CC BY
205
УДК 612.741.91
Сократительная активность скелетной
мышцы и судьба миоядер
*
Б. С. Шенкман , О. В. Туртикова, Т. Л. Немировская, А. И. Григорьев ГНЦ РФ - Институт медико-биологических проблем РАН, Москва *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 28.12.2009 г.
резюме Зрелое скелетное мышечное волокно является симпластом - многоядерной структурой, образованной в онтогенезе путем слияния клеток-предшественников, миобластов. Ядра мышечного волокна (миоядра) располагаются на его периферии в пространстве, находящемся между миофибриллами и сарколеммой, клеточной мембраной. Теоретически масса скелетной мышцы при разгрузке или нагрузке может меняться за счет изменения количества миоядер, скорости процессов транскрипции, трансляции и интенсивности протеолиза. В этом обзоре рассматриваются данные, накопленные в мировой литературе, относящиеся к феноменологии и предполагаемым механизмам изменения количества ядер мышечных волокон при повышенной и пониженной сократительной активности. В ряде случаев (при тяжелых мышечных и системных заболеваниях и при гравитационной разгрузке) мышечная атрофия сопровождается уменьшением количества ядер в мышечном волокне. Редукцию миоядерного числа обычно объясняют развитием ядерного апоптоза в мышечных волокнах. Появление новых ядер в волокне может быть обеспечено только клетками-миосателлитами при их слиянии с мышечным волокном. Считается, что именно они обеспечивают мышечное волокно дополнительными ядрами для роста в постнатальный период, а также при рабочей гипертрофии и участвуют в восстановлении и локальной регенерации мышечных волокон после повреждения. В обзоре рассматриваются возможные механизмы, регулирующие пролиферацию клеток-миосателлитов в условиях нагрузки, функциональной разгрузки и пассивного растяжения.
ключевые слова скелетная мышца, миоядра, апоптоз, физическая тренировка, рабочая гипертрофия, клетки-миосателлиты, ростовые факторы, гравитационная разгрузка, растяжение.
список сокращений IGF (insulin-like growth factor) - инсулиноподобный фактор роста, AIF - апоптозиндуци-рующий фактор, GFP - зеленый флуоресцирующий белок, BrdU - бромдезоксиуридин, c-Met - рецептор для HGF, HGF - фактор роста гепатоцитов, FGF - фактор роста фибробластов, MMPs - матриксные металлопротеиназы, MGF - механозависимый фактор роста.
ВВЕДЕНИЕ
Скелетная мышца - одна из наиболее пластичных структур в организме млекопитающих. Повышенная активность и нагруженность мышцы часто приводят к увеличению ее поперечных размеров (толщины), увеличению объема мио-фибриллярного аппарата, значительному повышению его сократительных возможностей (силы, мощности). В основе такой перестройки лежит устойчивое изменение паттерна экспрессии генов.
Хроническое снижение функциональной нагрузки на постуральные мышцы, и прежде всего т. soleus, при длительном изменении действия гравитационных сил (переход в горизонтальное положение, устранение опоры на все или только задние конечности, пребывание в условиях невесомости), которое принято называть гравитационной разгрузкой, приводит к глубокой перестройке всей структурно-функциональной организации мышечной ткани [1-3]. Среди наиболее важных проявлений гипограви-тационной перестройки мышц - снижение сократительных возможностей (силы и работоспособности), снижение жесткости мышцы и ее волокон, значительное уменьшение
объема ядерного, миофибриллярного аппарата и размеров волокна (атрофия), разрастание соединительно-тканных и экстрацеллюлярных структур, изменение миозинового фенотипа волокон в сторону увеличения экспрессии быстрых изоформ тяжелых цепей миозина. Данные последних лет позволяют считать, что в основе гравитационно-зависимой перестройки волокон т. soleus лежит стабильное направленное изменение экспрессии большого числа генов, формирование нового целостного, т.н. атрофического, паттерна экспрессии.
Зрелое мышечное волокно является симпластом, многоядерной структурой, образованной в онтогенезе путем слияния клеток-предшественников, миобластов. Ядра мышечного волокна располагаются на его периферии в пространстве, находящемся между миофибриллами и сарколеммой, клеточной мембраной. В мышечной ткани имеются и другие ядра, принадлежащие фибробластам, эндотели-альным клеткам, клеткам-предшественникам (миосател-литам). Поэтому в литературе собственные ядра мышечных волокон принято называть миоядрами. Теоретически масса скелетной мышцы при разгрузке или нагрузке мо-
жет меняться за счет изменения количества миоядер, скорости процессов транскрипции, трансляции и интенсивности протеолиза. В этом обзоре будут рассматриваться данные, накопленные в мировой литературе, относящиеся к феноменологии и предполагаемым механизмам изменения количества ядер мышечных волокон при повышенной и пониженной сократительной активности.
Ядра зрелых мышечных волокон являются постмитоти-ческими и не способны к делению. Количество миоядер очень важно, поскольку оно определяет количество ДНК, необходимой для поддержания транскрипции генов [4]. Взаимоотношение между размером волокон и числом миоядер легло в основу концепции миоядерного домена, которая впервые предложена в работах Cheek и сотр. [5]. Миоядерный домен представляет собой объем цитоплазмы мышечного волокна, управляемый продуктами экспрессии генов одного мио-ядра. Несмотря на то, что понятие ядерного домена довольно условно и очевидно, что экспрессия генов, распределение белков по мышечному волокну зависит от множества переменных, этим понятием удобно пользоваться при описании механизмов пластичности мышц. Во многих работах анализируется не сам домен, а площадь поперечного сечения волокна, приходящаяся на одно миоядро.
Для выявления миоядер обычно используют традиционные ядерные красители, специфически связывающие ДНК. Основная проблема, с которой сталкиваются исследователи, определяющие количественные показатели ядерного пула мышечного волокна, состоит в том, что при анализе поперечных срезов мышечной ткани без применения специальных приемов оказывается невозможным отличить ядра, находящиеся по разные стороны границы волокна. Для решения этой проблемы применяют различные подходы. В частности, используют двойную одновременную окраску (double labeling) ядер и специфических белков субсарколеммального слоя, например дистрофина [6]. Многие авторы анализируют ядерный состав изолированного мышечного волокна [7, 8]. При анализе изолированного волокна приходится иметь дело с объемной структурой, что делает необходимым использование конфокального лазерного микроскопа. Такой подход имеет очевидные преимущества: можно анализировать весь ядерный пул волокна (а не только ядра, попадающие в плоскость поперечного среза), можно проследить распределение плотности ядер по длине волокна и его элементарной единицы - саркомера. Однако размер выборки волокон оказывается в этом случае весьма ограниченным (20-30 волокон на биопробу).
