CC BY
58
Общая биология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 52-58
УДК 581.12
СООТНОШЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ В МОЛОДОМ И ЗРЕЛОМ ЛИСТЕ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ
© 2011 г. Е.В. Гармаш, Р.В. Малышев, Т.К. Головко
Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН
garmash@ib. komisc.ru
Поступила в редакцию 12.01.2011
Исследованы возрастные изменения дыхания и соотношения дыхательных путей третьего листа яровой пшеницы (ТтШсыш авзйтш L.). Выявлено снижение скорости поглощения О2 и увеличение доли альтернативного пути в дыхании зрелого листа. Обнаружена активация нефосфорилирующих путей в меристематически активной базальной части молодого листа. Установлена связь между тепловыделением и альтернативным дыханием.
Ключевые слова: ТтШсыш авзйтш, лист, возраст, дыхание, дыхательные пути, альтернативный путь, теплопродукция, рост.
Введение
В растении лист занимает особое положение как специализированный орган фотосинтеза. Он не только обеспечивает гетеротрофные части и ткани восстановленным углеродом, но играет важную роль в энергетическом обмене целого растения. Около 40% энергии, запасенной зелеными листьями в химических связях конечных продуктов фотосинтеза, извлекается в процессе дыхания и используется на рост и поддержание целостности клеточных структур и их функциональной активности [1]. При этом часть энергии, заключенной в дыхательном субстрате, неизбежно рассеивается в форме тепла [2].
Известно, что дыхание листа снижается с возрастом, что связано с уменьшением в нем доли меристематически активных тканей, снижением метаболичексой активности и завершением ростовых процессов [1, 3, 4]. Представления о возрастных изменениях дыхательных путей окончательно не сформированы. В растительных митохондриях, дополнительно к основному транспорту электронов через цито-хромоксидазу (ЦП), функционирует нефосфо-рилирующий альтернативный путь (АП) через цианидустойчивую альтернативную оксидазу [5, 6].
Полагают, что возрастной ход дыхания листа определяется преимущественно снижением способности ЦП и увеличением доли АП [4, 7]. Вместе с тем, дыхание молодых листьев зимнезеленых растений отличалось более высокой активностью и вовлечением АП по сравнению
со зрелыми [8, 9]. Показаны также изменения активности митохондриальных оксидаз у завершившего рост зрелого листа [10]. Возможно, что противоречивость имеющихся в литературе данных связана с разной жизненной формой и стратегией развития растения.
Среди зерновых культур пшеница занимает особое место в обеспечении питания населения [11-13]. Формирование урожая яровой пшеницы зависит от прохождения всех этапов однолетнего жизненного цикла. Наиболее важным при выращивании пшеницы в условиях короткого и прохладного вегетационного периода на Севере является второй этап органогенеза, связанный с фено-фазой третьего листа и кущением. В период кущения - выхода в трубку - третий и четвертый листья пшеницы вносят наибольший вклад в фо-тосинтетический потенциал главного побега [13].
Цель работы - изучение возрастной динамики дыхания третьего листа яровой пшеницы, выявление вкладов цитохромного и альтернативного путей и рассмотрение их физиологической роли в разных частях пластинки молодого и зрелого листа.
Методика
Исследования проводили в 2007-2009 гг. Растения яровой пшеницы (ТгШеыт авзИуиш L.) с. Иргина выращивали в полевых условиях на делянках площадью 6 м2 вблизи г. Сыктывкара (610 40 с. ш.). Почва опытного участка - типичная подзолистая, сформированная на покровных суглинках, средней степени окультуренности.
