CC BY
48
© Коллектив авторов, 2011.
УДК 612.397.23:616.36:616.45-001.1/.3
Т.П. Новгородцева1, Ю.К. Караман1, Т.А. Гвозденко1, Н.В. Жукова2
состав жирных кислот печени крыс в условиях алиментарного СТРЕССА
1 Владивостокский филиал Учреждения РАМН Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - Научно-исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения, г. Владивосток;
2Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, г. Владивосток.
Изучен состав и метаболические превращения жирных кислот (ЖК) фракций эфиров стеринов, фосфолипидов (ФЛ), триацилглицеридов (ТГ) печени крыс линии Вистар в условиях алиментарного стресса. Установлена активация синтеза 18:1п9, 20:5п3, 20:3п6 в печени крыс через 90 суток моделирования алиментарного стресса. На 180 сутки эксперимента наблюдалось истощение пула 18:3п6, 22:4п6, 22:5п3 во фракции ФЛ, 18:2п6, 18:3п6, 20:5п3, 22:6п3 в ТГ и уменьшение уровня 20:4п6 во всех исследуемых фракциях липидов. Выявленная модификация состава ЖК в печени крыс в условиях алиментарного стресса отражает формирование адаптационных и патологических изменений печени.
Ключевые слова: жирные кислоты, печень, стресс.
Алиментарные стресс-факторы, в частности насыщенные жиры и холестерин, способны существенно изменять метаболические процессы в печени, влиять на обмен липидов, синтез, ресинтез жирных кислот (ЖК) и образование липопротеидов [1, 7]. Высокожировая нагрузка способствует аккумуляции липидов в гепатоцитах, что является триггерным механизмом развития стеатоза печени и неалкогольного стеатогепатита [6]. Однако, существуют экспериментальные данные, свидетельствующие о способности алиментарных насыщенных жирных кислот индуцировать экспрессию специфических генов (SREBP, PRAR-a), ответственных за липогенез ЖК и их метаболические превращения, следствием чего становится активация компенсаторного синтеза de novo жирных кислот гепатоцитами [8, 9]. Можно предположить, что в ответ на высокожировую нагрузку в печени реализуются два противоположных по своей физиологической роли процесса: накопление поступивших с пищей экзогенных насыщенных липидов и эндогенный синтез моноеновых и поли-ненасыщенных жирных кислот. Противоречивая информация о способности печени адаптироваться к воздействию неблагоприятных алиментарных факторов обосновывает необходимость изучения механизмов, опосредующих модуляцию метаболизма жирных кислот и детерминирующих формирование патологии печени.
Целью работы явилось изучение состава и метаболических превращений жирных кислот полярных и нейтральных липидов печени крыс в условиях алиментарного стресса.
Исследование проводили на 30 половозрелых белых крысах-самцах линии Вистар массой 173±5,6 г. Алиментарный стресс моделировали пролонгированным воздействием на крыс высокожировым рационом. Экспериментальный высокожировой раци-
он включал топленое говяжье сало (19 % от общей массы рациона) и холестерин (ХС, 2 % от общей массы рациона) [5]. Сформировано 3 группы животных по 10 особей в каждой: контрольная группа
- интактные крысы, находившиеся на стандартном рационе питания; опытные группы - животные, содержавшиеся на экспериментальном рационе (90 суток - опытная группа 1; 180 суток - опытная группа 2). Экстракцию липидов из ткани печени проводили по методу Блайя и Дайера [3]. Разделение нейтральных и полярных липидов ткани печени осуществляли методом одномерной микротонкос-лойной хроматографии на пластинках с закрепленным слоем силикагеля. В качестве системы растворителей использовали смесь гексан - диэтиловый эфир - уксусная кислота (80:20:1, по объему). Зоны силикагеля собирали шпателем, элюировали растворителями: триацилглицерины (ТГ), эфиры стеринов (ЭС) - хлороформом, фосфолипиды (ФЛ) - метанолом. Метиловые эфиры ЖК получали по методу Каро и Дубак [4], анализировали на газожидкостном хроматографе Shimаdzu GC-2010 (Япония) с пламенноионизационным детектором. Идентификацию пиков проводили по значениям эквивалентной длины цепи [10]. Результаты выражали в относительных % от суммы ЖК. Использовали расчетные показатели соотношений полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), характеризующие активность ферментов элонгаз и десатураз [2]. Для анализа полученных данных использовалась программа «Statistika». версия 6,1. Статистическую значимость различий средних величин определяли с помощью критерия Стьюдента после проверки на нормальность распределения.