Allen c соавт. была выдвинута гипотеза постоянства мио-ядерного домена при изменении размеров мышечных волокон (атрофии и гипертрофии) [4]. Они выявили, что размеры миоядерного домена неизменны во время острой стадии гипертрофии. Пропорциональное увеличение количества миоядер и объема цитоплазмы при гипертрофии было обнаружено в исследованиях на модели функциональной гипертрофии, вызванной удалением мышц-синергистов [9]. Этим же коллективом авторов была показана вариабельность размеров миоядерного домена при хроническом увеличении или уменьшении нагрузки на собаках [10] и уменьшение его размеров при атрофии у крыс [7]. Гипотеза постоянства миоядерного домена, таким образом, оказалась несостоятельной и в дальнейшем была опровер-
гнута многочисленными исследованиями в условиях разгрузки и тренировки [11-13, 8]. Установлено, что размер миоядерного домена меняется в течение жизни животного [14-16]. Недавние исследования итальянских авторов еще раз подтвердили возможность гипертрофии без инкорпорации новых миоядер, т.е. увеличение миоядерного домена при гипертрофии [11].
РЕДУКЦИЯ МИОЯДЕРНОГО ЧИСЛА
В ряде случаев (при тяжелых мышечных и системных заболеваниях и при гравитационной разгрузке) мышечная атрофия сопровождается уменьшением количества мио-ядер на волокно при соответствующем развитии апоптоти-ческих процессов в миоядрах. Такая редукция миоядерного числа наблюдалась в четырехглавой мышце астронавтов после космического полета [17], в камбаловидной мышце крыс после космического полета [10, 12], при моделировании разгрузки на крысах с использованием т.н. вывешивания задних конечностей [18, 19], при иммобилизации камбаловидной мышцы. Потери миоядер наиболее интенсивны в медленных волокнах [19]. В исследованиях на единичных волокнах установлено снижение размеров миоядерного домена после разгрузки в m. soleus, но не в m. plantaris у крыс [12]. Миоядерный домен также имел тенденцию к снижению после 14-суточного космического полета у макак резус [20]. Wang c соавт. показали, что после 16 дней вывешивания у крыс уменьшается площадь поперечного сечения волокон m. soleus, число миоядер (на 25 %) и размер ядерного домена [21].
Редукцию миоядерного числа обычно объясняют развитием ядерного апоптоза в мышечных волокнах. Процессы апоптоза в мышечных волокнах развиваются несколько иначе, нежели в других клеточных типах. Ультраструктурные признаки деструкции ядра при изменении сократительной активности обычно слабо выражены. В то же время разрывы ДНК в ядре сопровождаются рядом мито-хондриальных и внемитохондриальных событий, которые принято считать звеньями взаимозависимых сигнальных путей, обусловливающих апоптотические процессы.
Апоптотические ядра в волокнах скелетных мышц наблюдали при дистрофии Дюшена (и на ее биологической модели - животных линии mdx) [22], при поражении мышц на фоне хронической сердечной недостаточности, развитии бокового амиотрофического склероза и в ряде других случаев. Апоптоз миоядер также наблюдали и после специфического вида физических нагрузок, т.н. эксцентрической работы [23]. При таком состоянии напряжение мышечного волокна развивается на фоне его растяжения. Это сокращение вызывает многочисленные деструктивные изменения цитоскелетных белков и сарколеммы. В 1997 г. в работе Allen и др. впервые сообщалось о присутствии апоптотиче-ских ядер при вывешивании крыс [18]. У крыс максимальное число апоптотических ядер в волокнах m. soleus (судя по окраске TUNEL, выявляющей разрывы ДНК) наблюдалось уже на 2-е сут после инактивации камбаловидной мышцы [24]. Аналогичные данные были получены и в экспериментах с мышами, у которых максимальные значения содержания апоптозиндуцирующего фактора (AIF) и экспрессии р53 наблюдались уже после 24 ч разгрузки [25]. Этому предшествовало резкое увеличение концентрации
каспазы-3 и каспазы-8 уже после 12 ч вывешивания. А повышенная концентрация Bcl-2 выявлялась даже после 6 ч разгрузки. При экспозициях более суток наблюдаемые проявления апоптоза снижались. Сходную динамику выявляли и при иммобилизации m. soleus [24]. При восстановлении после вывешивания задних конечностей уже на 7-е сут проявления апоптоза практически не обнаруживались [26]. Некоторые авторы не обнаруживали активации каспазно-го каскада в m. soleus при вывешивании или спинальной изоляции [27], отмечая в то же время в этих экспериментальных ситуациях транслокацию в ядро эндонуклеазы G, фермента митохондриального происхождения, осуществляющего деградацию ядерной ДНК. Недавно группа авторов подвергла животных вывешиванию при пониженной температуре, что по их замыслу должно было значительно замедлить развитие митохондриально-зависимых процессов. В этом случае также наблюдались апоптотические ядра и значительная активация каспаз [28].
Как уже отмечалось выше, при однократной физической нагрузке в мышечном волокне наблюдаются различные проявления апоптоза (фрагментация ДНК, повышенная активность каспаз и др.), однако регулярная физическая тренировка не только снижает эти проявления апоптоза, но и обладает антиапоптотическим действием в отношении ядерных изменений, развивающихся при пониженной мышечной активности [18].
В отличие от других клеточных структур, в волокнах скелетной мышцы апоптоз отдельных ядер не приводит к немедленной гибели волокна, хотя не может проходить без очевидных патологических последствий.