Таблица 1
Оценка достоверности различий средних несвязных выборок по ^-критерию Стьюдента
Параметр Возраст листа (рис. 1) Части листа (рис. 4, 5)
молодой лист зрелый лист
1-2 1-3 2-3 1-2 1-3 2-3 1-2 1-3 2-3
Общее дыхание (мкл О2/г ч) 4.2* 27.7* 6.7* 2.4* 4.9* 5.4* 7.7* 2.4* 8.2*
Общее дыхание (мкл О2/г белка ч) 2.8* 2.2 0.5 - - - - - -
Цитохромное дыхание, Vcyt 3.1* 9.0* 3.3* 8.3* 8.7* 2.1 11.7* 10.9* 5.6*
Альтернативное дыхание, Vnt 0.3 1.2 1.6 4.1* 0.3 2.6* 2.4* 2.0 3.9*
Остаточное дыхание, V у res 4.4* 6.8* 2.3* 11.7* 8.0* 6.6* 6.3* 9.2* 5.7*
Скорость теплопродукции, q - - - 1.5 2.1 1.8 2.0 1.2 0.8
Примечание: 1-2, 1-3, 2-3 - сравнение среднеарифметических величин (переменных), полученных для листьев разного возраста (рис. 1) и частей листа (рис. 4, 5). Звездочка (*) обозначает достоверность различий между двумя средними при Р < 0.05. Прочерк обозначает отсутствие данных.
Перед закладкой опытов в почву вносили минеральные удобрения из расчета N30P60K60 (кг д.в./га). Посев производили вручную в начале июня.
Рост растений оценивали по накоплению биомассы. Пробы (20-30 растений) разделяли по органам, взвешивали и высушивали до воздушно-сухого состояния при 70°С. Площадь третьего листа (ТЛ) измеряли периодически, с момента появления его кончика из влагалища предыдущего листа, с помощью метода отпечатков на бумаге.
Интенсивность темнового дыхания ТЛ измеряли при 20°С манометрическим методом [14]. Листья отбирали с 10-15 растений. Высечки длиной 3-7 мм из базальной, средней и апикальной частей ТЛ помещали в манометрические сосудики по 250-300 мг свежего материала. Дыхание целого листа характеризовали по скорости поглощения О2 высечками из средней части листа. Интенсивность дыхания выражали в мкл О2/(г сухой массы ч).
Активность терминальных оксидаз определяли с помощью специфических ингибиторов [15]: салицилгидроксамовой кислоты
(SHAM, «Lancaster», США) и NaN3 («ДиаэМ», Украина). Концентрацию ингибитора и длительность инкубации подбирали экспериментально, используя метод «прямого титрования» с возрастающими концентрациями ингибитора до насыщения скорости поглощения О2 [15].
Образцы предварительно инкубировали 20 в растворах SHAM (25 мМ, рН 6.5), NaN3 (5 мМ, рН 4.5), а также в смеси ингибиторов. Затем их помещали в манометрические сосудики, куда
наливали по 2.5 мл раствора ингибитора. Контрольные пробы высечек из ТЛ инкубировали в воде. Показания манометров регистрировали каждые 15 мин в течение 1 ч.
Активность АП находили как разность между дыханием контрольных и инкубированных в растворе SHAM образцов. Остаточное (немитохондриальное) дыхание измеряли при совместном действии ингибиторов (SHAM и NaN3). Активность ЦП рассчитывали как разность между дыханием, устойчивым к действию 25 мМ SHAM, и остаточным поглощением О2.
Скорость теплопродукции (q) разных частей листа измеряли при 20°С с помощью изотермического микрокалориметра Биотест-2 (Россия).
Экстракцию растворимого белка проводили при температуре 4°С в среде, содержащей (мМ): Трис-HCl - 100, pH 8.0, MgCl26H2O - 1, ЭДТА - 4, ДТТ - 5. Гомогенат центрифугировали 15 мин при 15000 g и 4°С. Концентрацию белка определяли по методу, описанному в работе
[16].
Содержание общего азота и углерода в биомассе растений определяли на элементном анализаторе EA-1110 (CHNS-O) (Carlo Erba, Италия).
