CC BY
11
Таким образом, в эксперименте показано, что на плотной питательной среде со смешанным гидролизатом эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц формировались полноценные колонии возбудителя бруцеллеза через 48 ч культивирования и,
следовательно, данный гидролизат может применяться в качестве добавки, стимулирующей рост бруцелл, к питательным средам, применяемым в диагностических и исследовательских работах, а также в производстве бактериальных препаратов.
Курилова Анна Алексеевна - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией питательных сред для культивирования микроорганизмов 1-1У групп патогенности; Катунина Людмила Семеновна - кандидат биологических наук, врач-бактериолог лаборатории питательных сред для культивирования микроорганизмов ЫУ групп патогенности; ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора.
Сизоненко Марина Николаевна - кандидат биологических наук, научный сотрудник межкафедральной научно-образовательной лаборатории экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобио-технологии; Тимченко Людмила Дмитриевна - доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий межкафедральной научно-образовательной лабораторией экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии; Ржепаковский Игорь Владимирович - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник межкафедральной научно-образовательной лаборатории экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии; Институт Живых Систем, Северо-Кавказский федеральный университет.
Ковтун Юрий Сергеевич - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории питательных сред для культивирования микроорганизмов ЫУ групп патогенности; Сердюк Наталья Сергеевна -кандидат биологических наук, биолог лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов»; Коняева Ольга Александровна - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией биомоделей; Жилченко Елена Борисовна - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией «Коллекция патогенных микроорганизмов»; Жаринова Нина Вадимовна - кандидат биологических наук, биолог лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов»; ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора.
УДК 616.13-004.6:579.61
Царёв В.Н.1, Николаева Е.Н.1, Ипполитов Е.В.1, Витович М.В.12, Подпорин М.С.1
1ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава РФ, НИМСИ и кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии, Москва, Россия
2ФБУН «Государственный научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева» Минздрава РФ, Институт коронарной и сосудистой хирургии, Москва, Россия
СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СКАНИРУЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШЕК И МОДЕЛИРОВАНИЯ МИКРОБНЫХ БИОПЛЕНОК IN VITRO
Разработана и апробирована методика моделирования биопленок в биорекаторе с последующей сканирующей микроскопией образцов, которая позволяет выявить ранее неопределяемые виды микробиоты в атероскле-ротических бляшках и стенках кровеносных сосудов в достаточных количествах для идентификации и изучения их свойств. Выделение жизнеспособных представителей пародонтопатогенных и других патогенных видов мик-робиоты в стенках кровеносных сосудов и атеросклеротических бляшках человека подтверждает их роль в развитии атеросклеротического процесса.
Ключевые слова моделирование биопленок, биореактор, сканирующая электронная микроскопия, атеро-склеротические бляшки.
ИСТОРИЯ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ СЛУЖБЫ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ
Tsarev V.N.1, NikolaevaE.N.1, IppolitovE.V.1, VitovichM.V.1,2, PodporinM.S.1
Moscow State Medical and Dental University named after A. I. Evdokimov of the Ministry of Health of the Russian Federation, NIMSI and the Department of Microbiology, Virology, Immunology, Moscow, Russia
2State Scientific Center of Cardiovascular Surgery named after A. N. Bakulev of the Ministry of Health of the Russian Federation, Institute of Coronary and Vascular Surgery, Moscow, Russia
COMPARISON OF ATHEROSCLEROTIC PLAQUES SCANNING ELECTRON MICROSCOPY RESULTS WITH MICROBIAL BIOFILMS MODELING OUTPUT IN VITRO
A technique for modeling biofilms in a bioreactor with subsequent scanning microscopy of samples has been developed and tested, which allows identifying previously undetectable types of microbiota in atherosclerotic plaques and blood vessel walls in sufficient quantities to identify and study their properties. The isolation of viable representatives of periodontopathogenic and other pathogenic types of microbiota in the walls of blood vessels and atherosclerotic plaques of a person confirms their role in the development of the atherosclerotic process.