В последнее время Bruusgaard и др. [29] подвергли сомнению весь комплекс многократно описанных наблюдений ядерных потерь и апоптоза в условиях атрофии. Они проводили трансфекцию мышей плазмидой, кодирующей GFP, который локализовался в миоядрах, а затем проводили анализ количества миоядер при денервации и разгрузке m. extensor digitorum longus (вызванной тенотомией антагонистов) в течение длительного времени (14 дней). На фоне значительного снижения площади поперечного сечения мышечных волокон авторы не обнаруживали какого-либо уменьшения числа миоядер. Зафиксированные апоптоти-ческие изменения наблюдались лишь в клетках-сателлитах и клетках соединительной ткани, но отсутствовали внутри мышечного волокна. Аналогичные данные были получены другими авторами при исследовании детренировки мышц крыла японского перепела: все ядра, демонстрировавшие признаки апоптоза, оказались также меченными индикатором синтеза ДНК бромдезоксиуридином (BrdU), т.е. оказались ядрами клеток-сателлитов [30]. В то же время Bruusgaard и Gundersen [29] основывают свои выводы на экспериментах с денервацией, разгрузкой и блокадой проведения нервного импульса к мышцам с преобладанием быстрых волокон, которые менее подвержены апоптозу (см. выше). Эти авторы не ставят под сомнение данные (приведенные выше), свидетельствующие об апоптозе и редукции миоядерного числа при моделировании действия микрогравитации методом антиортостатического вывешивания задних конечностей животных (и соответственно результаты аналогичных экспериментов с участием добровольцев). Они предполагают, что в этом случае апоптозу миоядер
способствуют системные проявления гравитационной разгрузки. К сожалению, приходится констатировать, что это предположение пока не находит экспериментального подтверждения.
Увеличение количества ядер в зрелом мышечном волокне наблюдалось в условиях силовой тренировки, экспериментальной рабочей гипертрофии (при удалении мышц-синергистов) и при восстановлении после атрофических процессов [26, 31-33]. Появление новых ядер в волокне может быть обеспечено только клетками-миосателлитами при их слиянии с мышечным волокном. Считается, что именно они обеспечивают мышечное волокно дополнительными ядрами для роста в постнатальный период и участвуют в восстановлении и локальной регенерации мышечных волокон после повреждения [34].
КЛЕТКИ-ПРЕДШЕСТВЕННИКИ В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЕ. МАРКЕРЫ МИОСАТЕЛЛИТНЫХ КЛЕТОК
Клетки-сателлиты в скелетной мышце - это мелкие одноядерные клетки, которые остаются в состоянии покоя (фазе G0 клеточного цикла) до момента активации, после чего они начинают пролиферировать и могут сливаться с мышечными волокнами, являясь необходимым источником миоядер в постэмбриональном развитии, при гипертрофии и восстановлении ткани [12], или друг с другом при формировании новых мышечных волокон [16]. Предположительно, сателлиты - это покоящиеся в мышечной ткани миобласты. Существует мнение, что сателлиты происходят от эндотелиальных предшественников, ассоциированных с васкулатурой эмбриона, которые могут оставаться в интерстициальном пространстве скелетных мышц и экспрессировать CD 34 [35]. Однако количество миогенных предшественников в скелетной мышце превышает число клеток-сателлитов вследствие миграции или рекрутирования недифференцированных стволовых клеток из других источников. Показано, что популяция клеток-предшественников, представленных в скелетной мускулатуре, происходит от некоммитированных мезен-химальных клеток-предшественников костного мозга и отличается от сателлитных клеток. Это клетки т.н. сторонней популяции; в отличие от популяции сателлитных клеток они экспрессируют Sca-1 и CD-45. Они, очевидно, принимают участие в регенерации мышцы после повреждения и после трансплантации в мышцу потенциально могут давать рост как миоцитам, так и клеткам-миосателлитам [36, 37]. Миосателлиты могут быть идентифицированы в мышце по их расположению (между сарколеммой и базальной мембраной мышечного волокна), а также при иммуноги-стохимическом выявлении различных белков, которые экспрессируют эти клетки на разных этапах своего жизненного цикла. Десмин, myf5, MyoD обнаружены в активированных и пролиферирующих сателлитных клетках; для них характерна экспрессия генов регуляторных мышечных факторов, таких, как Pax-7, c-Met. Синтез мио-генина и MRF4 характерен для конечной дифференци-ровки [38]. c-Met - рецептор для HGF - экспрессируется в скелетной мышце кроме сателлитов также и другими миогенными клетками-предшественниками. В сателлитах как покоящихся, так и активированных и пролифериру-ющих обычно происходит биосинтез молекул клеточной
адгезии, таких, как M-кадгерин (Mcad), NCAM (CD 56, Leu-19, Neural cell adhesion molecule), находящихся в узком пространстве между сателлитом и мышечным волокном. NCAM экспрессируется в активированных сателлитных клетках (миобластах) и в миотубах при регенерации мышцы, а также в нервно-мышечных синапсах. Недавно были получены данные, указывающие на то, что NCAM является наиболее ранним маркером коммитированных миобластов, т.е. определяет их однозначный переход из стадии пролиферации на этап дифференцировки [39].
Ключевой молекулой в миогенном морфогенезе является Mсad. Применяя сочетанное иммунологическое окрашивание на Mсad, NCAM, ламинин, десмин и клеточные ядра, Irintchev и др. [40] установили, что Mcad присутствует в сателлитах и миобластах в нормальной и регенерирующей мышце. По результатам одновременного окрашивания регенерирующей мышцы на Mcad и BrdU авторами был сделан вывод о том, что Mcad экспрессируется преимущественно в митотически неактивных (покоящихся) сателлит-ных клетках. После слияния миобластов экспрессия Mcad подавляется. Совместная экспрессия NCAM и Mcad очень часто обнаруживается в мышцах с нарушениями иннервации [40]. Позже было показано [41], что при гипертрофии скелетной мышцы, вызванной перегрузкой, на начальных этапах после воздействия стимула увеличивается число миосателлитов, экспрессирующих Mcad, на более поздних сроках растет число клеток, одновременно с Mcad окрашивающихся и на NCAM. Таким образом, окрашивание на Mcad было выявлено как в покоящихся миосателлитах, так и на стадиях пролиферации и дифференцировки.