На рисунках и в таблицах представлены средние арифметические величины со стандартной погрешностью, полученные за трехлетний период исследований. Определения дыхания и тепловыделения проводили в 6-8-кратной, содержания белка, азота и углерода -в трехкратной биологической повторности. Достоверность различий между двумя средними оценивали по t-критерию Стьюдента (табл. 1).
Таблица 2
Возрастная динамика морфофизиологических показателей растений яровой пшеницы
Показатель Дни от посева
20 25 30 35 45
Сухая масса растения, г 0.05 ± 0.003 0.18 ± 0.03 0.30 ± 0.03 0.55 ± 0.04 0.74 ± 0.10
Относительная скорость роста растений, г/г сут 0.17 ± 0.01 0.26 ± 0.05 0.10 ± 0.02 0.12 ± 0.01 0.03 ± 0.01
Площадь листа, дм2/растение 0.011 ± 0.001 0.088 ± 0.003 0.17 ± 0.01 0.22 ± 0.01 -
Доля третьего листа в сухой массе растения 0.17 ± 0.02 0.44 ± 0.05 0.45 ± 0.05 0.32 ± 0.03 -
Корни/побеги по сухой массе 0.24 ± 0.06 0.15 ± 0.04 0.11 ± 0.02 0.12 ± 0.02 0.09 ± 0.02
С/М в растении 11.8 - 13.8 20.0 -
Примечание: прочерк обозначает отсутствие данных.
Рис. 1. Дыхание и соотношение дыхательных путей листа яровой пшеницы: 1 - молодой (неразвернувшийся) лист; 2 - растущий лист; 3 - зрелый лист. Усууу, УЛЬ У1е5 - активности цитохромного, альтернативного и остаточного дыхания соответственно
Результаты и их обсуждение
В период проведения эксперимента (конец июня - начало июля) растения находились на втором этапе органогенеза и накапливали биомассу с относительной скоростью (ОСР), равной около 0.3 г/г в сутки (табл. 2). В фазе третьего листа у пшеницы осуществляется дифференциация основания конуса нарастания на зачаточные узлы, междоузлия и зачатки стеблевых листьев, происходит дифференциация главной оси зачаточного колоса [12]. Площадь ТЛ увеличивалась в соответствии с классической S-образной кривой роста (табл. 2). На долю сформированного ТЛ приходилось около 45% биомассы растения (табл. 1). С появлением ТЛ усиливалось поступление ассимилятов в корни, о чем свидетельствуют высокие значения соотношения корни/побеги и С/М в растении (табл. 2). Известно, что чем выше С/М в тканях, тем больше экспорт углерода в корни
[17]. Формирование ТЛ совпадает с кущением. В этот период развиваются вторичные или узловые корни, рост которых требует постоянного притока ассимилятов. Наши результаты соответствуют представлениям о том, что одной из функций третьего листа является обеспечение ассимилятами первичных и узловых корней пшеницы [12].
Скорость поглощения О2 в молодом ТЛ площадью 10-30% от конечной составляла 4500 мкл/(г-ч). По мере увеличения площади дыхательная способность ТЛ снижалась. Интенсивность дыхания полностью сформировавшегося ТЛ была в два раза меньше, чем молодого. Повышенная скорость дыхания молодых листьев связана с активными процессами роста и интенсификацией оборота белка. По данным [18], повышение скорости синтеза белка наблюдается у листа площадью 10-20% от конечной и снижается, когда лист достигает 70% конечной площади. В этот период максимальная скорость
накопления растворимого белка в ТЛ пшеницы составляла около 17 мг /(г сухой массы-сут) или 3.3 мг/(лист-сут). Поэтому дыхание в пересчете на единицу белка было наибольшим в молодых листьях (рис. 1). Снижение этого показателя с возрастом ТЛ, вероятно, связано с увеличением доли белка фотосинтетического аппарата, в поддержании которого может принимать участие фотосинтез, и/или уменьшением скорости оборота белка [1].
