CC BY
23
сопоставление цитогенетических повреждений в группах вольных миелопролиферативными неоплазиями в зависимости от наличия или отсутствия мутации V617F в гене JAK2
С.Н. Колюбаева, А.С. Поляков, А.В. Киссель, Л.А. Мякошина, Н.А. Викторова, С.С. Ушанов, А.А. Титова, А.М. Иванов, Я.А. Носков, С.Г. Бологов, С.В. Воронин Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт Петербург, Россия
Comparison of cytogenetic damage in groups of patients with myeloproliferative neoplasms, depending on the presence or absence of V617F mutation in JAK2 gene
S.N. Kolubaeva, A.S. Polyakov, A.V. Kissel, LA. Myakoshina, NA. Viktorova, S.S. Ushanov, AA. Titova, A.M. Ivanov, YaA. Noskov, S.G. Bologov, S.V. Voronin S.M. Kirov Military Medical Academy, Saint Petersburg, Russia
Миелопролиферативные неоплазии — это заболевания, которые характеризуются клональной пролиферацией ми-елоидного ростка костного мозга. К настоящему времени описан ряд генетических маркеров миелопролиферативных неоплазий, включая JAK2v617f. Однако природа нарушений в клетках предшественницах миелоидного ряда остается по-прежнему не ясной. В настоящем исследовании проведен сравнительный анализ цитогенетических поломок у пациентов с миелопролиферативными неоплазиями с выявленной мутацией JAK2v617f и без данной поломки. Исследование показало, что значимого различия по количеству и разнообразию клональных поломок в обеих группах не получено. Учитывая небольшое число пациентов с клональными клетками, можно полагать, что анализ ци-тогенетических повреждений при миелопролиферативных неоплазиях не является диагностически значимым.
Ключевые слова: миелопролиферативные неоплазии, истинная полицитемия, эссенциальная тробмоцитемия, первичный миелофиброз, JAK2v617f, цитогенетический анализ.
Введение
Основную трудность в диагностике миелопролиферативных неоплазий (МПН) представляют часто незначительное или вовсе отсутствующее изменение гематологических показателей в дебюте заболевания и медленное прогрессирование других патологических изменений. Именно поэтому большие надежды возлагаются на поиск генетических и моле-кулярно-генетических маркеров этих заболеваний.
МПН характеризуются клональной пролиферацией миелоидного ростка кроветворения. Значительное увеличение эритроидных клеток характерно для истинной полицитемии (ИП), избыток продукции тромбоцитов — для эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ), миелоидная метаплазия и реактивный фиброз костного мозга характерны для первичного миело-фиброза (ПМФ). При этом возможны изменения в интерпретации клинико-лабораторных данных с течением времени в пользу той или иной формы МПН, а также прогрессия МПН в острый миелоидный лейкоз [1].
Как правило, при рутинном цитогенетическом исследовании встречаются как сбалансированные рекуррентные аномалии, так и, в несколько раз чаще — несбалансированные мутации. Полное отсутствие цитогенетических аномалий также считается специфичным для МПН. Однако, характер цитогенетических повреждений может быть связан с формой или стадией заболевания. Так, например, установлено, что 2/3 всех цитогенетических аномалий при ИП составляют del(20)(q), +8, +9, del(1)
e-mail: doctorpolyakov@gmail.com
Myeloproliferative neoplasms are diseases characterized by clonal proliferation of myeloid bone marrow. At present, it describes a number of genetic markers myeloproliferative neoplasms, such as JAK2v617f. However the nature of violations in the progenitor cells is still not clear. In this study, a comparative analysis of cytogenetic damage in patients with myeloproliferative neoplasms with a mutation JAK2v617f and without this damage. The study showed that differences in the number and diversity of received clonal damage in both groups was not significant. Given the small number of patients with clonal cells, it can be assumed that cytogenetic analysis diagnostically significant.
Keywords: myeloproliferative neoplasm, polycythemia vera, essential thrombocytosis, myelofibrosis, JAK2v617f, cytogenetic analysis.