клетки-миосателлиты в условиях гравитационной разгрузки
При вывешивании в мышцах молодых крыс в течение трех дней происходят необратимые процессы перестройки: сокращение числа сателлитных клеток и уменьшение проли-феративного потенциала (по результатам включения Brdu) как в m. soleus, так и в m. extensor digitorum longus. При этом у растущих животных может необратимо измениться программа развития мышечных волокон с нарушением способности к увеличению числа миоядер даже при возобновлении нагрузки [42, 43]. Митотическая активность сателлитных клеток уменьшается уже в течение 24 ч после начала вывешивания и полностью прекращается в течение 3-5 дней, причем наиболее сильное уменьшение наблюдается в m. soleus. Спустя 48 ч или более развиваются морфологические признаки атрофии [43]. Есть данные об усилении процессов пролиферации в m. gastrocnemius мышей в течение первой недели вывешивания [44]. Количество покоящихся и митотически активных сателлитов в мышечном волокне после вывешивания было снижено на 57 % по сравнению с контрольной группой [29]. В другой работе этих же авторов трехмесячное вывешивание не приводило к уменьшению числа и длины мышечных волокон у молодых животных, однако вызывало снижение количества клеток-сателлитов и миоядер, не связанное с апоптозом, и уменьшение митоти-ческой активности сателлитов [45]. Однако в работе Ferreira и др. [44] показано неожиданное усиление пролиферативных процессов в m. gastrocnemius мышей в течение первой недели вывешивания.
возможные пути активации клеток-миосателлитов
Считается, что в неработающей скелетной мышце миоса-теллиты находятся в состоянии покоя. Они активируются для выполнения своей роли в поддержании, гипертрофии или участия в восстановительных процессах при повреждении мышцы. Активация миосателлитов происходит также при силовой тренировке [46, 47].
Показано значительное увеличение общего числа клеток-сателлитов в нескольких моделях компенсаторной гипертрофии на животных и после эксцентрической нагрузки у человека [13, 48], а также при растяжении мышцы [49]. Считается, что физическая активность, например ре-зистивная нагрузка или функциональная перегрузка мышцы (хроническое растяжение, удаление мышц-синергистов, тенотомия), вызывают повреждение мышечной ткани [50], которое стимулирует в ней процессы регенерации. Повреждение мышцы вызывает воспалительный ответ, в поврежденной зоне увеличивается количество нейтрофилов и макрофагов с последующим высвобождением клетками воспалительного инфильтрата или самими поврежденными волокнами ростовых факторов, которые могут регулировать пролиферацию или дифференцировку миосателли-тов. Было показано, что цитокины (IL-4, IL-6, IL-15, TNF-a и др.) могут влиять на пролиферацию и дифференцировку клеток-сателлитов in vitro или в процессе регенерации после повреждения мышцы [51]. Показана роль фактора роста фибробластов (FGF) в активации миосателлитов [52]. Ключевым регулятором активности миосателлитов при регенерации считается фактор роста гепатоцитов (HGF) [18, 53] (рис. 1). Установлено, что HGF вызывает активацию клеток-сателлитов в культуре и in vivo при растяжении
Клетка- Pax7(+/-) миосателлит syndecan-3(+) syndecan-4(+) c-met(+) BrdU(-)
MyoD(-)
MyoD(+) Pax-7(+/-)
MGF Миостатин
Сигналы активации (HGF,TNF)
Внеклеточные факторы
Myogenin (-)
Myogenin T Pax-7(-)
"\Pax-7(T) Немиоге
jT предшес
предшес
ние
Немиогенные предшественники
IGF-1
Слияний
Предшественники сателлитных клеток
MyoDü /(-) Pax-7(++)
'^"Апоптоз(?)
Рис. 1. Гипотетическая роль IGF-1 и MGF в жизненном цикле клеток-миосателлитов. Модифицированная схема Olguin и Olwin [54].
мышцы, причем высвобождение HGF стимулируется синтезом в мышечной ткани оксида азота (NO). Кроме того, показано, что в этом процессе принимают участие матрикс-ные металлопротеиназы (MMPs) [55]. HGF воздействует на миосателлит посредством связывания с его рецептором c-met, запуская дальнейший каскад сигнальных событий, в т.ч. P^K-Akt-путь, стимулирующий выживание и защиту от апоптоза. Результаты большого количества экспериментов свидетельствуют о важной роли инсулиноподобного фактора роста в развитии мышечной гипертрофии. В экспериментах на животных in vivo получены данные, указывающие на роль инсулиноподобного фактора роста (IGF) в ростовых процессах, опосредованных деятельностью миосателлитов [56, 57]. IGF может стимулировать пролиферацию и дифференцировку миосателлитов в культуре [58]. Клетки-миосателлиты мышей с оверэкспрессией гена IGF-1 обладают повышенным пролиферативным потенциалом, который может вызываться активацией сигнального пути PI3K-Akt и снижением активности ингибитора циклин-зависимой киназы-2 [59], возникающей вследствие ингибирования транскрипционного фактора FOXO [57]. Поэтому сигнальные пути, активируемые IGF-1 в мышечных волокнах и усиливающие трансляцию, предположительно также активируются и в клетках-миосателлитах [60]. Однако IGF-1EA (та форма ростового фактора, которая экс-прессируется в клетках печени и в волокнах скелетных мышц и секретируется в системный кровоток) не является единственным продуктом гена IGF-1. В результате физической нагрузки или механического повреждения мышц продукт гена IGF-1 претерпевает сплайсинг, который приводит в течение 1-2 дней к появлению сплайс-варианта, именуемого MGF (механозависимый фактор роста). Во время этого сплайсинга происходит сдвиг рамки считывания, что обусловливает изменение в последовательности домена на С-конце и соответственно появление так называемого Е-домена, значительно отличающегося от последовательностей других сплайс-вариантов IGF-1 [61]. Этот уникальный С-концевой пептид работает как аутокринный ростовой фактор, который, как было показано, имеет короткий период полужизни. Одна из функций этого пептида - увеличение пула стволовых клеток скелетной мышцы (клеток-сателлитов) путем инициации пролиферации клеток-предшественников, однако при этом не происходит их дифференцировка по миогенному пути. После начального сплайсинга, приводящего к образованию MGF, продукт гена IGF-1 подвергается дальнейшему сплайсингу с образованием изоформы IGF-1EA. IGF-1EA предположительно стимулирует дифференцировку миосателлитных клеток и их слияние с мышечным волокном [38, 49, 62]. Однако, по мнению Wozniak и др. [38], только для ростового фактора HGF и молекулы NO была доказана их способность активировать миосателлиты, находящиеся в состоянии покоя. IGF, FGF и другие ростовые факторы значительно стимулируют пролиферацию и рост, который следует за активацией сателлитов. Некоторые другие ростовые факторы (в частности, фактор роста фибробластов) также способны активировать пролиферацию сателлитных клеток [52]. Показано, что активация клеток-миосателлитов может подавляться миостатином; предполагается, что именно мио-статин поддерживает миосателлиты в состоянии покоя [63].