Выявлена прямая зависимость скорости дыхания от концентрации азота (рис. 2), что отражает роль дыхания в синтезе de novo структурной биомассы. Скорость поглощения О2 приближается к нулевому значению при концентрации азота около 5 мг/г сухой массы, характеризующей нижний предел содержания данного элемента в функционирующем листе пшеницы, что свойственно для листьев многих растений [19, 20].
Скорость дыхания ТЛ тесно коррелировала с его ОСР (рис. 3). Наличие линейной связи позволяет рассчитать коэффициенты дыхания поддержания (m) и роста (а) по величине свободного члена уравнения регрессии и наклона кривой соответственно (табл. 3). При расчетах использовали коэффициент перевода количества поглощенного О2 (мл) в эквиваленты дыхательного субстрата (мг глюкозы), равный 1.34 [21, с. 14]. Полученные величины коэффициентов дыхания (табл. 2) близки к верхнему пределу значений, характерных для функционально активных листьев [1, 22].
Как видно на рис. 1 А, дыхание молодого ТЛ было менее чувствительно к действию ингибитора АОХ - SHAM по сравнению со зрелым ТЛ. С возрастом доля АП в дыхании ТЛ
увеличивалась от 40 до 60%. В присутствии смеси ингибиторов остаточное поглощение кислорода листом составляло 10-15% от общего дыхания. Вклад цитохромоксидазы в дыхание молодого ТЛ составлял 40, зрелого - не более 30%. Следовательно, по мере снижения ОСР интенсивность дыхания падала за счет уменьшения активности цитохромного пути как компоненты дыхания роста. Наши данные показывают, что активность ЦП коррелирует с ОСР, тогда как активность АП слабо зависит от ОСР (рис. 3, табл. 3). Это согласуется с представлением о том, что альтернативное дыхание является скорее компонентой дыхания поддержания, чем роста [7].
У яровой пшеницы образование язычка (складка верхнего эпидермиса листа и внутреннего эпидермиса влагалища) начинается только после выхода кончика листа из влагалища предыдущего листа. После образования язычка на границе пластинки и влагалища листовая пластинка растет за счет интеркалярной (вставочной) меристемы, располагающейся в ее основании. Рост листовой пластинки продолжается до тех пор, пока верхушка влагалища с язычком не выйдут из трубки влагалища предыдущего листа. Считается, что клетки на периферии язычка получают световой сигнал и начинают вырабатывать вещества, тормозящие рост листовой пластинки [12]. В результате роста за счет интеркалярной (вставочной) меристемы от основания листа к верхушке создается градиент клеток и тканей с возрастанием уровня диффе-ренцировки. Переход клеток к росту растяжением и дифференцировке сопровождается хло-ропластогенезом и увеличением количества других компонентов [23].
6000
5000
Л 4000 О
о
g 3000
<и
а
2 2000 о
С 1000
(1)у = 6142^+2771 R2= 0,697
(2)у = 683,6х+1704 R2= 0,175
(3)у = 5038,х+646,8 R1= 0,862
0,05
0,25
03
035
0,1 0,15 О,?
ОСР, г/г сут
Рис. 3. Связь между относительной скоростью роста (ОСР) и активностью общего (1), альтернативного (2) и цитохромного дыхания (3) соответственно
Таблица 3
Коэффициенты дыхания роста (а) и дыхания поддержания (от) третьего листа яровой пшеницы
2
3
Дыхание Уравнение линейной регрессии скорости дыхания от ОСР Коэффициент детерминированности, R2 а, г/г m, г/г сут
Общее дыхание y = 6729x + 2665 0.836 0.216 0.086
Альтернативное дыхание у = 683.6х + 1704 0.175 0.022 0.055
Цитохромное дыхание у = 5038х +646.8 0.862 0.162 0.021
Вопрос о возрастных изменениях направления градиента дыхательной активности вдоль листа злаков разработан недостаточно [24], а сведения о влиянии возраста листа на соотношение дыхательных путей в разных частях листовой пластинки отсутствуют.