Состав ЖК полярных и нейтральных липидов печени крыс в условиях алиментарного стресса представлен в табл. 1.
Таблица 1
Состав основных ЖК липидов печени крыс в условиях алиментарного стресса, M±m
ЖК, % Фракция липидов Группа контроля, п=10 Опытная 1, п=10 Опытная 2, п=10
14:0 ФЛ 0,28±0,04 0,26±0,03 0,20±0,04
ТГ 0,86±0,09 *0,63±0,03 *0,65±0,05
ЭС 0,58±0,12 ***1,2±0,40 ***0,27±0,03
16:0 ФЛ 20,48±0,47 ***17,56±1,09 19,50±0,27
ТГ 26,47±0,56 ***16,63±0,43 ***19,14±0,47
ЭС 49,65±2,51 ***14,1±4,10 ***11,2±0,61
18:0 ФЛ 18,97±0,67 ***23,73±0,81 19,8±0,56
ТГ 2,45±0,05 3,3±0,20 2,4±0,17
ЭС 6,18±0,38 *4,7±1,20 ***3,68±0,43
18:1п9 ФЛ 4,71±0,19 ***6,0±0,20 ***8,64±0,33
ТГ 28,57±3,06 **34,56±1,09 ***46,06±1,28
ЭС 15,57±1,61 ***54,03±4,66 ***57,7±3,49
18:2п6 ФЛ 13,4±0,44 ***18,2±0,20 **14,9±0,40
ТГ 18,3±0,70 ***27,86±0,61 *16,5±0,22
ЭС 6,85±0,70 ***1,16±0,11 **8,94±0,19
18:3п6 ФЛ 0,22±0,02 ***0,10±0,01 *0,14±0,02
ТГ 0,46±0,03 0,43±0,03 *0,34±0,01
ЭС 0,35±0,15 tr ***0,90±0,01
18:3п3 ФЛ 0,15±0,03 0,10±0,01 0,15±0,05
ТГ 0,72±0,05 ***1,36±0,03 0,71±0,15
ЭС 0,52±0,12 ***0,21±0,08 *0,85±0,19
20:3п9 ФЛ 0,40±0,09 0,25±0,05 0,27±0,08
ТГ 0,34±0,08 tr 0,32±0,06
ЭС tr tr 0,28±0,02
20:3п6 ФЛ 1,35±0,09 ***2,96±0,23 ***2,88±0,23
ТГ 0,46±0,15 *1,03±0,20 0,5±0,06
ЭС 0,88±0,16 ***0,3±0,05
20:4п6 ФЛ 21,86±0,68 *17,23±1,46 *17,5±1,56
ТГ 3,11±0,36 ***1,1±0,05 ***0,78±0,07
ЭС 4,9±0,34 ***1,15±0,28 ***1,2±0,15
20:5п3 ФЛ 0,57±0,05 0,6±0,05 0,69±0,11
ТГ 0,97±0,13 0,7±0,05 ***0,4±0,07
ЭС 0,18±0,04 *0,11±0,03 0,31±0,10
22:4п6 ФЛ 0,35±0,05 ***0,10±0,01 *0,23±0,02
ТГ 0,38±0,03 0,33±0,03 0,48±0,26
ЭС 0,60±0,01 tr tr
22:5п3 ФЛ 1,03±0,08 1,13±0,08 *0,83±0,08
ТГ 0,98±0,09 ***2,13±0,08 0,85±0,16
ЭС 0,5±0,03 0,63±0,18 0,61±0,07
22:6п3 ФЛ 8,30±0,46 8,50±0,45 8,6±0,97
ТГ 3,08±0,37 4,0±0,30 2,8±0,12
Примечание: в табл. 1 и 2 (*) - статистическая значимость различий относительно контрольной группы: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** -р < 0,001; ^ - менее 0,1 %.
