CC BY
123
2013
Известия ТИНРО
Том 173
УДК 581.5:582.26(265.54) Н.А. Айздайчер*
Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН,
690059, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17
соленостные адаптации одноклеточной водоросли ATTHEYA ussuRENsis (BAciLLARiopHYTA)
Изучена способность бентосной диатомовой водоросли Attheya ussurensis Stonik, Orlova et Crawford из Японского моря к адаптации при понижении солености в лабораторной культуре. Установлено, что полноценная адаптация водоросли к солености 16 %о происходит на 28-е сутки культивирования. При понижении солености до 12 %о ингибирование на 63-и сутки составляло 50 %, отмечены морфологические изменения клеток. При солености 8 %о водоросли не способны адаптироваться, их гибель происходила на 35-е сутки культивирования. В этом случае уже в самом начале эксперимента зафиксированы значительные морфологические изменения.
ключевые слова: Attheya ussurensis, соленостные адаптации, ингибирование, скорость роста, морфология.
aizdaicher N.A. Salinity adaptations of the unicellular alga Attheya ussurensis (Bacillariophyta) // Izv. TINRO. — 2013. — Vol. 173. — P. 223-229.
Adaptation of the benthic diatom alga Attheya ussurensis to low salinity is investigated in laboratory culture. The alga was isolated in algologically pure culture from the samples collected in the Lazurnaya Bay, Japan Sea. In the batch culture, growth of the alga was characterized by S-shaped curve with a short or no lag phase and high growth rate in the exponential phase. Cells were quadratic or rectangular, 15.1 mm high and 14.5 mm wide, with 6-8 broad-lobed chloroplasts in the middle. Their adequate adaptation to 16 %% salinity occurred after 28 days of cultivation, when the growth rate achieved its value in control samples and light microscopy did not detect any morphological changes. However, under 12 %o salinity, 50 % inhibition was observed on day 63, the cell size increased towards the pervalval axis, the chloroplast structure became grained and compacted. Cultivation of Attheya ussurensis at 8 %o salinity caused 75 % inhibition on day 28 and 100 % inhibition on day 35, morphological changes were distinct: the cells were stretched in height up to 40 mm, the chloroplasts had compacted structure with fuzzy lobes, and the cell walls were curved. There is concluded that adequate adaptation of Attheya ussurensis is possible to salinity no less 16 %; its cells remain viable with some morphological changes under conditions of 12 %o salinity; and it is not capable to adapt to salinity 8 %o.
Key words: Attheya ussurensis, salinity adaptation, inhibition, growth rate, morphology.
введение
Диатомовые водоросли играют основополагающую роль в продуктивности морских экосистем, являясь первым звеном трофических цепей. Они создают 50 % всей органической массы океана, а при отмирании дают массу детрита и растворенного
* Айздайчер Нина Александровна, кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудник, e-mail: inmarbio@mail.primorye.ru.
Aizdaicher Nina A., Ph.D., assistant professor, senior researcher, e-mail: inmarbio@mail. primorye.ru.
органического вещества. В марикультурных хозяйствах, расположенных в прибрежной зоне, эти водоросли служат незаменимой кормовой базой для донных беспозвоночных и оседающей молоди.
Жизнедеятельность морских микроводорослей в значительной степени регулируется влиянием абиотических факторов, одним из которых является соленость морской воды. Однако воздействие солености на развитие одноклеточных водорослей в лабораторной культуре изучено недостаточно (Boyer, 1982; Brown, 1985; Караева, Джафарова, 1993; Дятлов, Петросян, 2001). Практически отсутствуют экспериментальные данные о выживаемости водорослей за пределами солености, допускающей их активный рост. Ранее (Айздайчер, Маркина, 2011) было показано, что в кратковременных опытах бен-тосная диатомовая водоросль Attheya ussurensis способна расти при солености 16 %о.