Однако механизмы, вызывающие активацию и пролиферацию клеток-сателлитов, а также их слияние с поврежденными или растущими мышечными волокнами, в настоящее время остаются до конца не изученными.
Роль КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ В РЕАЛИЗАЦИИ РОСТОВЫХ ПРОЦЕССОВ В МЫШЦЕ
Клетки-сателлиты обладают огромным пролиферативным потенциалом; в настоящее время считается, что их функция важна для гипертрофии и регенерации скелетной мышцы. Различные стимулы, такие, как функциональная перегрузка при удалении мышц-синергистов, тестостерон, кленбутерол, растяжение мышцы и упражнения, могут активировать сателлиты, стимулировать их вступление в клеточный цикл и пролиферацию как в быстрых, так и в медленных мышцах; усиление пролиферации миосателлитов наблюдается уже в первые дни после воздействия стимула. В работах Crameri и др. [46], Kadi и др. [13, 31] после серии интенсивных упражнений существенно увеличивается количество клеток, экспрессирую-щих NCAM. Однако в этой и других работах не показано, что эти пролиферирующие клетки сливаются с мышечными волокнами. В литературе нет однозначного ответа на вопрос о необходимости инкорпорации ядер миосателлитов в волокно для его роста или поддержания мышечной массы. Среди исследователей существуют различные взгляды на эту проблему. Многие авторы отрицают необходимость инкорпорации ядер миосателлитов в развитии мышечной гипертрофии [64]. Доказательство тому - большое число работ, проведенных с применением ß2-адреномиметиков, вызывающих гипертрофию мышцы без увеличения количества ДНК в ней или увеличения миоядерного числа. Данные Kadi и др. [13] свидетельствуют о том, что умеренные изменения размеров мышечных волокон могут происходить без добавления новых миоядер. Кроме того, было показано, что при нормальных физиологических условиях число мио-ядер не является определяющим для размера мышечных волокон, размер миоядерного домена варьирует в течение жизни животного [16] и является непостоянным при мышечной атрофии [65]. Несмотря на отсутствие делящихся миосателлитов после воздействия ионизирующей радиацией, в работе Lowe [32] наблюдалась гипертрофия растянутой медленной m. anterior latiimu dorsi японских перепелов. В работе Dupont-Versteegden и др. [66] показано, что вслед за активацией миосателлитов (под действием резистив-ной нагрузки) не следовало их слияние с мышечными волокнами, таким образом, упражнения не способствовали поддержанию миоядерного числа в m. soleus спинальных животных. При этом всегда число активированных миоса-теллитов было выше, чем число разделившихся. Неясной остается физиологическая роль активации такого большого числа миосателлитов, если не происходит инкорпорации их ядер в растущие мышечные волокна. Недавно итальянские авторы показали, что активация протеинкиназы В в течение 3 нед. вызывала гипертрофию мышцы с увеличением массы примерно наполовину и не сопровождалась активацией сателлитов и инкорпорацией новых миоядер [11].
Возможность роста мышцы без инкорпорации сател-литных клеток тем не менее не исключает того, что одним из путей интенсификации синтеза белка является уве-
личение числа матриц ДНК за счет включения в волокно ядер миосателлитов. Сторонники концепции постоянства миоядерного домена считают, что начальные этапы роста мышцы сопряжены с усилением транскрипционных и трансляционных процессов до тех пор, пока миоядерный домен не достигнет определенного предела. И хотя было установлено, что умеренная гипертрофия в мышцах человека может происходить без внесения дополнительного генетического материала [13], с точки зрения вышеупомянутой концепции это объясняется наличием некоторого порогового уровня гипертрофии, чувствительного к инкорпорации новых ядер; т.е. на более поздних стадиях включение ядер миосателлитов является обязательным условием развития гипертрофии мышечных волокон и поддержания размеров ядерного домена [9, 33, 64]. Необходимость миоса-теллитов для развития мышечной гипертрофии впервые была продемонстрирована в работе Rosenblatt и др. [9]; в их эксперименте предотвращение пролиферации сателлитов Y-облучением снижало гипертрофию при функциональной перегрузке. Было установлено, что гибель сателлитных клеток под действием ионизирующего излучения и предотвращение инкорпорации их ядер в мышечные волокна может полностью нивелировать гипертрофию m. extensor digitorum longus, m. soleus и m. plantaris крыс, вызванную удалением мышц-синергистов или физической нагрузкой [67]. В работе Mitchell и Pavlath [33] после вывешивания и действия ионизирующего облучения, предотвращающего пролиферацию миосателлитов, восстановление мышц проходило нормально лишь на этапе, не требующем включения новых миоядер, после чего процесс восстановления замедлялся. Kawano и др. [45] показали, что у молодых животных при трехмесячном восстановлении после трехмесячного вывешивания площадь поперечного сечения волокон не отличается от показателей контрольных животных на фоне увеличения числа сателлитов и миоядер. Авторы сделали вывод о значимости сателлитных клеток в ростовых процессах, происходящих в камбаловидной мышце [45]. Было показано, что процессы пролиферации, дифференцировки и слияния с мышечными волокнами клеток-миосателлитов в скелетной мышце стимулируются фактором роста IGF-1 [68]. В культуре мышечных волокон IGF вызывал гипертрофию вследствие слияния клеток-миосателлитов [62]. Кроме того, гипертрофия, вызванная IGF-1, сопровождалась увеличением количества ДНК в мышечных волокнах и появлением дополнительных ядер [69]. Также было показано, что облучение наполовину предотвращало гипертрофию m. extensor digitorum longus, вызванную введением в нее IGF-1, по-видимому, в той части, которая была обусловлена инкорпорацией ядер мио-сателлитов в мышечные волокна [70]. Эти результаты указывают на то, что повышенный уровень мышечного IGF-1 при нагрузке может вызывать гипертрофию, в т.ч. за счет стимуляции пролиферации миосателлитов и их слияния с материнским волокном.
