CC BY
290
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ м икробиология ♦
УДК 619: 579
Сохранность культур бактерий различных групп при длительном хранении в лиофилизованном состоянии
А.А. Сидорчук, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой эпизоотологии и организации ветеринарного дела (epizoo@mgavm.ru), А.А.Краснова, ветеринарный врач (epizoo@mgavm.ru).
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — МВА имени К.И. Скрябина» (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23).
Высушивание биоматериалов из замороженного состояния (лиофилизация) — широко распространенный способ, позволяющий полностью сохранять структуру и жизнеспособность объекта сушки. При использовании данного способа многие физиологически разнородные виды бактерий и бактериофаги удается сохранять в жизнеспособном состоянии 30 лет и более. По теме лиофилизации микробных культур и биопрепаратов имеются многочисленные разработки.
Цель исследования. Оценить выживаемость культур различных таксономических групп микроорганизмов в процессе длительного хранения в лиофилизированном виде с учетом сроков, условий хранения, защитных сред. Материалы и методы. В работе использовали лиофилизированные штаммы следующих культур: Fusobacteri-um necrophorum (n=45); Actinobacterium (Corynebacterium) pyogenes (n=26); Staphylococcus aureus (n=12); Salmonella abortus ovis (n=5); Esherichia coli (n=5); Clostridium perfringens (n=8); Dichelobacter (Bacteroides) nodosus (n=2), хранившиеся от 1 года до 26 лет. Для оценки жизнеспособности культур в процессе хранения ампулы (флаконы) с лиофилизированной массой растворяли и высевали в стерильных условиях на питательные среды, культивировали при 37 °С в течение 1...7 суток, с оценкой роста на средах и микроскопией.
Результаты. Сухие культуры F. necrophorum сохраняли жизнеспособность в течение 18 лет хранения; культуры S. aureus стабильно сохранялись при сушке длительное время до 26 лет и высевались во все сроки исследований. Аналогичные результаты получены при исследовании энтеробактерий: сальмонелл и эшерихий, которые выдерживали хранение до 20.24 лет. Результаты исследований по выживаемости лиофилизированных культур C. perfringens дали предельный срок выживания 15 лет, при общем сроке исследований до 17 лет. Наиболее требовательный из исследованных микроорганизмов — возбудитель копытной гнили овец D. nodosus — стабильную сохранность показывал не постоянно. В данном исследовании они достаточно стабильно сохранялись в течение от одного года до 10 лет.
Заключение. Метод лиофилизации микроорганизмов — наиболее эффективный и экономичный способ длительного сохранения жизнеспособности бактерий различных таксономических групп. Исследованные нами микроорганизмы — фузобактерии, стафилококки, актинобактерии, клостридии, сальмонеллы и эшерихии — сохраняют жизнеспособность до 20 и более лет.
Ключевые слова: лиофилизация, бактериальные культуры, хранение микроорганизмов Сокращения: ВГНКИ — Всероссийский государственный научный контрольный институт, КА — кровяной агар, МППБ — мясопептонный бульон, ПБ — пептонный бульон, ПА — питательный агар
Введение
Более чем за 100-летнюю историю активного изучения мира бактерий и создания их коллекций сложились общие, но все еще не вполне четкие представления о том, как управлять процессами консервации и восстановления жизнеспособности каждого конкретного вида бактерий.
Так, весьма богатый опыт работы с коллекциями [15___26] свидетельствует, что современные методы консервации вполне эффективны при поддержании лабораторных культур бактерий. Однако эффективная консервация с полным сохранением популяций и геномов представляет собой проблему, особенно если учесть необычайное физиологическое разнообразие бактерий, а также то, что способность сохранять жизнеспособность в определенных условиях обусловлена не только родом и видом бактерий [28, 30].
Существующая практика консервации ориентируется обычно на разработку по возможности немногочисленных и специализированных приемов, позволяющих перевести вегетативные клетки разнообразных бактерий в анабиотическое состояние. Работы по управлению процессами консервации и восстановления жизнеспособности конкретных видов микроорганизмов сохраняют актуальность, что вносит существенный теоретический и практический вклад в проблему сохранения все увеличивающегося биологического разнообразия.
Высушивание биоматериалов из замороженного состояния (лиофилизация, сублимационное высушивание, замораживание-высушивание) — широко распространенный способ, при котором вода испаряется в условиях вакуума без оттаивания льда, что позволяет полностью сохранять первичную структуру объекта сушки. При использовании данного способа многие физиологически разнородные виды бактерий и бактериофаги удается сохранять в жизнеспособном состоянии 30 лет и более [1, 5, 15, 19, 25, 26]. Для этого высушенные клетки должны быть защищены от действия кислорода, влаги и света. По теме лиофилизации микробных культур и биопрепаратов имеются многочисленные разработки [2_4, 6_8, 10, 11, 13, 14].