Keywords: biofilm modeling, bioreactor, scanning electron microscopy, atherosclerotic plaques.
В настоящее время считается, что вирусы, некоторые резидентные и патогенные микробы, их метаболиты и эндотоксины, колонизирующие слизистые оболочки организма человека в норме и при сопутствующей патологии могут участвовать в развитии атеросклероза, ишемической болезни сердца (ИБС) и заболеваний периферических сосудов. Однако точные механизмы этих процессов и их связь с микробным фактором остаются до конца не доказанными [1, 2, 4, 5].
Ранее многими авторами были выявлены ДНК пародонтопатогенных бактерий в участках атеросклеротического повреждения, в то время как живых микробов удалось выделить только в экспериментальных моделях на животных. Вместе с тем, современные метагеном-ные исследования свидетельствуют о наличии в атеросклеротических бляшках генетических маркеров не только возбудителей воспалительных заболеваний полости рта, но и других клинически важных инфекций, в том числе кишечной и мочеполовой систем [1, 5, 6, 7].
В связи с этим целью нашей работы являлись pазработка и апробация методики моделирования микробных биопленок на основе технологии текучих сред в анаэробных условиях, для выявления микробиоты в атероскле-ротических бляшках кровеносных сосудов.
Материалы и методы исследования. Во время плановой операции коронарного шунтирования у 60 чел. (53 мужчины и
7 женщин) в возрасте от 50 до 70 лет проведено взятие фрагментов артериальных сосудов с атеросклеротическими бляшками. В условиях стерильного бокса были асептически отобраны участки сосудов с атеросклеротическими поражениями, которые разрезали в стерильных условиях на отдельные участки. Образцы материала разделяли на 3 порции, каждую из которых помещали в:
1) транспортную систему со средой Amies Transport для проведения культураль-ных бактериологических исследований и сканирующей электронной микроскопии,
2) пробирку Эппендорфа для ПЦР-диагностики,
3) пробирку с 10 %-ным раствором нейтрального формалина.
Отпечатки фрагментов атеросклероти-ческой бляшки помещали на плотную питательную среду M832 для культурального исследования, и параллельно помещали в жидкую питательную среду M863 для моделирования биопленки в условиях анаэробиоза и движения жидкой фазы (Himedia Labs., Индия).
Для этого, в соответствии с ранее патентованной технологией [3], получение биоплёнки осуществляли в биореакторе. Образец в питательной среде помещали в анаэростат, заполненный безкислородной газовой смесью, который в свою очередь помещали в орбитальный шейкер-инкубатор (биореактор) при
температуре 36,9 °С, скорости движения 90 об/мин. Инкубацию проводили в течение 14 суток. Каждые двое суток делали контрольные высевы на питательные среды для выделения пародонтопатогенных и санитарно-значимых микроорганизмов.
Для контроля стерильности взятия исследуемого материала и условий культивирования проводили посев транспортной среды, в которой были доставлены образцы в лабораторию, на плотную питательную среду М832; чашку Петри с питательной с той же средой и флакон с жидкой питательной средой М863. Полученные культуры пересевали на плотные питательные среды. Результаты обрабатывали статистически с использованием прикладной программы Biostat 9,0.
Результаты исследования и обсуждение. Во флаконах с фрагментами атеросклеро-тических бляшек наблюдалось помутнение питательной среды в биореакторе через 12-24 часа культивирования и наличие осадка на дне флакона. Осадок обильный, в виде крупных рыхлых хлопьев, по консистенции хрупкий.
На поверхности самих культивируемых биоптатов также наблюдался рост микробов, образующих сплошную биопленку. Эти образцы использовали для проведения сканирующей электронной микроскопии на протяжении двухнедельного периода наблюдения до формирования полноценной зрелой биопленки.