Недавно появились данные, свидетельствующие о том, что инкорпорация ядер миосателлитов в волокно может происходить и при низкоинтенсивных хронических нагрузках: при хронической низкочастотной электростимуляции и произвольной активности животных («произвольное колесо») [71]. При таком режиме сократительной активности
обычно не наблюдается рабочая гипертрофия. Однако интенсивно происходит процесс трансформации миозинового фенотипа в медленную сторону. Ранее было показано [72], что увеличение количества медленных волокон при низкочастотной стимуляции быстрых мышц у крыс нельзя полностью объяснить изменением экспрессии миозиновых изоформ внутри волокна. Недавно установлено, что подавление размножения миосателлитов с помощью ионизирующей радиации в значительной степени препятствует трансформации волокон в медленную сторону в условиях низкочастотной хронической стимуляции [73]. Интересно, что фармакологическая стимуляция PPARß, одного из компонентов сигнальной системы, осуществляющей переключение экспрессии изоформ миозина в медленную сторону внутри миоядер, способствует слиянию миосателлитных клеток с мышечным волокном [74].
Таким образом, инкорпорация ядер миосателлитных клеток (очевидно, преимущественно с медленным паттерном экспрессии миозиновых изоформ) в мышечное волокно при длительной низкочастотной стимуляции способствует адаптивным изменениям миозинового фенотипа скелетной мышцы.
клетки-миосателлиты в скелетной мышце при растяжении и растяжении на фоне разгрузки
Гравитационная разгрузка - это особый вид редукции сократительной активности мышц. Известно, что резкое снижение (до нуля) электрической активности волокон m. soleus наблюдается непосредственно после устранения опоры и продолжается в течение 2-3 сут воздействия. Затем электрическая активность начинает медленно увеличиваться и достигает нормального уровня к 14 сут пребывания в условиях реальной или моделируемой невесомости [75]. Однако постепенно увеличивающаяся активность мышцы не препятствует развитию атрофических процессов. Очевидно, что одновременно с пониженной сократительной активностью действует и другой фактор - резко уменьшенное (в невесомости - до нуля) сопротивление мышечному сокращению (весовая нагрузка), что оказывает значительное влияние на развитие атрофии [76]. Одним из способов исследовать роль этого фактора является хроническое или повторное применение пассивного растяжения, или стретча, на изучаемую мышцу. Стретч компенсирует отсутствие весовой нагрузки и действительно препятствует развитию атрофии [77].
Взаимосвязь между растяжением и активацией клеток-миосателлитов в культуре была показана в экспериментах Tatsumi и др. [78]. Покоящиеся клетки-сателлиты, подвергнутые циклическому растяжению, активировались и вступали в клеточный цикл, что, вероятно, стимулировалось синтезом в растянутых клетках HGF. Из экспериментов этой же группы авторов, применявших у крыс модель кратковременного (в течение 1 ч) растяжения на фоне вывешивания, следует, что в растянутой мышце при механическом растяжении происходит синтез оксида азота (NO). Он вызывает высвобождение связанного с поверхностью мышечных волокон HGF, который связывается с c-Met-рецептором клеток-миосателлитов, что приводит к их активации. В то же время есть данные о том, что при компенсаторной гипертрофии, вызванной удалением мышц-синергистов, включение
Рис. 2. Клетки-миосателлиты на срезах мышечной ткани крыс. Окрашивание на М-кадгерин. Группы: 1 - «вывешивание 3 сут»,
2 — «вывешивание + растяжение
3 сут», 3 - «вывешивание 7 сут»,
4 - «вывешивание + растяжение 7 сут», 5 - «вывешивание 14 сут», 6 - «вывешивание + растяжение 14 сут», 7 - контроль.
миоядер может протекать независимо от применения блока-тора NOS [79]. В модели Wozniak и др. [38] при растяжении выделенной изолированной мышцы, так же как и при растяжении отдельных мышечных волокон, наблюдается активация клеток-миосателлитов, которую авторы выявляли по усилению инкорпорации BrdU в ядра делящихся клеток. В наших экспериментах при моделируемой гравитационной разгрузке (на модели вывешивания) крыс после 3 дней воздействия не происходит изменение количества экспресси-рующих M-кадгерин клеток-миосателлитов в m. soleus крыс, но уже после 7 дней разгрузки количество миосателлитов снижается на 30 %, а после 14 дней - вдвое по сравнению с контрольным уровнем. Пассивное растяжение m. soleus, примененное одновременно с гравитационной разгрузкой, позволяет поддержать количество сателлитов на 30 % выше контрольного уровня на 3-и и 7-е сут разгрузки и на уровне контроля на 14 сут разгрузки (рис. 2). Мы предположили, что элиминирование пролиферативных возможностей клеток-предшественников у-облучением приведет к частичной утрате способности мышечных волокон к поддержанию их размеров при растяжении на фоне разгрузки. Эксперимент с локальным облучением голени крыс дозой в 2500 рад и последующим вывешиванием или вывешиванием с растяжением показал, что облучение не оказало никакого воздействия на профилактический эффект пассивного растяжения (предотвращение атрофии, трансформации волокон и снижение числа миоядер), наблюдаемый при вывешивании [80]. Недавно в экспериментах in vivo было продемонстрирова-
но, что введение L-аргинина (донора NO) при вывешивании снижает степень атрофии мышцы и поддерживает уровень миоядер и миосателлитов на уровне группы контроля. Кроме того, введение ингибитора NO-синтазы L-NAME достоверно снижает интенсивность пролиферации миосателлитных клеток в условиях стретча, сочетанного с вывешиванием животного. Таким образом, можно предположить, что в исследованной модели продукция NO оказывает существенное воздействие на пролиферацию миосателлитов. Однако введение ингибитора NO-синтазы не влияло на эффективность поддержания мышечной массы при растяжении (см. выше о значимости пролиферации миосателлитных клеток в условиях гипертрофии) [81].
При растяжении миотуб в культуре высвобождаются и другие эндокринные факторы, в т.ч. IGF. В работах лаборатории Goldspink [49, 61] показано, что активация миосателлитов в m. tibialis anterior при растяжении в сочетании с электростимуляцией, а также при механическом повреждении происходит на фоне экспрессии м-РНК IGF-1. Авторы связывают активацию и пролиферацию покоящихся миосателлитов при растяжении мышцы с экспрессией механозависимого фактора роста MGF (пик экспрессии сплайс-варианта MGF наблюдался в первые 4 дня после воздействия), а их дифференцировку и слияние с мышечными волокнами - с более поздней экспрессией IGF-1EA (с 5-го по 12-й дни после воздействия) [49].