(д), с1е!С13)[д]. Для ПМФ типичной считается моно-сомия по хромосоме 7. При ЭТ у 1/3 всех пациентов встречается и9;22)(д34;д11.2), характерная для хронического миелоидного лейкоза, и около 10% от числа всех пациентов с аномалиями приходится на долю с +9 [2]. В 2002 году у больных ИП была обнаружена потеря гетерозиготности в локусе (9) (д24), которая наблюдалась как в миелоидном, так и в лимфоидном ростке. Данный факт подтвердил высказанное ранее мнение о том, что при МПН малиг-низированная клетка-предшественница сохраняет способность дифференцироваться по всем росткам кроветворения. Кроме того, потеря гетерозиготности в локусе (9)(д24) при МПН свидетельствовала о том, что с 9 хромосомой может быть связан один из молекулярных дефектов, лежащих в основе патогенеза этих заболеваний. Исследование цитогенетических аномалий 9 хромосомы при МПН показало, что эти дефекты возникают в соматических клетках и не передаются по наследству. Классические МПН и некоторые другие менее распространенные МПН являются приобретенными, спорадическими нарушениями гемопоэза, однако, известны и схожие по развитию с МПН наследственные заболевания — семейные эритремия и тромбоцитемия.
В 2005 г. у больных, страдающих МПН, была обнаружена точечная мутация в 14 экзоне гена ЛДК2 киназы. В результате этой мутации в псевдокиназ-ном домене ЛН2 белка ЛДК2 аминокислота валин заменяется на фенилаланин в 617 положении (мутация лдк2у617^ [3].
Мутация гена Янус киназы 2 иАК2у617^ выявляется у большей части пациентов с ИП, у 50 % больных с ЭТ и у 40-50 % с ПМФ. Вслед за у небольшого числа иАК2у617^негативных больных, страдающих эритремией, был открыт кластер мутаций гена иАК2 в 12 экзоне (микроделеции и точечные мутации, затрагивающие аминокислотные остатки в положении 537-542 белка иак2) [4]. В связи с этими новыми данными, пересмотрены диагностические критерии ВОЗ, которые были приняты в 2008 г.
Мутация гена JAK2v617f оказалась полезным маркером, при помощи которого можно проводить первичную и дифференциальную диагностику МПН, а также молекулярный мониторинг минимальной остаточной болезни. [3]. Связь уровня аллельной нагрузки с неблагоприятным течением МПН обнаружена разными авторами [5,6] и в настоящее время является общепризнанным фактом.
К сожалению, это не помогло дифференцировать разные формы МПН, хотя мутации Jak2 в экзоне 12 еще не найдены вне диагноза ИП, и ни у одного пациента с ИП пока не обнаружена мутация гена МР1_. Доступность определения новых молекулярных маркеров, возможно, облегчит установление конкретного диагноза. Увеличение абсолютной массы эритроцитов, по критериям ВОЗ, и наличие мутации JAK2v617f позволяют ставить диагноз более чем в 95% случаев ИП. Поскольку чаще не менее чем у 2% пациентов с ИП обнаруживается мутация Jak2 в экзоне 12 и ее аномалии [7], остается неясным, может ли диагноз ИП вообще быть установлен при отсутствии мутации гена Jak2. Случаи с сочетанной мутацией JAK2v617f или МР1_ составляют более 60-70 %. Пациенты, у которых клиническая картина сходна с таковой ИП, но мутация JAK2v617f отсутствует, могут иметь несколько генетических аномалий (мутаций, делеций, включений) в коротком участке Jak2 экзона 12. Эти мутации нарушают пролиферацию и диф-ференцировку клеток способом, близким к таковому при У617Р. Высокая вероятность наличия мутации в значительной степени связана с большим размером селезенки, повышенным числом лейкоцитов, более высокой активностью ЛДГ и более высоким риском развития венозного тромбоза или сердечно-сосудистых осложнений у пациентов с ЭТ или ИП.
Целью настоящей работы было сравнение цито-генетических показателей в двух группах пациентов с МПН. Первая группа, состоящая из 35 пациентов (средний возраст 41 год), у которых не была выявлена мутация Jak2 и вторая, состоящая из 20 пациентов, с выявленной мутацией Jak2 (средний возраст 59 лет). Аллельная нагрузка составила 44%, при этом диапазон ее колебался от 19,1 до 80%.
Материал и методы
В данном исследовании цитогенетические повреждения анализировали в 24-часовой культуре костного мозга в метафазных хромосомах с использованием метода дифференциальной окраски хромосом. Анализ хромосомных повреждений проводили с помощью микроскопа 901 компании М^п, (Япония) при увеличении х1000. Для идентификации нарушений кариотипа использовали международную номенклатуру [8]. Аллельную нагрузку Jak2 в 14 экзоне выявляли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, используя специальные наборы
(Генотехнология, Россия). Амплификацию проводили на амплификаторе ДТ-лайт (ДНК-технология, Россия).