Как правило, из всех групп микроорганизмов лучше всего лиофилизацию переносят бактериальные формы [11, 13, 21, 28]. По устойчивости к сушке бактерии подразделяют на три группы:
• очень стойкие, такие как представители родов Streptococcus, Staphylococcus, Brevibacterium, Cory-nebacterium, Lactobacillus, Salmonella, Bacillus и т. д. Их жизнеспособность после сушки обычно составляет 70...100 %;
• средне резистентные, например представители родов Brucella, Salmonella, Seratia, Pseudomonas. Их выживание достигает 70 %;
• чувствительные к высушиванию — некоторые представители родов Spirochaeta, Methylobacter, Methylococcus.
Цель исследования
Оценить выживаемость культур различных таксономических групп микроорганизмов в процессе длительного хранения в лиофилизированном виде с учетом сроков, условий хранения, защитных сред. В частности, определить состояние лиофилизиро-ванных культур, хранившихся в музее кафедры эпизоотологии и организации ветеринарного дела (МГАВМиБ — МВА имени К.И. Скрябина): провести реактивацию хранившихся штаммов различных годов лиофилизации на жидких и плотных питательных средах, оценить культурально-морфологи-ческие свойства выросших культур и соответствие их первоначальным паспортным данным.
Материалы и методы
В работе использовали лиофилизированные штаммы, хранившиеся от 1 года до 26 лет.
В процессе работы оценивали штаммы следующих культур: Fusobacterium necrophorum, (n=45); Acti-nobacterium (Corynebacterium) pyogenes (n=26); Staphylococcus aureus (n=12); Salmonella abortus ovis (n=5); Esh-erichia coli (n=5); Clostridium perfringens (n=8); Diche-lobacter (Bacteroides) nodosus (n=2).
Для сушки культур в свое время были использованы стерильные защитные среды: обезжиренное молоко, лошадиная сыворотка, глюкозо-желатиновая среда. Лиофилизированные культуры находились в течение всего периода хранения в холодильнике при 5.10 ° С.
Для оценки жизнеспособности культур в процессе хранения ампулы (флаконы) с лиофилизированной массой вскрывали в стерильных условиях в боксах, в них добавляли стерильный физиологический раствор или стерильную дистиллированную воду в объеме, равном первоначальному объему жидкости в емкости. При этом контролировали растворяемость сухой массы в жидкости по скорости растворения и наличию нерастворимых хлопьев и комочков в случае образования таковых.
После растворения биоматериала в ампулах или флаконах высушивания, из них делали стерильные посевы в пробирки и чашки Петри, на жидкие и плотные питательные среды в зависимости от культур (ПБ и ПА, МППБ, КА, агар Эндо, тиогликолевую полужидкую среду и др.). Посевы культивировали в термостате при 37 °С в течение 1.7 суток, с ежеднев-
ным просмотром роста в пробирках и на чашках. При отсутствии роста в первичных посевах и при необходимости делали 2.3-кратные пересевы на жидкие и плотные питательные среды. Из выросших культур делали мазки на предметных стеклах, фиксировали над пламенем и окрашивали по Граму по общепринятым в микробиологии методам.
Мазки выращенных культур исследовали под микроскопом для оценки морфологии клеток и чистоты посевов.
Результаты и обсуждение
Сводные результаты исследований представлены в таблице 1.
Однако приведенные данные не полностью характеризуют сохранность всех тест-проб исследованных лиофилизированных культур. Это было особенно заметно при оценке одних и тех же штаммов, когда их исследовали в течение длительного периода времени.
Оценивая сохранность лиофилизированных культур F. necrophorum с максимальным сроком хранения 18 лет следует отметить, что в целом сухие культуры сохраняли жизнеспособность в течение указанного периода, что видно по штаммам, которые многократно проверялись посевами в течение 5.18 лет хранения (табл. 2). Однако в ряде случаев даже при недлительном хранении из материала некоторых ампул не удалось получить роста на средах или обнаружить микроорганизмы в мазках из посевов. При этом отмечено, что такие неудачи были в тех случаях, когда при лиофилизации в качестве защитных сред использовали сыворотку или глюкозо-желатиновую сре-
1. Максимальные сроки сохранности различных бактериальных культур 1. The maximal terms of preservation of different bacterial cultures
Культура Число штаммов Число тест-проб Сроки хранения, годы Выживаемость, годы
F. necrophorum 45 86 2...18 До 18
А. pyogenes 26 50 11.20 До 20
S. aureus 12 37 1.26 До 26
S. abortus ovis 4 11 До 20 До 20
E. coli 5 5 24 24
C. perfringens 8 22 3.17 До 15
D.nodosus 2 13 1.25 До 17
2. Результаты исследований лиофилизированных культур F. necrophorum 2. The results of studies of freeze-dried cultures of F. necrophorum
Срок хранения культуры, годы Число тест-проб исследованных / нежизнеспособных
18 13/3
17 14/6
16 8/2
15 10/2
14 4/0
13 5/1
12 3/0
11 6/0
10 2/0
9 1/0
8 4/0
7 4/2
6 4/1
5 3/3
4 Не исследовали
3 1/0
2 1/0
1 2/1
А.А. Сидорчук, А.А.Краснова
ду. Обезжиренное молоко давало больше положительных результатов. Кроме того, на результаты оказывало влияние качество сушки. Рост чаще отсутствовал в ампулах и флаконах, где при сушке не удавалось получить характерную «таблетку», по объему равную первоначальной массе культуры, или при слабом вакууме в ампуле или флаконе. В целом модифицированная (обогащенная) среда МППБ по прописи ВГНКИ оказалась пригодной для активации данных культур.