Интересно, что в наших экспериментах интенсификация экспрессии IGF-1 в условиях растяжения, сочетан-ного с гравитационной разгрузкой, наблюдалась только к 7-м сут воздействия, в то время как (см. выше) количество клеток-миосателлитов увеличивается уже к 3-м сут. Не исключено, что пролиферация этих клеток при стретче в наших условиях может быть связана с более ранней экспрессией MGF. Дальнейшие эксперименты должны прояснить этот вопрос.
Таким образом, можно считать, что усиление пролиферации миосателлитных клеток в условиях растяжения, соче-танного с гравитационной разгрузкой, стимулируемое различными механизмами, не является необходимым условием предотвращения атрофии мышечных волокон. Возможно, что поддержание миоядерного числа в этом случае обусловлено антиапоптотическим действием растяжения. Однако сопутствующая этому активация миосателлитов препятствует снижению регенераторного потенциала мышцы.
Итак, в настоящем обзоре мы обсудили одну из наиболее спорных проблем пластичности скелетных мышц - влияние сократительной активности на судьбу миоядерного пула. Важны также перспективы фармакологического и геноте-рапевтического управления процессами апоптоза миоядер и активности миосателлитных клеток. Требует изучения применение доноров NO и рекомбинантных аналогов ростовых факторов для противодействия атрофическим изменениям скелетных мышц при послегипокинетическом восстановлении и реабилитации травмированных спортсменов. •
Работа поддержана грантами РФФИ 07-04-00763, 08-04-01557, 10-04-00504. Авторы признательны профессору g. Goldspink (Royal Free and University college London) за полезные замечания при обсуждении основных положений обзора.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С. //Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 90 (5). С. 508-521.
2. Григорьев А.И., Шенкман Б.С.// Вестник РАН. 2008. Т. 78 (4). С. 337-345.
3. Shenkman B.S., Nemirovskaya T.L., Shapovalova K.B., et al. // Acta Astronautica. 2007. V. 60. P. 307-313.
4. Allen D.L., Roy R.R., Edgerton V.R. // Muscle Nerve. 1999. V. 22 (10). P. 1350-1360.
5. Cheek D.B.// Early Hum. Dev. 1985. V. 12. P. 211 - 239.
6. Ishido M., Kami K., Masuhara M. // Acta Physiol. Scand. 2004. V. 180 (3). P. 281-289.
7. Allen D.L., Monke S.R., Talmadge R.J., et al. // J. Appl. Physiol. 1995. V. 78 (5). P. 1969-1976.
8. Ohira Y., yoshinaga T., Ohara M., et al. // J. Appl. Physiol. 1999. V. 87 (5). P. 1776-1785.
9. Rosenblatt J.D., Yong D., Parry D.J. // Muscle Nerve. 1994. V. 17 (6). P. 608-613.
10. Allen D.L., Yasui W., Tanaka T., et al. // J. Appl. Physiol. 1996. V. 81 (1). P. 145-151.
11. Blaauw B., Canato M., Agatea L., et al. // FASEB J. 2009. 23 (11). P. 3896-905.
12. Hikida R., Nostran S., Murray J., et al. // Anat. Rec. 1997. V. 247. P. 350-354.
13. Kadi F., Schjerling P., Andersen L.L., et al. // J. Physiol. 2004. V. 558. P. 1005-1012.
14. Aravamudan B., Mantilla C.B., Zhan W.Z., Sieck G.C. // J. Appl. Physiol. 2006. V. 100 (5). P. 1617-1622.
15. Mantilla C.B., Sill R.V., Aravamudan B., et al. // J. Appl. Physiol. 2008. V. 104 (3). P. 787-794.
16. Schultz E., McCormick K.M. // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 1994. V. 123. P. 213-257.
17. Day M.K., Allen D.L., Mohajerani L., et al. // J. Gravit. Physiol. 1995. V. 2 (1). P. 47-50.
18. Allen D.L., Linderman J.K., Roy R.R., et al. // Am. J. Physiol. 1997. V. 273. P. 579-587.
19. Ohira M., Hanada H., Kawano F., et al. // Japan. J. Physiol. 2002. V. 52. P. 235-245.
20. Roy R.R., Zhong H., Talmadge R.J., et al. //J. Gravit. Physiol. 2001. V. 8 (2). P. 49-56.
21. Wang X.D., Kawano F., Matsuoka Y., et al. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2006. V. 290 (4). P. 981-989.
22. Reimann J., Irintchev A., Wering A. // Neuromuscular Disorders. 2000. V. 10. P. 276-282.
23. KoQtflrk S., Kayatekin B.M., Resmi H., et al. // Eur. J. Appl. Physiol. 2008. V. 102 (5). P. 515-524.
24. Smith H.K., Maxwell L., Martyn J. A., Bass J.J. // Cell. Tissue. Res. 2000. V. 302 (2). P. 235-241.
25. Ferreira R., Neuparth M.J., Vitorino R., et al. // Physiol. Res. 2008. V. 57 (4). P. 601-611.
26. Oishi Y., Ogata T., Yamamoto K.I., et al. // Acta Physiol. (Oxf). 2008. V. 192 (3). P. 381-395.
27. Dupont-Versteegden E.E., Strotman B.A., Gurley C.M., et al. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2006. V. 291 (6). P. 1730-1740.
