CC BY
22
УДК 616.379-008.64-053.2:612.438 Г.А. Замотаева
СТАН ЕНДОКРИННО1 ФУНКЦП ТИМУСА У Д1ТЕЙ ГРУПИ РИЗИКУ У ПЕРЕДКЛ1Н1ЧНИЙ ПЕР1ОД РОЗВИТКУ ЦУКРОВОГО Д1АБЕТУ 1-го ТИПУ
ДУ «1нститут ендокринологи та обмну речовин iM. В.П. Комсаренка АМН Украни», Кше
ВСТУП
Припущення про aBToiMyHHy природу цукрово-го дiабетy (ЦД) 1-го типу було висунуто 70-ми роками минулого сторiччя. З того часу численними дослщженнями доведено участь широкого спектра ^тинних i гуморальних чинникiв природного й адаптивного iмyнiтетy у розвитку автоiмyнного процесу за ЦД 1-го типу, що призводить у результат до загибелi iнсyлiнпродyкyючих клiтин ос^вфв Лангерганса пщшлунковоТ залози [1, 2]. Перелк цих чинникiв iз кожним роком зростае, а механiзм деструкци ß-клiтин уточнюеться та деталiзyeться.
Остаными роками значна увага придiляеться вивченню фyнкцiй тимуса за умов цукрового дiaбе-ту [3]. Це пов'язано iз суттевою змiною уявлень про роль тимуса у формуванн центрально'!' iмyнноí' толерантностi [4, 5]. ^тини медулярно' строми тимуса синтезують органоспецифiчнi антигени та «представляють» 'х тимоцитам у процес диферен-цiювaння. Лiмфоцити з високоафiнними рецепторами, що розтзнають влaснi антигени, пiдлягaють ели мшацп. Порушення будь-якого етапу негативно''' селекцп веде до появи клоыв Т-лимфоцитiв, агре-сивних щодо власних структур. У випадку цукрового дiaбетy мшенню aвтоiмyнних реaкцiй е антигени ß-^тин пщшлунковоТ залози. Раыше вважалося, що у тимyсi вщсуты ткaниноспецифiчнi антигени (ТсА), i толерантнкть до них забезпечуеться виключ-но мехаызмами периферично' супреси. Остaннiми роками отримано переконливi докази присyтностi у тимус практично всiх вiдомих ТсА [6]. Бтьше того, встановлено, що синтез i секрецiя ТсА е фiзiологiч-ною влaстивiстю клiтин тимуса [4]. Доведено, що в тимуа експресуються вс гени сiмействa Ысул^в: IGF2 (в епiтелiaльних клiтинaх), IGF1 (у макрофагах), INS (в епiтелiaльних i дендритних клiтинaх), а також молекул GAD i IA-2.
У тварин iз генетично детермiновaним дiaбетом (NOD мишi та BB щури) ще перед мaнiфестaцiею хвороби у тимуа виявляються рiзномaнiтнi змiни: пстолопчноТ будови, фенотипу тимоцитiв та 'х суб-
популяцiйного складу, синтезу цитокшгв i xeMOKiHiB, рiвня експресп антигенгв в-клгтин тощо [3, 7]. Водночас е лише поодинокг публгкаци з питань визначення ендокринноТ функци тимуса за умов дгабету.
Основним гормоном, що продукуеться епгте-лгальними клгтинами тимуса i присутнгй у плазмг кровг у фгзюлопчно значущих концентрацгях, е тиму-лгн [8, 9]. Тимулгн (друга назва — тимгчний сироват-ковий чинник) е нанопептидом, зв'язаним з гонами цинку. На вгдмгну вгд гнших бглкгв i пептидгв тимгчно-го походження, тимулгн продукуеться виключно у тимуа i не визначаеться пгсля тимектомГ'' та у мишей nude з вродженою вщсутнгстю тимуса. Бiологiчна активнiсть тимулгну реалiзуеться лише пгсля зв'я-зування з молекулою цинку. За сучасними уявлення-ми, рiвень тимулгну у сироватцг кровг вважаеться iнтегральним показником ендокринноТ' функцП' тимуса. Тимулгн залучений у ргзнг етапи гнтра- та екстра-тимгчного диференцiювання Т-клгтин, i його вмгст е однгею з найважливiших характеристик гмунного статусу. Введення синтетичного тимулгну посилюе пригнгчену (за старiння, iмунодефiцитiв, пгсля тимек-томГ') вгдповгдь Т-клгтин на мгтогени, вiдторгнення алотрансплантатiв, обмежуе розвиток автоiмунного процесу. Продукцгя тимулгну перебувае пгд контролем цитокшгв (iнтерлейкiнiв 1а, 1р, 2, Y-iнтерферону) та велико''' ктькосп гормонгв [10]. Клгнгчними та екс-периментальними дослгдженнями показано, що вмгст тимулгну в сироватцг кровг змгнюеться за умов багатьох захворювань.