В прибрежных водах морей организмы подвергаются значительным колебаниям солености в период летних тайфунов, когда она может понижаться до 1-2 %о и удерживаться на этом уровне в течение нескольких суток (Степанов, 1976; Bell, 1992). Если верхняя граница значения солености для обитающих в этих акваториях организмов определена особенностями гидрохимического режима зал. Петра Великого Японского моря (Лучин и др., 2005), то вопрос о нижней допустимой границе солености морской воды для многих одноклеточных водорослей, в том числе и A. ussurensis, остается открытым. Кроме диапазона изменения солености важна продолжительность влияния пониженной солености. Известно, что полноценное развитие водорослей происходит тогда, когда они обладают необходимым запасом экологической пластичности, позволяющей им переносить изменения солености внешней среды. Существование водорослей в прибрежной зоне возможно лишь благодаря выработке определенных адаптаций к изменению этого фактора (Гапочка, 1981). Согласно работам В.В. Хлебовича (1974), адаптации организма состоялись в том случае, когда он способен выживать в новых для него условиях.
Цель данного исследования состояла в изучении способности водоросли A. us-surensis адаптироваться к длительному воздействию пониженной солености.
Материалы и методы
Материалом для работы послужила альгологически чистая культура диатомовой водоросли Attheya ussurensis Stonik, Orlova et Crawford, 2006 из коллекции Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН (Айздайчер, 2008; Орлова и др., 2011). Культуру водоросли выращивали в конических колбах Эрленмейера на питательной среде f (Guillard, 1975) при температуре 20 ± 2 °С, освещении люминесцентными лампами интенсивностью 3500 лк со свето-темновым периодом 12 ч свет : 12 ч темнота. В экспериментах использовали природную морскую воду соленостью 32 %о. Питательную среду готовили на стерилизованной морской воде. Соленость 16, 12 и 8 %о получали разведением морской воды дистиллированной водой. Соленость измеряли на электросолемере ГМ-65М. Опыты проводили согласно методике, изложенной в работе С.Е. Дятлова, А.Г. Петросян (2001), которая была несколько модифицирована в связи с особенностями биологии водоросли A. ussurensis. Культуру для засева использовали в экспоненциальной стадии роста. В колбы емкостью 250 мл помещали 100 мл питательной среды, приготовленной на воде необходимой солености, и вносили инокулят с таким расчетом, чтобы стартовая концентрация составляла 4 • 104 кл/мл. После семисуточной экспозиции из каждой колбы с необходимой соленостью после центрифугирования отбирали инокулят в таком объеме, чтобы исходная концентрация была как и при прежнем засеве. Таким образом, при регулярном пересеве через каждые 7 сут в течение 63 сут культуры развивались в средах с соответствующей соленостью. Всего осуществлено 9 пересевов в воду каждой солености. Для подсчета клеток в единице объема в каждой экспозиции отбирали пробы после тщательного перемешивания в одно и то же время через 4 и 7 сут. Счет клеток осуществляли в камере Горяева. За контроль принимали количество клеток в среде соленостью 32 %о. Скорость роста водорослей во всех вариантах рассчитывали на четвертые и седьмые сутки по соответствующей формуле
(Brown et al., 1998). Показатель ингибирования для каждой солености рассчитывали, используя известную формулу*. Все эксперименты проводили в трех повторностях.
Результаты и их обсуждение
В результате экспериментальных работ для каждой исследуемой солености по данным 9 пересевов в течение 63 сут были рассчитаны средняя скорость роста водоросли A. ussurensis и показатель ингибирования ее роста. Так, при солености 32 %о (контроль) в каждом пересеве численность клеток в суспензии была практически одинаковой. В начале экспоненциальной фазы роста суспензия представлена квадратными клетками размером 16,0 мкм в высоту и 15,5 мкм в ширину и в конце этой стадии — прямоугольными клетками размером 17,2 мкм в высоту и 15,9 мкм в ширину. Хлоропласты с четко выраженными лопастями соответствовали классическому описанию (Stonik et al., 2006). Скорость роста не изменялась в течение всего эксперимента (табл. 1). Ингибирования роста водоросли не отмечали.