Несмотря на то, что в контрольных посевах транспортной среды рост бактерий отсутствовал, на внутренней поверхности интра-операционно фиксированных формалином образцов выявлены единично расположенные бактерии в большинстве случаев, реже -дрожжевых грибов. Через 24 часа культивирования видны единичные бактерии и их скопления, а также бактерии, покрытые гомогенным веществом (начало формирования мантии). Бактерии овоидной и палочковидной формы. Размеры от 1,90 до 2,50 мкм. Увличе-ние 6000х - 8000х.
На вторые сутки выявлены участки с микроколониями бактерий и/или дрожжевых грибов. Выявлены участки с отдельно лежащими бактериями, частично покрытые экзо-клеточным матриксом.
На 4-е сутки большая часть поверхности сосуда была покрыта биопленкой с выраженной мантией. Большей частью определялась
смешанная биопленка с выраженным внеклеточным матриксом. Отдельные участки оставались со скоплениями бактерий, которые были не покрыты матриксом. При увеличении 10 000х и более отмечались множественные инвагинации клеточной оболочки на свободных от матрикса бактериях.
Следовательно, на поверхностях всех образцов из атеросклеротических бляшек были выявлены многочисленные участки бактериальной биопленки. Они имели смешанный характер, представлены разнообразными морфологическими вариантами микробиоты: бактериями палочковидной, овоидной и кокковой форм, дрожжевыми грибами. При этом прослеживаются разные стадии формирования биопленок, включая адгезию, колонизацию, созревание сложных полимикробных биопленок и их дисперсию.
С помощью молекулярно-биологичес-ких методов исследований в исследуемом материале из атеросклеротических бляшек были выявлены с наибольшей частотой ДНК пиг-ментообразующих пародонтопатогенных бактерий I порядка T. forsythia у 8 (13 %), а P. gingivalis — у 5 (8 %) обследованных пациентов. ДНК A. actinomycetemcomitas определили в 7 (12 %) образцах. Кроме этого у 5 (8 %) человек были выявлены маркеры пародонто-патогенных бактерий II порядка — F. nucleatum; T. denticola, P. micra и Capno-cytophaga spp. имели по 4 (7 %) человека; по 3 (5 %) человека — C. rectus и E. corrodents; у двух человек определили ДНК P. intermedia (3 %) и у 1 — E. Nodatum (2 %). При этом в материале из атеросклеротических бляшек была выявлена ДНК F. nucleatum только у 2 из 7 обследованных женщин. ДНК T. forsythia, P. micra, E. nodatum, E. corrodents и Capno-cytophaga spp. у женщин определили с частотой 1 (2 %).
В ротовой жидкости ДНК P. gingivalis идентифицировали у 20 (33 %) человек из них только у 2 (29 %) женщин. A. Actinomycetemcomitas выявили у 17 (28 %) человек, в том числе у 3 (43 %) женщин; T. forsythia - у 24 (40 %) и лишь у 1 (14 %) женщины. Только у мужчин определили ДНК пародонтопатоге-нов II порядка P. intermedia с частотой 12 (23 %), T. denticola — 14 (23 %), P. micra — 10 (l7 %), C. rectus — 8 (13 %). ДНК F. nucleatum определили у 28 (47 %) человек, включая 2 (29 %) женщин; E. nodatum — у 7 (12 %),
ИСТОРИЯ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ СЛУЖБЫ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ
E. corrodents - у 8 (13 %) и Capnocytophaga spp. - у 30 (50 %). Частота выявления последних трех видов бактерий у женщин составила 1 (14 %).
Всего в атеросклеротических бляшках пародонтопатогены I порядка выявлены у 24 (40 %) человек, при этом у 3 (5 %) обнаруже-
Таким образом, в атеросклеротических бляшках ДНК пародонтопатогенных видов бактерий выявлены у 36 (60 %) больных, из них у 6 (10 %) человек - 2 вида и у 2 (3 %) пациентов 3 и 5 видов пародонтопатогенов.
Результаты определения генетических маркеров некоторых возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний выглядели следующим образом: в 14 (35 %) биоптатах была выявлена ДНК S. aureus, 6 (10 %) - E. faecalis,
2 (3 %) - E. faecium, 5 (8 %) - Streptococcus spp., 3 (5 %) - P. aeruginosa. Маркеры P. anaerobius в материале из атеросклеротиче-ских бляшек не выявлены.