Мы изучили изменение соотношения дыхательных путей в базальной, средней и апикальной частях формирующегося (20-30% от конечной площади) и зрелого завершившего рост ТЛ пшеницы. Дыхание разных частей и градиент дыхания вдоль листа изменялись с возрастом (рис. 4). Наиболее интенсивно дышали дифференцированные, функционально активные части: у молодого листа - апикальная, у зрелого - средняя. Градиент АП практически не отличался от градиента общего дыхания, но изменялось соотношение дыхательных путей. В базальной части молодого и зрелого ТЛ почти 90% общего дыхания было связано с АП (50-60%) и немитохондриальным дыханием (около 30%) (рис. 4). Базальная часть ТЛ, особенно молодого, характеризовалась более высокой скоростью теплопродукции, чем средняя и верхушечная (рис. 5). Это косвенно может свидетельствовать о том, что АП как способ теплового рассеивания энергии участвует в регуляции баланса между углеводным метаболизмом и скоростью электронного транспорта [25].
Вклад немитохондриального дыхания в поглощение О2 меристематически активной базальной части молодого ТЛ был втрое выше, чем у более дифференцированной части листовой пластинки (рис. 4). Имеются данные, что в растительных и животных клетках устойчивое к действию ингибиторов митохондриальных оксидаз остаточное дыхание включает реакции окисления молекулярным кислородом органических соединений с помощью различных оксидаз в перокси-сомах и на эндоплазматическом ретикулуме [15, 26]. Считается, что немитохондриальное дыхание является важнейшим элементом защитной системы клетки от избытка кислорода.
На наш взгляд, активация немитохондриального и альтернативного дыхания в интенсивно растущей ткани направлена также на обеспечение клеток метаболитами для синтезов de novo за счет поддержания высокой скорости электронного транспорта и низкой скорости образования АТФ. Эта возможная функция нефосфо-рилирующих дыхательных путей требует дальнейшего исследования [9, 25, 27].
Таким образом, выявлены закономерности изменения дыхания и соотношения дыхательных путей с возрастом у третьего листа яровой пшеницы. Установлено, что скорость дыхания молодого интенсивно растущего листа была почти вдвое выше по сравнению со зрелым функционально активным листом и составляла
Рис. 4. Дыхание и соотношение дыхательных путей в разных частях третьего молодого (а) и зрелого листа яровой пшеницы (б). 1, 2, 3 - базальная, средняя, апикальная части соответственно; ycyt, УЛЬ Vres - активность цитохромного, альтернативного и остаточного дыхания соответственно
Рис. 5. Скорость теплопродукции (д) в разных частях третьего молодого (а) и зрелого листа (б) яровой пшеницы. 1, 2, 3 - базальная, средняя, апикальная части соответственно
4500 мкл О2/г-ч, что эквивалентно окислению около 6 мг субстрата/г-ч или 15% от сухой биомассы листа за сутки. Дыхание молодого листа в расчете на единицу белка было в 1.5 раза больше по сравнению со зрелым листом, что обусловлено высокой скоростью синтеза белка в растущем листе. Соотношение дыхательных путей зависело от возраста листа: в молодом -цитохромная и альтернативная оксидазы вносили равный вклад в дыхание, в зрелом - превалировал АП, который в большей степени относится к компоненте поддержания дыхания. Дыхание меристематически активной базальной части молодого листа осуществлялось преимущественно по нефосфорилирующим путям. Обнаружена связь между тепловыделением и альтернативным дыханием, указывающая на участие АП в диссипации энергии и регуляции энергетического баланса тканей, содержащих меристематические клетки.
Список литературы
1. Головко Т.К. Дыхание растений: физиологические аспекты. СПб.: Наука, 1999. 204 с.
2. Семихатова О.А. Энергетика дыхания в норме и при экологическом стрессе. Л.: Наука, 1990. 72 с.