Таблица 1
Показатели роста (lnN) Attheya ussurensis при солености морской воды 32 %о, контроль
Table 1
Growth rates (lnN) of Attheya ussurensis under water salinity 32 %o, the control sample
Продолжительность эксперимента, сут Экспозиция, сут Средняя скорость роста, д Показатель ингибирования, %
0 4 7
7 10,5 13,1 14,2 0,40 0
14 10,5 13,2 14,3 0,37 0
21 10,5 13,3 14,4 0,37 0
28 10,5 13,2 14,4 0,40 0
35 10,6 13,1 14,3 0,39 0
42 10,5 13,1 14,3 0,40 0
49 10,5 13,0 14,1 0,37 0
56 10,5 13,1 14,3 0,40 0
63 10,5 13,2 14,4 0,40 0
В культуре, выращенной при 16 %о, деление клеток в первом пересеве замедлялось, ингибирование составляло 25 %. Клетки за счет гидратации были несколько увеличены в размере: в высоту достигали 16,5 мкм, а в ширину 15,9 мкм. Структура хлоропластов зернистая. Численность клеток через 7 сут выращивания достигала уровня контроля только после третьего пересева (табл. 2), показатель ингибирования уменьшался до 10 %. При увеличении количества пересевов клетки и хлоропласты принимали форму, соответствующую классическому описанию. После 28 сут культивирования скорость роста была как в контроле, ингибирование составляло 2 %, что свидетельствовало о полной адаптации водоросли к солености 16 %о. Вероятно, в этот период в суспензии сформировался метаболитный фон, который позволил определить реакцию организмов на изменение солености (Зимина, Сазыкина, 1987; Гапочка и др., 1988).
В культуре, содержащейся при 12 %о, клеточное деление ингибировалось на протяжении всего эксперимента. Необходимо подчеркнуть, что с увеличением срока культивирования ингибирование усиливалось, и это касалось не только численности клеток, но и морфологических характеристик. Клетки резко увеличивались в направлении первальварной оси, их средний размер составлял 25,0 мкм в высоту и 16,8 в ширину. Структура хлоропластов становилась зернистой и уплотненной. В отдельных клетках лопасти хлоропластов нечеткие, размытые, почти во всех клетках наблюдали ретракцию цитоплазмы. С увеличением количества пересевов морфологические изменения клеток усиливались. Стенки некоторых клеток искривлялись, рога укорачи-
* Water quality — Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum : International Standard ISO/DIS 10253.2, 2006. — 12 p.
Таблица 2
Показатели роста (lnN) Attheya ussurensis при солености морской воды 16 %о
Table 2
Growth rates (lnN) of Attheya ussurensis under water salinity 16 %
Продолжительность эксперимента, сут Экспозиция, сут Средняя скорость роста, д Показатель ингибирования, %
0 4 7
7 10,6 12,8 13,7 0,30 25
14 10,6 13,0 13,9 0,30 19
21 10,6 13,2 14,2 0,33 10
28 10,5 13,2 14,4 0,39 2
35 10,6 13,2 14,4 0,39 2
42 10,6 13,2 14,3 0,40 0
49 10,5 13,1 14,3 0,40 0
56 10,6 13,1 14,3 0,39 2
63 10,6 13,2 14,4 0,40 0
вались. Ингибирование с каждым пересевом возрастало: если после первого пересева оно составляло 25 %, то в конце эксперимента достигало 50 % (табл. 3).