Статистический анализ полученных данных выполнен с применением программ Microsoft Ехсе1 7.0 и Statistics 6.0. В работе использовали методы описательной статистики; для оценки статистической значимости различий показателей применяли t-критерий Стьюдента и точный критерий Фишера, корреляционный анализ.
Результаты и обсуждение
Для обеих групп характерно количество полиплоидных клеток, превышающее значение в нормальной популяции. Кроме того, количество пациентов, у которых выявлены клоны, статистически не отличалось в обеих группах (p>0,05). Так, в группе с отсутствием соматической мутации Jak2 доля пациентов, у которых выявлены клональные клетки, составил 17,1%. В спектр выявленных изменений вошли два случая с трисомией по Х-хромосоме, два случая с делецией (6)(q23), и по одному случаю с делецией q-плеча хромосомы 20 и делецией (13)(q34). У остальных пациентов встречались клетки с различными некло-нальными повреждениями, среди которых выявлены делеции, транслокации, моносомии и трисомии по различным хромосомам. В 10% случаев из общего числа пациентов выявлен нормальный кариотип. У остальных — высокий показатель поврежденных клеток, составляющий от 3 до 10%.
В группе пациентов, у которых был выявлен му-тантный ген Jak2, цитогенетические клональные повреждения составили 17,6%, в которые вошли трисомии по Х хромосоме, делеции (6)(q23). Доля клеток с повреждениями неклонального характера, как и в группе с отсутствием мутаци Jak2, колебалась в пределах 10%.
Кроме того, в обеих исследованных группах встречались метафазные клетки, содержащие эндомитозы и различные неклональные транслокации. Это в свою очередь, является подтверждением радиационного воздействия, которое наблюдалось до начала формирования заболевания и, возможно, явилось пусковым механизмом начала заболевания.
Таким образом, по цитогенетическим показателям обе группы практически не отличались. Кроме того, клональные повреждения встречались крайне редко, при этом доля метафазных клеток колебалась в пределах 3—10%.
Анализируя полученные данные, можно сделать следующие выводы.
1. Частота выявления цитогенетических повреждений при цитогенетическом обследовании пациентов с МПН невысока, клональные изменения были выявлены в 17% всех случаев.
2. Высокий уровень аллельной нагрузки мутации V617f в гене JAK2, составивший 44%, демонстрирует потенциально высокую значимость количественного исследования не только для диагностики, но и для оценки прогрессирования и ответа на терапию.
3. Статистически значимых различий в отношении признаков радиационного повреждения в обеих группах больных не обнаружено.
4. По совокупности полученных данных можно подтвердить, что анализ цитогенетических повреждений при МПН по-прежнему не имеет высокого диагностического и прогностического значения.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Tefferi A., Vardiman J.W. Classification and of myeloproliferative neoplasms: Tye 2008 World Health Organization criteria and point of care diagnostic algotryms. Leukemia 2008; 22: 14-22.
2. Heim S., Mitelman F. Chronic myeloproliferative neoplasms. In: Cancer Cytogenetics, third edition. Canada: Wiley-Blackwell; 2009; p. 209-32.
3. Kaushansky K. The chronic myeloproliferative disorders and mutation of JAK2: Damesh ek's 54 year old speculation comes of age. Best Pract. Res. Clin. Haematol. 2007; 20: 5-12.
4. Scott L.M., Tong W., Levine R.L. et al. JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. N. Engl. J. Med. 2007; 356: 459-68.
5. Nussenzveig R.H., Swierczek S.I., Jelinek J. et al. Polycythemia vera is not initiated by JAK V617F mutation. Exp. Hematol. 2007; 35: 32-8.
6. Theocharides A., Boissinot M., Girodon F. et al. Leukemic blasts in transformed JAK2V617F-positive myeloproliferative disorders are frequently negative for the JAK2V617F mutation. Blood 2007; 110: 375-79.
7. Pietra D., Li S., Brisci A. et al. Somatic mutations of JAK2 exon 12 in patients with JAK2 [V617F)-negative myeloproliferative disorders. Blood 2007; 111: 1686-89.
8. Eds. L. Shaffer, N. Tommerup. An international system for human cytogenetic nomenclature. In: Recommendations of International Standing Commitee on Human Cytogenetic Nomenclature. Basel: S. Karger; 2013.
Поступила: 10.07.2016