Виявлено пригнгчення ендокринно'' функци тимуса у дорослих хворих на цукровий дгабет 1-го типу, а також у мишей ¡з алоксангндукованим ЦД [11]. Експерименти, проведен спгвробгтниками лабораторп ендокринно''' регуляцп гмуногенезу, показали зниження вмгсту гормонгв тимуса у мишей ¡з хгмгчно гндукованим (стрептозотоцином або алоксаном) дгабетом та у тварин ¡з генетично детер-мгнованим дгабетом (щури ВВ, мишг db/db) [12]. У клгнгчних дослгдженнях нами виявлено гстотне
40
Кл^чна ендокринологiя та ендокринна хiрyргiя 1(30) 2010
зменшення вмкту тим1чних гормон1в у кров1 Д1теи, хворих на ЦД 1-го типу, встановлено залежнкть цих зм1н в1д тривалост1 захворювання та наявносп ускладнень [13]. Важко визначити напевне, що спричиняе порушення функцй тимуса за д1абету. Ц1 змши значною м1рою можуть бути наслщком глибо-ких метабол1чних порушень, пов'язаних 1з розви-тком хвороби. Тому надто цкавими е досл1дження ендокринноТ функцй тимуса у передкл1н1чниИ перюд розвитку ЦД 1-го типу.
На пщстав1 викладеного вище метою роботи стало визначення ендокринноТ' функцй" тимуса у д1теИ групи ризику щодо захворювання на ЦД 1-го типу.
МАТЕР1АЛ I МЕТОДИ
Проведено визначення р1вня тимул1ну у 126 д1теИ в1ком 5-16 рок1в. Серед них 69 оаб (35 д1вчи-нок i 34 хлопчики) з пщвищеним ризиком розвитку ЦД 1-го типу (нащадки та с1бси хворих на цукровий д1абет 1-го типу), 18 пац1ент1в (10 д1вчинок i 8 хлоп-чик1в) 1з вперше виявленим д1абетом перед початком 1нсул1нотерапй' та 39 практично здорових д1тей без обтяжено'Т спадковост1 (контрольна група).
Дослщження р1вня глюкози у периферичнш кров1 натще та у сеч1 проводили дв1ч1 з Ытервалом у 2 тижн1. У д1тей групи ризику та контрольно'"' групи показники були у межах норми.
Р1вень тимул1ну в сироватц1 кров1 визначали за модиф1кованим методом Bach [14], принцип якого полягае у вщновлены пщ впливом гормон1в тимуса чутливосл до азат1оприну спонтанних розеткоутво-рюючих кл1тин (сРУК) селез1нки тимектомованих мишей.
Зразки плазми кров1 центрифугували на ультра-ф1льтрах Centriflow Amicon CF-50 (Amicon, Lexington, MA). Ф1льтровану плазму титрували у середовищ1 199 для одержання серП' двократних розведень: вщ 1:2 до 1:512. У мишей лжи СВА в1ком 4-6 тижн1в видаляли тимус п1д гексеналовим наркозом, i тва-рин використовували у дослщах через 4-8 тижн1в пкля операцП'. Кожного разу перед вилученням селезшки ретельно перев1ряли в1дсутн1сть залишк1в тимуса. За допомогою гомоген1затора Поттера одер-жували суспенз1ю спленоцит1в, дв1ч1 в1дмивали в середовищ1 199 i використовували в концентрацП' 4х107. Для проведення тестування 100 мкл нерозве-дено''' та по 100 мкл сермно розведено''' плазми зм1-шували 1з суспенз1ею спленоцит1в у сп1вв1дношенн1 1:1 та 1нкубували 30 хвилин у термостат! за темпера-тури 37°С. Кожну пробу ставили в дуплетах. Чотири адекватн об'еми суспензП' спленоцит1в без додаван-