Таблица 3
Показатели роста (1ПЫ) ЛиИвуа Ш8игет18 при солености морской воды 12 %о
Table 3
Growth rates (lnN) of Attheya ussurensis under water salinity 12 %
Продолжительность эксперимента, сут Экспозиция, сут Средняя скорость роста, д Показатель ингибирования, %
0 4 7
7 10,6 12,1 13,0 0,30 25
14 10,5 12,1 13,0 0,30 19
21 10,6 12,1 12,9 0,26 29
28 10,6 12,0 12,8 0,26 35
35 10,5 12,0 12,8 0,24 38
42 10,5 12,0 12,7 0,23 43
49 10,5 12,0 12,6 0,21 43
56 10,6 11,0 12,5 0,20 50
63 10,5 11,8 12,4 0,20 50
Известно, что на изменение солености морской воды организмы отвечают изменением функций. У одноклеточных водорослей изменение солености действует непосредственно на весь организм, поэтому адаптивные изменения функций являются первичными и приспособительные реакции происходят на уровне клеточных систем (Генецинский, 1964; Кшпе, 1964; Хочачка, Сомеро, 1977). Подавление роста водорослей под воздействием факторов окружающей среды, по мнению некоторых исследователей (Алехина и др., 2005), обусловлено не столько их повреждающим действием, сколько адаптивными ответами клеток водорослей. Медленный рост позволяет им выжить при стрессе, так как в этом случае освобождается множество ресурсов, необходимых для защиты от повреждающего фактора.
Выращивание А. ussurensis при солености 8 % показало самую низкую скорость деления клеток. В первом пересеве численность клеток незначительно увеличивалась в течение 7 сут. Невысокий темп деления клеток зафиксирован и после четвертого пересева (через 28 сут экспозиции). Ингибирование в этот период достигало 75 % (табл. 4), а после 35 сут оно составляло 100 %. Морфологические изменения клеток при этой солености резко выражены: уже в первом пересеве клетки сильно вытянуты в направлении первальварной оси (в высоту клетки достигали 40,0 мкм, в отдельных случаях до 57,5 мкм), рога укорочены или совсем отсутствуют. Хлоропласты зернистые, их структура уплотнена, лопасти хлоропластов размытые. С увеличением числа пересевов морфологические изменения клеток прогрессировали: клеточные стенки
искривлялись и принимали подковообразную форму, хлоропласты были разорваны, лопасти имели нечеткие границы. За счет разрушения хлорофилла а хлоропласты обесцвечивались и суспензия приобретала белесоватый оттенок. Клеточная стенка у большинства клеток разрушалась.
Таблица 4
Показатели роста (lnN) Attheya ussurensis при солености морской воды 8 %о
Table 4
Growth rates (lnN) of Attheya ussurensis under water salinity 8 %
Продолжительность эксперимента, сут Экспозиция, сут Средняя скорость роста, д Показатель ингибирования, %
0 4 7
7 10,6 10,8 11,1 0,1 75
14 10,5 10,8 11,1 0,1 75
21 10,5 10,7 11,0 0,1 72
28 10,5 10,6 10,9 0,1 75
35 10,5 10,4 10,4 0 100
42 10,5 10,5 10,3 0 0
49 10,5 9,1 9,2 0 0
56 10,5 0 0 0 0
63 10,5 0 0 0 0
Известно, что бактериальные клетки под воздействием различных факторов, блокирующих отдельные звенья биосинтеза клеточной стенки, способны образовывать L-формы — измененные клетки, которым свойственно превращение в исходные формы, когда действие фактора прекращается (Прозоровский и др., 1981). Можно предположить, что при солености 8 % в культуре водорослей формируются клетки, аналогичные L-формам бактерий, которые при помещении их в среду соленостью 32 % будут способны к восстановлению, однако это требует дополнительных исследований.