Через 90 суток от начала эксперимента в печени крыс опытной группы 1 в пуле жирных кислот, эте-рифицированых в ЭС, повышалось относительное содержание миристиновой кислоты (14:0), уровень пальмитиновой кислоты (16:0) снижался во всех исследуемых фракциях липидов. Доля стеариновой кислоты (18:0) повышалась в ФЛ и снижалась в
ЭС. Метаболические превращения ПНЖК через 90 суток эксперимента были направлены на компенсаторное увеличение синтеза 18:1п9, 20:5п3, 20:3п6, поддержание гомеостаза эссенциальных 18:2п6, 18:3п3. При этом 20:5п3 этерифицировались преимущественно в ЭС, 20:3п6 - в ТГ и ФЛ. Обнаружено увеличение доли докозапентаеновой (22:5п3)
ПНЖК в ТГ, что, по-видимому, необходимо для сохранения пула данной ЖК в клеточных и тканевых субстратах, синтеза оксилипинов. Выявленное перераспределение физиологически важных ЖК между фракциями полярных и нейтральных липидов, характеризующееся замещением п3 ПНЖК в фосфолипидах на п6 ПНЖК, указывает на приоритетный синтез простаноидов 2-й серии (простагландины -ПГЕ2, тромбоксаны - ТХА2 и ТХВ2) и лейкотриенов 4-й серии (ЛТВ4). Данное предположение подтверждается снижением доли во всех исследуемых фракциях липидов предшественника этих эйкозанойдов
- арахидоновой кислоты (20:4п6). Повышенный уровень олеиновой кислоты (18:1п9) обнаруживался в ФЛ, ТГ и ЭС. Выявленный факт на фоне истощения стеариновой кислоты свидетельствует
о повышении активности Д9-десатуразы, осуществляющей метаболические превращения 18:0 ^ 18:1п9. Об активации процесса А9 десатурации ЖК при высокожировом рационе свидетельствуют данные других авторов [8].
Для анализа метаболических превращений ЖК и оценки активности ферментов, участвующих в метаболизме ЖК, использованы показатели соотношений их отдельных представителей [2]. Об активности элонгаз судили по соотношению 18:2п6/20:4п6. Анализ взаимоотношений ЖК предшественников и ингибиторов синтеза эйкозаноидов в данном исследовании осуществляли по соотношениям 20:4п6/22:6п3 и 20:4п6/20:5п3. Для оценки активности Д5 десатуразы использовали соотношение 20:4п6/20:3п6, активность ферментов последнего этапа биосинтеза жирных кислот оценивали по соотношению 22:6п3/22:5п3. Результаты эксперимента показали увеличение соотношения 18:2п6/20:4п6 во всех исследуемых фракциях липидов печени, что косвенно указывает на активацию процесса элонгации ЖК (табл. 2). Показатели превращений ЖК, характеризующие активность ферментов десатураз, снижались у крыс опытной группы 1 по сравнению с контрольной группой. Выявлено снижение соотношения 20:4п6/20:3п6 и 20:4п6/20:5п3, что указывает на угнетение активности Д5-десатуразы и ферментов последнего этапа биосинтеза ЖК. Соотношение 22:6п3/22:5п3 увеличивалось только в ЭС, свидетельствуя об ингибировании синтеза оксилипинов из п3 ПНЖК. Снижение расходования п3 ПНЖК в циклооксигеназных и липооксигеназных реакциях образования оксилипинов способствует сохранению физиологического баланса полиеновых ЖК и поддержанию структурно-функциональных свойств цитомембраны [2].