ня плазми використовували як контроль. Пкля куль-тивування кл1тини зм1шували з азатюприном у концентрацП' 10 мкг/мл, обережно перем1шували та 1нкубували за 37°С протягом 90 хвилин. Азатюприн додавали у дв1 з чотирьох контрольних проб, в 1нш1 — лише середовище 199. 100 мкл суспензп еритро-цит1в барана, що мктила 12х107 кл1тин, вносили до кожно''' проб1рки, 5 хвилин шкубували за 37°C, центрифугували 1 хвилину за 100 g i дал1 витримували за 4°C протягом години. Осад ресуспендували 5 хвилин за 10 об./хв., використовуючи ротор 1з горизон-тальним розташуванням проб1рок, i п1драховували к1льк1сть розеткоутворюючих кл1тин. Активним титром тимул1ну вважали максимальне розведення зразка плазми, у якому спостер1гали 50% редукц1ю ктькосп сРУК пор1вняно з контролем. Одиниця вим1рювання тимул1ну — 1/log2 титру — величина, зворотна log2 розведення сироватки, що тестуеться.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
З метою виявлення авто1мунного процесу в пщ-шлунков1й залоз1 перед кл1н1чною ман1фестац1ею цукрового д1абету в периферичн1й кров1 д1тей з обтяженою спадков1стю (як1 мали родич1в першо''' л1нй', хворих на цукровий д1абет 1-го типу) визначали специф1чн1 антит1ла до антиген1в ß-клп'ин: глута-матдекарбоксилази (GAD), тирозинфосфатази (IA-2), а також 1нсул1ну (IAA). Дослщження вмкту авто-антит1л (ААТ) виконано сп1вроб1тниками в1дд1лення профтактично''' д1абетологи рад1о1мунолог1чним методом 1з використанням стандартних набор1в ф1рми «CIS bio international», Франц1я. За результатами дослщжень д1ти з обтяженою спадков1стю були розподтеы на 2 групи: позитивы (38 д1тей) i негативн1 (31 дитина) щодо наявносп в периферичнш кров1 автоантитт до антигешв остр1вцевих ß-клiтин. Проведене у вщдтены кл1н1ко-лабора-торне обстеження нормогл1кем1чних д1тей групи ризику не виявило суттево''' р1зниц1 ан1 м1ж ААТ-позитивними i ААТ-негативними, ан1 м1ж патентами групи ризику та здоровими д1тьми без обтяже-но''' спадковосп.
Анал1з результат1в визначення вм1сту тимул1ну у здорових д1тей i пацкнт1в групи ризику показав, що в1рог1дн1 зм1ни ендокринно''' функцй' тимуса спосте-р1гаються лише в ос1б 1з позитивною реакц1ею на наявн1сть автоантитт до антигеыв ß-клiтин п1д-шлунково''' залози (GAD, IA-2, IAA). Як свщчать наведен! у таблиц дан1, у д1тей, серонегативних щодо автоантитт, показники вмкту тимулшу близью до контрольних значень. Разом 1з тим, сл1д в1дзначити,
Кл1н1чна ендокринолопя та ендокринна х1рург1я 1(30) 2010
41
Таблиця
Вмкт тимулшу (1/log2 титру) у дiтей i тдштмв, серопозитивних i серонегативних щодо автоантитiл
3 Серопозитивн щодо 38 4,34±0,14 1-3 <0,001 автоантитiл 2-3 <0,001
4 Дiти групи ризику, HKi у 15 3,53±0,23 1-4 <0,001 подальшому захворiли 2-4 <0,001 на цукровий дiабет 1-го 3-4 <0,01 типу
5 Нещодавно виявлений 18 3,06±0,19 1-5 <0,001
цукровий дГабет 1-го 3-5 <0,001
типу 4-5 >0,05
що у деяких пацieнтiв (5 iз 31, що складае 16% вщ загально''' кiлькостi пацiентiв у групО рiвень тимули ну був суттево нижчим вiд норми (1од2 — 3-4).
Бтьш iстотне послаблення гормонпродукуючо''' функцГ'' тимуса встановлено у дп"ей групи ризику, у яких виявлено автоантитта. Середнi значення вмк-ту тимулшу у цк'Г категорП' пацкн^в були майже в 1,5 разу нижчими вщ показникiв здорових д^ей (4,34±0,14 i 6,18±0,16 вщповщно, р<0,001). У цiй груп 24 дитини з 38 (63%) мали нижчий вщ норми рiвень тимулiну.
У групi, позитивнiй щодо автоантитт, 15 дiтей у подальшому захворти на цукровий дiабет 1-го типу. Середы значення вмкту тимулшу у них скла-дали 3,53±0,23, тобто були найнижчими серед уах кaтегорiй дiтей групи ризику (р<0,01).