Особенностью биологии бентосных диатомовых водорослей является выделение слизи во время роста, за счет которой они прикрепляются к субстрату (Диатомовые водоросли России ..., 2006; Стоник и др., 2006). В культуре водорослей, растущих при солености 8 %, в результате нарушения метаболизма клетки не выделяли слизь и оставались неприкрепленными. Характер роста водорослей в этих условиях свидетельствовал об отсутствии формирования популяции с присущими ей признаками активного размножения и свойственной клеткам морфологии. Таким образом, можно предположить, что вода соленостью 8 % для A. ussurensis в течение 28 сут являлась “зоной временной адаптации”, которая через 35 сут экспозиции переходила в “зону подавления” (Хлебович, 1974). Интервал солености от 12 до 8 %, по определению Дж. Кирста (Kirst, 1977), попадает в рамки, характеризующие гипотонический стресс. Как показали опыты, диатомовая водоросль A. ussurensis способна некоторое время (28 сут) расти в этом интервале солености, что предполагает наличие у нее механизмов, регулирующих осмотическое давление. Некоторые морские микроводоросли способны регулировать осмотическое давление внутри клеток с давлением окружающей среды посредством выделения во внешнюю среду низкомолекулярных соединений, в том числе и аминокислот (Jackson et al., 1992). Известно, что при понижении солености нарушается гомеостаз неорганических ионов в цитоплазме и внешней среде (Brown, 1985). Установлено (Стриж и др., 2004; Еланская и др., 2006), что у представителей зеленых водорослей и цианобактерий ключевую роль в регуляции ионного содержания цитоплазмы играет плазматическая мембрана, а при воздействии стресс-фактора в клетках происходят адаптивные мембранные перестройки, связанные с изменением липидного состава и соотношения различных классов липидов. В связи с этим изучение адаптивных мембранных перестроек при воздействии неблагоприятных факторов у диатомовых водорослей может быть предметом дальнейших исследований.
выводы
В результате исследований показано, что полноценная адаптация без изменения скорости роста и морфологических изменений у A. ussurensis к солености 16 % происходит на 28-е сутки культивирования.
Понижение солености до 12 % приводит к ингибированию роста и морфологическим изменениям клеток. Показатель ингибирования возрастает по мере увеличения времени экспозиции до 50 %. При этом не происходит полного восстановления морфологии клеток до классического описания.
При солености 8 % в начале эксперимента ингибирование составляло 75 %, а через 35 сут культивирования оно достигало 100 %. В этом случае зафиксированы наиболее существенные морфологические изменения клеток: удлинение их в направлении первальварной оси более чем в 2,5 раза, ретракция цитоплазмы и уплотнение хлоропластов, укорачивание или полное исчезновение рогов, искривление стенок и к концу эксперимента практически полное разрушение клеток.
Список литературы
Айздайчер Н.А. Коллекция культур морских микроводорослей Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН // Биол. моря. — 2008. — Т. 34, № 2. — С. 152-155.
Айздайчер Н.А., Маркина Ж.в. Влияние солености морской воды на рост, содержание фотосинтетических пигментов и размер клеток бентосной водоросли Attheya ussurensis Stonik, Orlova et Crawford, 2006 (Bacillariophyta) // Биол. моря. — 2011. — Т. 37, № 6. — С. 455-460.
Алехина Н.д., Балнокин Ю.в., Гавриленко в.Ф. Физиология растений : учеб. для студентов вузов. — М. : Академия, 2005. — 640 с.
Гапочка л.д. Об адаптации водорослей : монография. — М. : МГУ, 1981. — 80 с.
Гапочка л.д., дрожжина Т.С., веселаго И.А. и др. Фенотипическая адаптация популяции к токсическому воздействию на примере зеленой водоросли Scenedesmus quadricauda // Биол. науки. — 1988. — № 5. — С. 62-66.
Генецинский А.Г. Физиологические механизмы водно-солевого равновесия : монография. — М.; Л. : Наука, 1964. — 426 с.
диатомовые водоросли России и сопредельных стран: ископаемые и современные : монография / РМ. Гогорев, Т.Ю. Орлова, О.Г. Шевченко, И.В. Стоник; под ред. Н.И. Стрельниковой. — СПб. : ПбГУ, 2006. — Т. 2, вып. 4. — 180 с.
дятлов С.Е., петросян А.Г. Phaeodactylum tricornutum Bohl. (Chrysophyta) как тест-объект. Диапазон соленостной резистенции // Альгология. — 2001. — Т. 11, № 2. — С. 259-264.
Еланская И.Б., карандашова И.в., Хагеманн М. Молекулярные механизмы устойчивости к солевому стрессу у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 // Вестн. МГУ Сер. 16. Биология. — 2006. — № 4. — С. 34-38.