3. Джеймс В. Дыхание растений. М.: Иностранная лит-ра, 1956. 439 с.
4. Azcon-Bieto J., Lambers H., Day D.A. // Plant Physiol. 1983. V. 72. P. 598-603.
5. Lambers H. // Physiol. Plant. 1982. V. 55. P. 478485.
6. Vanlerberghe G. C., McIntosh L. // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V. 48. P. 703-734.
7. Florez-Sarasa I.D., Bouma T.J., Medrano H. et al. // Physiol. Plant. 2007. V. 129. P. 143-151.
8. Иванова Т.И., Кирпичникова О.В., Шерстнева О.А., Юдина О.С. // Физиология растений. 1998. Т. 45. С. 906-913.
9. Головко Т.К., Пыстина Н.В. // Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 846-853.
10. Шугаев А.Г., Выскрбенцева Э.И., Шугаева Н.А. // Физиология растений. 1998. T. 45. С. 670-678.
11. Evans L.T., Wardlow I.F., Fischer R.A. // In: Crop Physiology. Some Case Histories. New York: Cambridge Univ. Press, 1975. P. 101-149.
12. Кумаков В.А. Физиология яровой пшеницы. М.: Колос, 1980. 207 с.
13. Беденко В.П. Пшеница // В кн.: Частная физиология полевых культур. М.: Колос, 2005. С. 50-87.
14. Семихатова О.А., Чулановская М.В. Манометрические методы изучения дыхания и фотосинтеза растений. Л.: Наука, 1965. 168 с.
15. M0ller I.M., Berczi A., van der Plas L.H.W., Lambers H. // Physiol. Plant. 1988. V. 72. P. 642-649.
16. Bradford M.M. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
17. Thornley J.H.M. // Annals of Botany. 1977. V. 41. P. 1191-1202.
18. Сытник К.М., Мусатенко Л.И., Богданова Л.И. Физиология листа. Л.-Киев: Наукова думка, 1978. 392 с.
19. Головко Т.К., Добрых Е.В. // Физиология растений. 1993. Т. 40. С. 61-65.
20. Головко Т.К., Далькэ И.В., Табаленкова Г.Н., Гармаш Е.В. // Ботанический журнал. 2009. Т. 94. С. 1216-1226.
21. Вознесенский В.Л., Заленский О.В., Семихатова О.А. Методы исследования фотосинте-
за и дыхания растений. М.-Л.: Наука, 19б5. 305 с.
22. Голик К.Н. Темновое дыхание растений. Киев: Наукова думка, 199Q. 14Q с.
23. Мокроносов А.Т. Онтогенетический аспект фотосинтеза. М.: Наука, 1981. 19б с.
24. Куперман И.А., Хитрово Е.В. Дыхательный газообмен как элемент продукционного процесса растений. Новосибирск: Наука. Сибирское отделение, 1977. 183 с.
25. Millenaar F.F., Lambers H. // Plant Biol. 2003. V. 5. P. 2-15.
26. Bishop T., Brand M.D. // J. Exp. Biol. 2000. V. 203. P. 3603-3612.
27. Ribas-Carbo M., Robinson S.A., Gonzalez-Meler M.A., Lennon A.M. et al. // Plant Cell Environ. 2000. V. 23. P. 983-989.
RESPIRATORY PATHWAYS RATIO IN YOUNG AND MATURE LEAVES OF SPRING WHEAT
E. V. Garmash, R. V. Malyshev, T.K. Golovko
Third leaf age-related changes in respiratory pathways in spring wheat (Triticum aestivum L.) have been studied. A decrease in 02 uptake rate and an increase of alternative respiratory pathway (AP) part in a mature leaf have been revealed. Activation of non-phosphorylating pathways in meristematically active basal region of a young leaf has been found. A link has been established between heat production and AP.
Keywords: Triticum aestivum, leaf, age, respiration, respiratory pathways, alternative pathway, heat production, growth.
