидного слоя. В толще шиповидного слоя CD8+-клетки окружали очаги вакуольной дистрофии. Этот факт объясняется исходя из присущей CD8+ гамма-, дельта-Т-лимфоцитам главной функции — удаление поврежденных эпите-лиоцитов — и характеризует их как линию защиты у входных ворот инфекции, которыми являются очаги дистрофии эпителиального слоя [18, 19]. В собственной пластинке слизистой оболочки на вершинах сосочков определялись скопления CD8+-клеток (до 10-1). Очевидно, они представляли собой прибывающие в патологически измененную десну Т-лимфоциты.
Как показывают результаты исследования, число CD8+- и CD3+-клеток в эпителии при хроническом
катаральном гингивите повышалось одинаково. Локализация клеток была аналогичной, следовательно, подавляющее большинство CD8+ было одновременно и CD3+-клетками, т. е. альфа-, бета-Т-лимфоцитами. Количество CD8+-клеток также могло пополниться и за счет активированных CD8+ CD3-гамма-, дельта-Т-лимфоцитов [18, 19].
ВЫВОДЫ
При помощи непрямого биотин-экстравидин-пероксидазного метода впервые проведена оценка локального иммунитета десны при хроническом генерализованном катаральном гингивите средней степени тяжести у детей. Полученные результаты указывают на усиление захвата антигенов дендритными клетками, о чем свидетельствует интенсивный приток этих клеток в слизистую оболочку, включение CD8+ Т-клеточного ответа на фоне снижения регулирующей хелперной функции, что проявлялось увеличением количества CD8+-клеток, их скоплением вокруг дефектов эпителия и уменьшением количества CD4+-клеток в слизистой оболочке. В результате воздействия микробных факторов при хроническом генерализованном катаральном гингивите средней степени тяжести наблюдается иммунный ответ цитотоксического типа, и явной недостаточности в его реализации не отмечается.
Представленные результаты характеризуют использованный метод как высокоинформативный, позволяющий проанализировать состояние иммунологического аппарата слизистой оболочки полости рта, роль иммунных механизмов в патогенезе хронического катарального гингивита и обосновать главное направление терапии — устранение этиологических факторов, в первую очередь микробного.
ЛИТЕРАТУРА
1. Волков О. В., Елецкий Ю. К. Основы гистологии с гистологической техникой: Монография. - М.: Медицина, 1971. - 271 с.
2. Волошина Л. И. Состояние иммунологического аппарата слизистой оболочки полости рта в участках, выстилающих область перелома нижней челюсти // Проблеми еколог'п та медицини. Киев, 2001. - Т. 5, № 3-4. - С. 38-40.
3. Григорян А. С., Фролова О. А, Иванова Е. В. Морфогенез ранних стадий воспалительных заболеваний пародонта // Стоматология. - М., 2002. - № 1. -С. 19-25.
4. Данилевский Н. Ф., Борисенко А. В. Заболевания пародонта: Монография. - Киев: Здоров'я, 2000. - 461 с.
5. Дранник Г. Н. Клиническая иммунология и аллергология: Монография. - Одесса: АстроПринт, 1999. -603 с.
6. Кайдашев И. П., Волошина Л. И., Шинкевич В. И. и др. Роль дендритных клеток в обеспечении локального иммунитета полости рта // Украинский стоматолопчний альманах. Киев, 2001. - № 5. -С. 80-87.
7. Кайдашев I. П., Ткаченко П. I., Куроедова В. Д. и др. Споаб оцшки функ^аналного стану слизовоi обо-лонки порожнини рота: Пат. 2001096503, Украина, МПК 7 А61 С17/00/ (Украина); № 41428; Заявл. 24.09.2001; 0публ.10.06.2002. - 3 с.
8. Карасюнок О. О. Особливосп лкування дщей i3 зу-бощелепними аномалiями в сполученн з мтким присшком порожнини рота: Дис. канд. мед. наук. -Полтава, 2001. - 209 с.
9. Мащенко И. С, Самойленко А. В. Новые аспекты патогенеза и лечения генерализованного пародонтита // Вкник стоматологи. - Киев, 2002. - №1. - С. 12-15.
10. Микроскопическая техника. Руководство для врачей и лаборантов / Под ред. Д. С. Саркисова и Ю. Л. Петрова. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.
11. ПолакДж., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохи-мию: современные методы и проблемы: Монография // Пер. с англ. Глуховой М. А. / Под ред. Хрущо-ва Н. Г - М.: Мир, 1987. -74 с.
12.Сивовол С. И. Клинические аспекты пародон-тологии // Стоматология. - М., 2002. - №3. -С. 13-21.
13. Ткаченко П. И., Кайдашев И. П., Баштовенко О. А. и др. Иммунокомпетентность краевого эпителия щелевого дефекта у детей с врожденными несращениями неба // Современная стоматология. М., 2002. -№ 2. - С. 104-107.
14. Тотолян А. А, Балдуева И. А, Бубнова Л. Н. и др. Стандартизация методов иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга человека // Клиническая лабораторная диагностика. - М., 2002. - № 1. -С. 44-50.
15. Straka M. Пародонтология-2000 // Новое в стоматологии. - М., 2000. - № 4. - С. 25-53.
16. Цепов Л. М, Орехова Л. Ю. Иммунная терапия воспалительных заболеваний пародонта: иллюзии или реальность? // Пародонтология. - М., 1999. - № 2. -С. 3-9.
17. Эпидемиология, этиология и профилактика болезней пародонта // Доклад научной группы ВОЗ. -ВОЗ, Женева, 1980. - 66 с.
18. Ярилин А. А, Пинчук В. Г., Гриневич Ю. А. Структура тимуса и дифференцировка Т-лимфоцитов: Монография. - Киев: Наукова думка, 1991. - 243 с.
19. Boismenu R., Havran W. L. g-, d-T-cells in, Host Defense and Epithelial cell Biology // Clin. Immunol. and Immunopathol. - 1998. - Vol. 86, № 2. - P. 121-133.
20. Cappelli R, Holt S. C, Singer R. E. et al. Dent. Res. 1998; Special Issue А: 77:158.
IMMUNOLOGICAL APPARATUS CONDITION OF THE GINGIVA IN CHILDREN WITH CHRONIC CATARRHAL GINGIVITIS
Gulyamov S. S.
♦ Resume. Local immunity status of the gingiva was studied in children aged 12-14 years with chronic catarrhal gingivitis using immunohistochemical investigation of the biopsy samples of the interdental papillae. The study has shown that in chronic catarrhal gingivitis the immune response of cytotoxic type was observed without evident insufficiency in its realization.
♦ Key words: children; chronic catarrhal gingivitis; gingiva; epithelium; immunohistochemical study; dendrite cell; intraepithelial lymphocytes.
♦ Информация об авторах
Гулямов Суръат Саидвалиевич -Ташкентская медицинская академия, 100109, Ташкент, ул. Фароби, 2 E-mail: [email protected]
Gulyamov Surat Saidvalievich — Tashkent Medical Academy 2 Farobi street, 100109, Tashkent E-mail: [email protected]