Зимина Л.М., Сазыкина Т.Г. Выделение экзометаболитов микроводорослями как механизм регуляции плотности популяции // Гидробиол. журн. — 1987. — Т. 23, № 4. — С. 50-55.
Караева Н.И., Джафарова С.К. Экспериментальные исследования полигалобных Bacillariophyta в связи с соленостью среды // Альгология. — 1993. — Т. 3, № 2. — С. 97-105.
Лучин в.А., Тихомирова Е.А., Круц А.А. Океанографический режим вод залива Петра Великого (Японское море) // Изв. ТИНРО. — 2005. — Т. 140. — С. 130-169.
Орлова Т.Ю., Айздайчер Н.А., Стоник И.в. Лабораторное культивирование морских микроводорослей, включая продуцентов фитотоксинов : научно-методическое пособие. — Владивосток : Дальнаука, 2011. — 89 с.
Прозоровский С.в., Кац Л.Н., Коган Г.Я. L-формы бактерий (механизм образования, структура, роль в патологии) : монография. — М. : Медицина, 1981. — 240 с.
Степанов в.в. Характеристика температуры и солености воды зал. Восток Японского моря // Биологическое исследование залива Восток. — Владивосток : ДВНЦ АН СССР. 1976. — С. 12-22.
Стоник И.в., Орлова Т.Ю., Айздайчер Н.А. Диатомовые водоросли рода Attheya West, 1860 из Японского моря // Биол. моря. — 2006. — Т. 32, № 2. — С. 142-145.
Стриж И.Г., Попова Л.Г., Балнокин Ю.в. Физиологические аспекты адаптации морской микроводоросли Tetraselmis (Platymonas) viridis к различной солености среды // Физиол. раст. — 2004. — Т. 51, № 2. — С. 197-204.
Хлебович в.в. Критическая соленость биологических процессов : монография. — Л. : Наука, 1974. — 236 с.
Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимической адаптации : монография. — М. : Мир, 1977. — 420 с. (Пер. с англ.)
Bell P.R.F. Eutrophication and coral reefts — same exsampies in the Great Barrier Reef lagoon // Wat. Res. — 1992. — Vol. 2б. — P. 553-5б8.
Boyer J.S. Plant productivity and environment // Science (Washington, D. S). — 1982. — Vol. 219. — P. 443-448.
Brown L.M. Stepwise adaption to salinity in the green alga Nannochloris bacillaris // Can. J. Bot. — 1985. — Vol. б3. — P. 327-332.
Brown M.R., McCausland M.A., Kowalski K. The nutritional value of four Australian microalgal strains fed Pacific oyster Crassostrea gigas spat // Aquaculture. — 1998. — Vol. 1б5. — P. 281-295.
Guillard R.R.L. Culture of phytoplankton for feeding marine in vertebrates // Culture of marine invertebrate animals. — N.Y. : Plenum Press, 1975. — P. 2б-б0.
Jackson A.T., Ayer S.W., Laycock M.V. The effect of salinity on growth and amino acid composition in the marine diatom Nitzschia pungens // Can. J. Bot. — 1992. — Vol. 70. — P. 2198-2201.
Kinne O. Non-genetic adaptation to temperature and salinity // Helgoland. wiss. Meeresunt-ers. — 19б4. — Vol. 9. — P. 433-458.
Kirst G.O. Coordination of ionic relation and mannitol concentrations in the euryhaline unicellular algae, Platymonas subcordiformes (Hazen) after osmotic shocks // Planta. — 1977. — Vol. 139. — P. б9-75.
Stonik I.V., Orlova T.Yu., Crawford R.M. Attheya ussurensis sp. nov. (Bacillariophyta) — a new marine diatom from the coastal waters of the Sea of Japan and reappraisal of the genus // Phy-cologia. — 200б. — Vol. 45. — P. 141-147.
Поступила в редакцию 12.02.13 г.