28. Nagano K., Suzaki E., Nagano Y., et al. // Acta Histochem. 2008. V. 110 (6). P. 505-518.
29. Bruusgaard J.C., Gundersen K. // J. Clin. Invest. 2008. V. 118 (4). P. 1450-1457.
30. Carson J.A., Alway S.E. // Am. J. Physiol. 1996. V. 270 (2 Pt 1). P. 578-584.
31. Kadi F., Thornell L.E. // Histochem. Cell. Biol. 2000. V. 113 (2). P. 99-103.
32. Lowe D.A., Alway S.E. // Cell Tissue Res. 1999. V. 296 (3). P. 531-539.
33. Mitchell P.O., Pavlath G.K. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2001. V. 281 (5). P. 1706-1715.
34. Grounds M.D. // Pathol. Res. Pract. 1991. V. 187 (1). P. 1-22.
35. Seale P., Rudnicki M.A. // Dev. Biol. 2000. V. 218 (2). P. 115-224.
36. Asakura A., Seale P., Girgis-Gabardo A., Rudnicki M.A. // J. Cell. Biol. 2002. V. 159 (1). P. 123-134.
37. Parise G., O'Reilly C.E., Rudnicki M.A. // Appl. Physiol. Nutr. Metab. 2006. V. 31 (6). P. 773-781.
38. Wozniak A.C., Kong J., Bock E., et al. // Muscle Nerve. 2005. V. 31 (3). P. 283-300.
39. Capkovic K.L., Stevenson S., Johnson M.C., et al. // Exp. Cell. Res. 2008. V. 314 (7). P. 1553-1565.
40. Irintchev A., Zeschnigk M., Starzinski-Powitz A., Wernig A. // Dev. Dyn. 1994. V. 199 (4). P. 326-337.
41. Ishido M., Uda M., Masuhara M., Kami K. // Acta Physiol. (Oxf). 2006. V. 187 (3). P. 407-418.
42. Mozdziak P.E., Pulvermacher P.M., Schultz E. // J. Appl. Physiol. 2000. V. 88. P. 158-164.
43. Schultz E., Darr K.C., Macius A. // J. Appl. Physiol. 1994. V. 76. P. 266-270.
44. Ferreira R., Neuparth M.J., Ascensao A., et al. // Eur. J. Appl. Physiol. 2006. V. 97 (3). P. 340-346.
45. Kawano F., Takeno У., Nakai N., et al. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2008. V. 295 (2). P. 458-467.
46. Crameri R.M., Langberg H., Magnusson P., et al. // J. Physiol. 2004. V. 558. P. 333-340.
47. Kadi F., Charifi N., Denis C., et al. // Pflügers Arch. 2005. V. 451 (2). P. 319-327.
48. Adams G.R., Haddad F., Baldwin K.M. // J. Appl. Physiol. 1999. V. 87 (5). P. 1705-1712.
49. Hill M., Wernig A., Goldspink G. // J. Anat. 2003. V. 203 (1). P. 89-99.
50. Allen D.G., Whitehead N.P., yeung E.W. // J. Physiol. 2005. V. 567 (3). P. 723-735.
51. Husmann I., Soulet L., Gautron J., Martelly I., Barritault D. // Cytokine Growth Factor Rev. 1996. V. 7 (3). P. 249-258.
52. Kästner S., Elias M.C., Rivera A.J., yablonka-Reuveni Z.// J. Histochem. Cytochem. 2000. V. 48 (8). P. 1079-1096.
53. Anderson J.E. // Mol. Biol. Cell. 2000. V. 11 (5). P. 1859-1874.
54. Olguin H.C., Olwin B.B. // Dev. Biol. 2004. V. 275 (2). P. 375-388.
55. yamada M., Sankoda У., Tatsumi R., et al. // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2008. V. 40 (10). P. 2183-2191.
56. Rosenblatt J.D., Parry D.J. // J. Appl. Physiol. 1992. V. 73 (6). P. 2538-2543.
57. Machida S., Booth F.W. // Proc. Nutr. Soc. 2004. V. 63 (2). P. 337-340.
58. Adi S., Bin-Abbas B., Wu N.y., Rosenthal S.M. // Endocrinology. 2002. V. 143 (2). P. 511-516.
59. Chakravarthy M.V., Abraha T.W., Schwartz R.J., et al. //J. Biol. Chem. 2000. V. 275 (46). P. 35942-35952.
60. Sartorelli V., Fulco M. // Sci. STKE. 2004. V. 244. P. 11.
61. Goldspink G. //Physiology (Bethesda). 2005. V. 20. P. 232-238.
62. Jacquemin V., Furling D., Bigot A., et al. // Exp. Cell. Res. 2004. V. 299 (1). P. 148-158.
63. McCroskery S., Thomas M., Maxwell L., Sharma M., Kambadur R. // J. Cell. Biol. 2003. V. 162 (6). P. 1135-1147.
64. O'Connor R.S., Pavlath G.K., McCarthy J.J., Esser K.A. // J. Appl. Physiol. 2007. V. 103(3). P. 1107.
65. Wada K.I., Katsuta S., Soya H. // Japan. J. Physiol. 2003. V. 53 (2). P. 145-150.
66. Dupont-Versteegden E.E., Murphy R.J., Houle J.D., Gurley C.M., Peterson C.A. // Am. J. Physiol. 1999. V. 277. P. 89-97.
67. Li P., Akimoto T., Zhang M., et al. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2006. V. 290 (6). P. 1461-1468.
68. Florini J.R., Ewton D.Z., Coolican S.A. // Endocr. Rev. 1996. V. 17 (5). P. 481-517.
69. Barton-Davis E.R., Shoturma D.I., Musaro A., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95 (26). P. 15603-15607.
70. Barton-Davis E.R., Shoturma D.I., Sweeney H.L. // Acta Physiol. Scand. 1999. V. 167 (4). P. 301-305.
71. Kurosaka M., Naito H., Ogura У, et al. // J. Sports Science and Medicine. 2009. V. 8. P. 51-57.
72. Delp M.D., Pette D. // Cell Tissue Res. 1994. V. 277 (2). P. 363-371.
73. Martins K.J., Murdoch G.K., Shu У, et al. // Pflügers Arch. 2009. V. 458 (2). P. 325-335.
74. Giordano C., Rousseau A.S., Wagner N., et al. // Pflügers Arch. 2009. V. 458 (5). P. 901-913.
75. Ohira y., Jiang B., Roy R.R., et al. // J. Appl. Physiol. 1992. V. 73. P. 51-57.
76. Falempin M., Mounier y. // Acta Astronaut. 1998. V. 42 (1-8). P. 489-502.
77. Ohira У, yoshinaga T., yasui W., et al // J. Appl. Biomechanics. 2000. V. 16. P. 80-87.
78. Tatsumi R., Liu X., Pulido A., et al. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2006. V. 290 (6). P. 1487-1494.
79. Gordon S.E., Westerkamp C.M., Savage K.J., et al. // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2007. V. 85 (6). P. 646-651.
80. Таракина М.В., Туртикова О.В., Немировская Т.Л. и др. // Цитология. 2008. Т. 50 (2). С. 140-146.
81. Карташкина Н.Л., Туртикова О.В., Кузнецов С.Л. и др. // Докл. РАН. 2010. В печати.