Пiсля мaнiфестaцГ'' цукрового дiaбету ендокрин-на функцiя тимуса продовжувала знижуватися. Так, у д^ей iз клЫчними ознаками хвороби перед початком терапп iнсулiном вмiст тимулiну складав 3,06±0,19, що вдвiчi нижче вiд показниюв контрольно''' групи (р<0,001).
Отриман результати пiдтверджують висновки наших попередых експериментальних дослiджень i узгоджуються з даними л^ератури. Очевидно, пору-шення роботи тимуса за цукрового дiaбету прояв-ляються функцiонaльною неповноцiннiстю етте-лiaльних клiтин — продуцентiв тимулшу.
Значне послаблення ендокринно''' функцГ'' тимуса у д^ей групи ризику щодо ЦД 1-го типу може бути складовою частиною комплексу iмунних дис-функцiй, що визначае розвиток aвтоiмунного про-цесу. Важко сказати напевне, яким чином нестача секрецп тимiчних гормонiв може позначатися на формуванн автоагресивних клонiв лiмфоцитiв: або
впливае на процес диференц1ювання Т-л1мфоцит1в у тимус1 на етап1 негативно!' селекцГ'', або проявля-еться послабленням супресГ'' автореактивних кл1тин на периферп [15].
Отже, проведен! досл1дження встановили сутте-ве зменшення р1вня тимулшу в плазм1 кров1 д1тей групи ризику розвитку ЦД 1-го типу, як1 мають авто-антит1ла до антигеыв р-кл1тин. Тобто зм1ни ендокринно''' функцГ'' тимуса в1дбуваються вже у перюд початку авто1мунного процесу в пщшлунковш зало-з1 i виявляються значно ран1ше кл1н1чних прояв1в хвороби. Отриманi результати свiдчать про доцть-нiсть визначення вмiсту тимулшу у дГтей групи ризику як одного з додаткових критерП'в оцшки ймовiрностi захворювання на ЦД 1-го типу.
ВИСНОВКИ
1. Середы показники ендокринно''' функцГ'' тимуса у дГтей групи ризику щодо ЦД 1-го типу без наяв-носп автоантитт в циркуляцП' вГрогщно не вщрвня-ються вщ контролю.
2. У дггей групи ризику, в яких виявлено автоантитта до антигеыв р-клп"ин пщшлунково'Г залози, вмкт тимулшу у сироватц кровГ суттево (в 1,5 разу) знижуеться. Найзначыше зниження продукцГ'' ти-мГчних гормонт спостерiгаеться напередоднi мани фестацГ'' захворювання.
3. Визначення вмкту тимулшу у кровГ дiтей групи ризику можна використовувати як додатко-вий критерш оцшки ймовГрносп захворювання на ЦД 1-го типу.
Л1ТЕРАТУРА
1. Gianani R., Eisenbarth G.S. The stages of type 1A diabetes // Immunol. Rev. — 2005. — Vol. 204. — P. 232-249.
2. Atkinson M.A. Thirty years of investigating the autoimmune basis for type 1 diabetes // Diabetes. — 2005. — Vol. 54. — P. 1253-1263.
3. Geenen V., BrilotF., Louis C. etal. Importance of a thymus dysfunction in the pathophysiology of type 1 diabetes // Rev Med Liege. — 2005. — Vol. 60, № 5-6. — P. 291-296.
4. Gallegos A, Bevan M.J. Central tolerance: good but imperfect // Immunol. Rev. — 2006. — Vol. 209. — P. 290-297.
5. Geenen V, Mottet M, Dardenne O. et al. Thymic self-antigens for the design of a negative/tolerogenic self-vaccination against type 1 diabetes // Curr. Opin. Pharmacol. — 2010. — Vol. 10, № 4. — P. 461-472.
6. Krenger W. Foreign and self — the challenge for the immune system // Schweiz. Rundsch. Med. Prax. — 2007. — Vol. 96, № 6. — P. 199-204.
№ Група обстежених n M±m р
1 Контроль (здоров! дГти) 39 6,18±0,16
2 Серонегативн щодо автоантитт 31 5,65±0,19 1-2 >0,05
42
Клштна ендокринолопя та ендокринна хфурпя 1(30) 2010
7. Kwon H., Jun H.S., Yang Y et al. Development of autoreactive diabetogenic T cells in the thymus of NOD mice // J. Autoimmun. — 2005. — Vol. 24, № 1. — P. 11-23.
8. Bach J.-F., Dardenne M. Thymulin, a zinc-dependent hormone // Med. Oncol. Tumor Pharmacother. — 1989. — Vol. 6, № 1. — P. 25-29.