Через 180 суток высокожировой нагрузки (опытная группа 2) в пуле ЖК печени выявлено понижение уровней 14:0, 16:0 и 18:0 в ЭС относительно контрольной группы (табл. 1). Доля этих
ЖК не изменялась во фракции ФЛ. В ТГ снизилась концентрация 14:0 и 16:0. Фосфолипиды печени крыс опытной группы 2 имели низкую концентрацию кислот 18:3п6, 22:4п6, 22:5п3. В ТГ выявлялось снижение доли 18:2п6, 18:3п6, 20:5п3, 22:6п3 по сравнению с контрольной группой. Уменьшение содержания у-линоленовой кислоты в ТГ и ФЛ сопровождалось повышением ее доли в ЭС, что возможно является условием сохранения гомеостаза этой ЖК в клетках. Особенностью ЭС на 180 сутки высокожировой нагрузки стало увеличение содержания 18:2п6 и 18:3п3. Дефицит 20:4п6 обнаруживался во всех исследуемых фракциях липидов, тогда как доля олеиновой кислоты, напротив, повышалась. Активность Д5-десатуразы в печени снижалась через 180 суток эксперимента, что на фоне повышения соотношения 22:6п3/22:5п3 - показателя активности ферментов синтеза вазоактивных эйкозаноидов, возможно и явилось причиной дефицита 20-22 п6 и п3 ПНЖК (табл. 2). Наблюдалось снижение соотношения 18:2п6/20:4п6 по сравнению с опытной группой 1 за счет ингибирования процесса элонгации ЖК. Установленное снижение в липидных фракциях ПНЖК подтверждает предположение о нарушении метаболизма этих компонентов.
Таким образом, воздействие на крыс высокожировой нагрузки в течение 90 суток стимулирует компенсаторный синтез длинноцепочечных ПНЖК в печени, что приводит к увеличению уровней олеиновой, эйкозапентаеновой, дигомо-у-линоленовой кислот. Выявленный факт на фоне приоритетной этерификации п3 ПНЖК в нейтральные липиды является важным адаптационным механизмом липидного метаболизма и поддержания гомеостаза физиологически важных ЖК в условиях дефицита их алиментарного поступления. Срыв компенсаторных процессов в метаболизме ПНЖК в печени наблюдался на 180-е сутки эксперимента. В печени крыс снижалась активность элонгаз и Д5-десатуразы. Это способствовало угнетению образования высоконенасыщенных длинноцепочечных жирных кислот семейства п3 и п6. Подобного рода модификация состава ЖК может приводить к нарушению физико-химических свойств цитомембран, увеличению их микровязкости [2]. При заболеваниях печени выявленные изменения состава ЖК мембран гепатоцитов провоцируют нарушение их функциональной активности и, в крайнем своем проявлении, некроз клеток, являясь главной причиной запуска процессов фиброгенеза [1]. Полученные данные свидетельствуют, что характер модификации жирных кислот липидов печени отражает формирование адаптационных и патологических изменений ткани печени как взаимосвязанных процессов.
Таблица 2
Показатели метаболических превращений ЖК в печени крыс в условиях алиментарного стресса, M±m
Показатели Группа контроля, n=10 Опытная 1, n=10 Опытная 2, n=10
Фракция фосфолипидов
18:2n6/20:4n6 0,61±0,03 **1,05±0,04 **0,85±0,02
22:6n3/22:5n3 8,07±0,43 7,33±0,37 *10,1±0,74
20:4n6/22:6n3 2,70±0,23 2,06±0,27 2,84±1,13
20:4n6/20:3n6 16,78±1,23 ***5,93±0,95 ***6,33±1,84
20:4n6/20:5n3 45,15±4,63 ***29,6±1,34 ***23,0±1,70
Фракция триацилглицеридов
18:2n6/20:4n6 5,88±0,11 ***25,3±1,9 ***21,1±2,30
22:6n3/22:5n3 3,16±0,08 ***1,86±0,17 2,82±0,11
20:4n6/22:6n3 1,25±0,08 ***0,26±0,03 ***0,28±0,03
20:4n6/20:3n6 9,06±1,01 ***1,06±0,14 ***1,61±0,07
20:4n6/20:5n3 5,3±0,70 ***1,56±0,18 ***1,93±0,25
Фракция эфиров стеринов
18:2n6/20:4n6 1,39±0,11 ***13,18±1,21 ***7,45±0,37
22:6n3/22:5n3 2,05±0,05 ***3,8±0,20 ***3,83±0,68
20:4n6/22:6n3 8,88±0,75 ***1,4±0,40 ***2,56±0,78
20:4n6/20:3n6 6,86±1,81 ***1,4±0,40 4,62±0,57
20:4n6/20:5n3 38,98±5,34 ***3,84±0,01 ***2,82±0,18
ЛИТЕРАТУРА
1. Рыжинков В.Е. Особенности влияния насыщенных и ненасыщенных жирных кислот на обмен липидов, ли-попротеидов и развитие ишемической болезни сердца / В.Е. Рыжинков // Вопр. питания. 2002. № 3. С. 40-45.