Всего у 22 (37 %) человек в атероскле-ротических бляшках были выявлены ДНК возбудителей нозокомиальных инфекций - энте-ро- и стрептококков, S. aureus, P. aeruginosa и энтеробактерий. При этом 2 вида микробов были обнаружены у 6 (10 %) человек, из них у
3 (5 %) определены P. aeruginosa и S. aureus одновременно, у 2 женщин - кокки -Streptococcus spp. и E. faecalis. Всего в 25 (42 %) атеросклеротических бляшках выявлено по одному виду из представителей рода Candida.
ны маркеры двух видов бактерий. ДНК пародонтопатогенов II порядка выявлена у 17 (28 %) пациентов, из них только у 1 (2 %) мужчины определены 2 вида микробов, а у 1 (14 %) из 7 женщин — 5 видов пародонтопатогенов II порядка при отсутствии пародонтопатогенов I порядка (табл.).
В то же время в ротовой жидкости у 32 (53 %) обследованных нами больных идентифицирована ДНК C. glabrata, в 12 (20 %) образцах - C. albicans или C. parapsilosis, 4 (7 %) - C. guilliermondii и ни в одном образце не выявлена C. krusei. У 1 (14 %) из 7 женщин определена C. glabrata, у другой -C. parapsilosis.
Полученные нами данные частично подтверждают результаты исследований, проводимым с целью определения роли микробов полости рта [Бокерия Л.А. с соавт., 2009, 2011; Koren O., 2011; Hyvarinen K., 2012; Tsarev V.N. et al., 2020; Velsko I.M. et al., 20151 и других видов микробов в этиопатогенезе ССЗ и выявивших определенные ассоциации между этими заболеваниями.
Выводы. Разработанная и апробированная нами методика моделирования биопленок позволяет выявлять ранее неопределяемые виды микробиоты в атеросклеротиче-ских бляшках и стенках кровеносных сосудов в достаточных количествах для идентификации и изучения их свойств, включая толерантность и резистентность к антибактериальным препаратам.
Сравнительная частота выявления пародонтопатогенных видов бактерий в атеросклеротических бляшках и ротовой жидкости
№ п/п Вид микроба Исследуемый материал
Биоптат Ротовая жидкость
Пародонтопатогены I порядка
1 P. gingivalis 5 (8 %) 20 (33 %)
2 A. actinomycetemcomitans 7 (12 %) 17 (28 %)
3 T. forsythia 8 (13 %) 24 (40 %),
Пародонтопатогены II порядка
4 P. intermedia 2 (3 %) 12 (23 %)
5 T. denticola 4 (7 %) 14 (23 %)
6 P. micra (P. micros) 4 (7 %) 10 (17 %)
7 F. nucleatum /periodonticum 5 (8 %) 28 (47 %)
8 C. rectus 3 (5 %) 8 (13 %),
9 E. nodatum 1 (2 %) 7 (12 %)
10 E. corrodents 3 (5 %) 8 (13 %)
11 Capnocytophaga spp. 4 (7 %) 30 (50 %)
Выделение жизнеспособных, ранее неопределяемых видов микробиоты в стенках кровеносных сосудов и атеросклеротических бляшках человека вследствие ограничения их распространения факторами неспецифической
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1.Бокерия Л.А. Результаты бактериологического исследования у пациентов, перенесших операцию на открытом сердце / Л.А. Бокерия, М.А. Саркисян, В. Н. Царев [и др.] // Медицина критических состояний. 2009. № 4. С. 15-20.
2.Бокерия Л.А. Разработка молекулярно-генетических методов диагностики и антибактериальной профилактики инфекционного эндокардита одонтогенной природы / Л.А. Бокерия, В.Н. Царёв, Е.Н. Николаева [и др.] // DentalForum. 2011. № 1 [37]. С. 6-9.
3. Способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro / Е.В. Ипполитов, В.Н. Царёв, С.Д. Арутюнов [и др.]. Патент RU № 2619169, действ. с 20.11.2015.
4.Koren O. Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2011. Vol. 1. P. 4592-4598.
5.Hyvarinen K. A common periodontal pathogen has an adverse association with both acute and stable coronary artery disease / K. Hyvarinen, P. Mantyla, K. Buhlin [et al.] // Atherosclerosis. 2012. Vol. 223 (2). P. 478-484.
6.Tsarev V.N. Identification of biofilm-forming microbes in atherosclerotic plaques in patients with cardiovascular diseases / V.N. Tsarev, E.N. Nikolaeva, M.V. Vitovich Process Management and Scientific Developments". Birmingha m, UK. 2020; 90-7.
7.Velsko I.M. Periodontal pathogens invade gingiva and aortic adventitia and elicit inflammasome activation in avp6 integrin-deficient mice / I.M. Velsko, S.S. Chukkapalli, M.F. Rivera-Kweh [et al.] // Infection and Immunity. 2015. Vol. 83 (12). P. 4582-4593.
резистентности и иммунной системы организма человека in vivo, представляет новые доказательства прямого и опосредованного участия микробиоты в этиопатогенезе сердечнососудистых заболеваний человека.
REFERENCES
1. Bokeriya L.A. Rezul'taty bakteriologicheskogo issledovaniya u pacientov, perenesshih operaciyu na otkrytom serdce / L.A. Bokeriya, M. A. Sarkisyan, V. N. Carev [i dr.] // Medicina kriticheskih sostoyanij. 2009. № 4. S. 15-20.
2. Bokeriya L.A. Razrabotka molekulyarno-geneticheskih metodov diagnostiki i antibakterial'noj profilaktiki infekcionnogo endokardita odontogennoj prirody / L.A. Bokeriya, V.N. Caryov, E.N. Nikolaeva [i dr.] // Dental Forum. 2011. № 1 [37]. S. 6-9.
3. Sposob formirovaniya smeshannoj bioplenki parodontopatogennyh anaerobnyh bakterij v usloviyah tekuchih sred in vitro / E.V. Ippolitov, V.N. Caryov, S.D. Arutyunov [i dr.]. Patent RU № 2619169, dejstv. s 20.11.2015.
4. Koren O. Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2011. Vol. 1. P. 4592-4598.
5. Hyvarinen K. A common periodontal pathogen has an adverse association with both acute and stable coronary artery disease / K. Hyvarinen, P. Mantyla, K. Buhlin [et al.] // Atherosclerosis. 2012. Vol. 223 (2). P. 478-484.
6. Tsarev V.N. Identification of biofilm-forming microbes in atherosclerotic plaques in patients with cardiovascular diseases / V.N. Tsarev, E.N. Nikolaeva, M.V. Vitovich Process Management and Scientific Developments". Birmingha m, UK. 2020; 90-7.
7. Velsko I.M. Periodontal pathogens invade gingiva and aortic adventitia and elicit inflammasome activation in avß6 integrin-deficient mice / I.M. Velsko, S.S. Chukkapalli, M.F. Rivera-Kweh [et al.] // Infection and Immunity. 2015. Vol. 83 (12). P. 4582-4593.
Царёв Виктор Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, директор Научно-исследовательского медико-стоматологического института «НИМСИ», зав. кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава РФ. Николаева Елена Николаевна - доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории молекулярно-биологических исследований Научно-исследовательского медико-стоматологического института «НИМСИ» профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава РФ. Ипполитов Евгений Валерьевич - доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярно-биологических исследований Научно-исследовательского медико-стоматологического института «НИМСИ», профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава РФ. Витович Марина Владимировна - аспирант, старший лаборант кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава РФ, врач ФБУН «Государственный Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева» Минздрава РФ, Институт коронарной и сосудистой хирургии. Подпорин Михаил Сергеевич -кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории молекулярно-биологических исследований Научно-исследовательского медико-стоматологического института «НИМСИ», ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава РФ.