9. Reggiani P.C., Morel G.R., Gloria M. Console G.M. et al. The thymus-neuroendocrine axis: physiology, molecular biology, and therapeutic potential of the thymic peptide thymulin // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 2009. — Vol. 1153. — P. 98-106.
10. Savino W., Dardenne M. Neuroendocrine Control of Thymus Physiology // Endocrine Reviews. — 2000. — Vol. 21, № 4. — P. 412-443.
11. Fabris N., Mocchegiani E. Endocrine control of thymic serum factor production in young-adult and old mice // Cell. Immunology. — 1985. — Vol. 91, № 2. — P. 325-335.
12. Чеботарев В.Ф. Современные представления о механизмах аутоиммунного процесса. Аутоагрессия и проблема иммунореабилитации при эндокринной патологии // 1мунологгя та алергологгя. — 1998. — № 1-2. — С. 59-63.
13. Chebotarev V., Zubkova G., Zamotayeva G. et al. Comparative study of thymic function and induced nonspecific immunity in children with complicated and insulin-dependent diabetes mellitus // Abstr. I World Congress Child Health-2000 (Canada). — 1995. — P.256.
14. Vocchegiani E., Paolucci P., Granchi D. et al. Plasma zinc level and thymic hormone activity in young cancer patients // Blood. — 1994. — Vol. 83. — P. 749-757.
15. Bach J.-F. Insulin-dependent diabetes mellitus as an autoimmune disease // Endocrine Rev. — 1994. — Vol. 15, № 4. — P. 516-542.
РЕЗЮМЕ
Состояние эндокринной функции тимуса у детей группы риска в доклинический период развития сахарного диабета 1-го типа Г.А. Замотаева
Проведено исследование уровня тимулина (гормона, секретируемого эпителиальными клетками тимуса) в крови 69 нормогликемических детей, имеющих повышенный риск развития диабета 1-го типа (потомки первой линии родства и сибсы больных сахарным диабетом) и у 18 детей с впервые выявленным диабетом до начала инсулинотерапии. Контрольную группу составили 39 практически здоровых детей без отягощенной наслед-
ственности по сахарному диабету. У 38 детей из группы риска выявлены антитела к антигенам р-клеток поджелудочной железы (GAD, IA-2, IAA), у остальных детей этой группы (31 ребенок) аутоантитела (ААТ) в крови не обнаружены. Установлено, что у детей группы риска с позитивной реакцией на ААТ содержание тимулина в 1,5 раза (р<0,001) ниже контрольных значений. Наиболее значительное снижение секреции тимулина наблюдается накануне манифестации диабета. Полученные данные свидетельствуют о нарушениях функции тимуса у детей с аутоиммунным процессом в поджелудочной железе. Снижение уровня тимулина в крови наблюдается в период, предшествующий развитию клинической фазы заболевания. Определение содержания тимулина у детей с отягощенной наследственностью может быть использовано в качестве дополнительного критерия оценки вероятности заболевания сахарным диабетом 1-го типа.
Ключевые слова: сахарный диабет 1-го типа, тиму-лин, аутоантитела, дети.
SUMMARY
Thymic endocrine function in children risk group in the preclinical period of type 1 diabetes mellitus G. Zamotayeva
The authors present the results of a study of blood levels of thymulin (a hormone that is secreted by thymic epithelial cells) in 69 normoglycemic children being at increased risk of type 1 diabetes mellitus development (offsprings of first line kin and sibs of diabetes mellitus patients), and in 18 children with newly diagnosed diabetes before insulin therapy initiation. The control group consisted of 39 practically healthy children without a family history of diabetes mellitus. In 38 children from the risk group, antibodies to antigens of pancreatic beta cells (GAD, IA-2, IAA) were identified; in the rest of children from this group (31 children) autoantibodies (AAB) were not revealed in the blood. It has been established that in children from the risk group with a positive response to AAB, thymulin content was by 1.5 times (р<0.001) lower compared with control values. The most significant decrease in thymulin secretion was observed on the eve of diabetes manifestation. The data obtained suggest the presence of thymic functional abnormalities in children with autoimmune process in the pancreas. A decrease in thymulin blood levels was noted in the period preceding the development of clinical phase of the disease. Thymulin level assay in children with a family history of diabetes may be used as an additional criterion for assessment of the likelihood of type 1 diabetes mellitus development.
Key words: Type 1 diabetes mellitus, thymulin, autoantibodies, children.
Клгнгчна ендокринологгя та ендокринна хгрурггя 1(30) 2010 43
Дата надходження до редакцп 23.08.2010 р.