2. Эндакова Э.А. Модификация состава жирных кислот крови при сердечно-сосудистых заболеваниях / Э.А. Эндакова, Т.П. Новгородцева, В.И. Света-шев. Владивосток: Дальнаука, 2002. 296 с.
3. Bligh E.G. A rapid method of total lipid extraction and purification / E.G. Bligh, W.J. Dyer // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. Vol. 37, № 8. P. 911-917.
4. Carreau J.P. Adaptation of a macroscale method to the microscale for fatty acid methyl transesterification of biological lipid extract / J.P. Carreau, J.P. Duback // J. Chromatogr. 1978. Vol. 151, № 3. P. 384-390.
5. Fan J. Effect of low-calorie diet on steatohepatitis in rats with obesity and hyperlipidemia / J. Fan // World J. оf Gastroenterology. 2003. № 9(9). P. 2045-2049.
6. Gentile C.L. The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease / C.L. Gentile, M.J. Pagliassotti // J. Nutr. Biochem. 2008. № 19. P. 567-576.
7. Gibbons G.F. Synthesis and function of hepatic very-low-density lipoprotein / G.F. Gibbons, D. Wiggins, A.M. Brown // Biochem. Soc. Trans. 2004. № 32. P. 59-64.
8. Oostervee M.H. High Fat Feeding Induces Hepatic Fatty Acid Elongation in Mice / M.H. Oostervee. TH. van Dijk, U.J. Tietge // PLoS One. 2009. N 4(6). Published online 2009 June 26.
9. Postic C. Contribution of de novo fatty acid synthesis to hepatic steatosis and insulin resistance: lessons from genetically engineered mice / C. Postic, J. Girard // J. Clin. Invest. 2008. № 118. P. 829-838.
10. Stransky K. An improved method of characterizing fatty acids by equivalent chain length values / K. Stransky, T. Jursik, A. Vitek // J. High. Res. Chromatogr. 1992. Vol. 15. P. 730-740.
T.P. Novgorodseva1, Yu.K. Karaman1, T.A. Gvozdenko1, N.V. Zhukova2
composion of the fatty acids in rats liver under the alimentary stress condition
1 Vladivostok Affiliation of Far Eastern Research Centre for Physiology and Respiratory Pathology of SB RAMS -Institute of Medical Climatology and Rehabilitative Treatment, Vladivostok institute of marine biology of name A.V. Zhirmunskogo FEB RAS
The research studies composition and metabolic transformations of the fatty acids ether sterol, phospholipids, and triacylglycerides in the liver of Wistar rats under the alimentary stress condition. The increase of 18:1n9, 20:5n3, 20:3n6 quantity in the rats’ liver was registered after 90 days of the alimentary stress modeling. On the 180th day of experiment we observe 18:3n6, 22:4n6, 22:5n3 pool exhaustion in phospholipids fraction, 18:2n6, 18:3n6, 20:5n3, 22:6n3 - in the triacylglycerides and decrease of the 20:4n6 level in the all observing fractions. The revealed modification of the fatty acids composition in the rats’ liver under the alimentary stress reproduces formation of adaptive and pathological liver changes.
Key words: fatty acids, liver, stress.
Адрес для переписки: e-mail: karaman@inbox.ru