В целом из 50 проб А. pyogenes не выросли 4 пробы, хранившиеся 16 лет, и 5 проб, хранившихся 15 лет. В более короткие сроки хранения рост отмечен. Остальные культуры, хранившиеся в сухом виде от 3 до 20 лет, в большинстве проб давали положительный результат при использовании обычных питательных сред (ПБ и ПА на сухой основе). Так, штамм № 4\2334 исследовали на сохранность в сроки от 3 до 19 лет, и пробы 17 лет хранения не дали роста, в то время как все остальные вырастали стабильно.
Характер роста культур коринебактерий был двух видов: росинчатый рост — в виде слабого налета на среде или очень мелких отдельных колоний; сильный рост практически на первые сутки в виде сплошной зеленоватой массы. Рост на ПБ практически не учитывался из-за мутности, вызванной защитной молочной средой.
Культуры S. aureus — весьма не требовательные микроорганизмы, стабильно сохранялись при сушке длительное время (до 26 лет) и высевались во все сроки исследований, что в частности было видно по производственному штамму 7315. Из 37 проб культур S. aureus нежизнеспособными оказались только 3 пробы (26, 22 и 14 лет хранения).
Аналогичные результаты получены при исследовании энтеробактерий: сальмонелл и эшерихий, которые выдерживали хранение при условии сушки в обезжиренном молоке до 20...24 лет. Из проб культур S. abortus ovis нежизнеспособной оказалась только одна (20 лет хранения). Все культуры E. coli, хранившиеся 24 года, были жизнеспособны.
Результаты исследований по выживаемости лио-филизированных культур C. perfringens дали предельный срок выживания 15 лет, при общем сроке исследований до 17 лет. Так, три штамма C. perfringens вырастали при посевах 15-летней давности и не вырастали при 16.17 летней давности. Следует иметь в виду, что для лиофилизации использовались вегетативные формы клеток. Однако осталось неизвестно, в каких защитных средах и при каких условиях лиофилизировали эти культуры в свое время. Во всех случаях живые культуры давали сильный рост в МППБ в течение 1 суток с усиленным газообразованием. На ПА и ПБ в аэробных условиях роста не было.
Наиболее требовательный из исследованных микроорганизмов — возбудитель копытной гнили овец D. nodosus — стабильную сохранность показывал не постоянно. Определенную закономерность в зависимости от длительности хранения выявить не удалось. В целом культуры восстанавливались не стабильно.
Хотя одна из тест-проб выросла после 17 лет хранения. Это может быть объяснено тем, что культуры сушились в разное время на различных предприятиях и по различным методикам. В целом аналогичная работа, проведенная А.А. Сидорчуком в 1980 r. [10], показала, что данный вид устойчиво сохранялся до 2,5 лет при использовании в процессе лиофилизации обезжиренного молока. Однако предельную сохранность тогда определить было трудно из-за непродолжительного срока хранения сухих штаммов и слабо разработанной технологии культивирования бактериодов в тот период. В данном исследовании они достаточно стабильно сохранялись в сроки от 1 до 10 лет.
Заключение
Метод лиофилизации микроорганизмов — наиболее эффективный и экономичный способ длительного сохранения жизнеспособности бактерий различных таксономических групп. Исследованиями установлено, что при оптимальной технологии лио-филизации, использовании эффективной защитной среды (обезжиренное молоко), адекватных условиях хранения (5.10 °С) и оптимальных средах реактивации, исследованные нами микроорганизмы — фузобактерии, стафилококки, актинобактерии, клост-ридии, сальмонеллы и эшерихии — сохраняют жизнеспособность до 20 и более лет.
Указанный способ освобождает специалистов лабораторий от постоянной рутинной работы по поддержанию жизнеспособности культур; позволяет безопасно хранить и оперативно восстанавливать ли-офилизированные штаммы для производственных, научных и демонстративных целей в различных организациях.
Библиография
1. Беккер, М.Е. Торможение жизнедеятельности клеток / М.Е. Беккер, А.И. Рапопорт, Л.В. Калакуцкии [и др.]. — Рига: Зинатне, 1987. — 240 с.
2. Белоус, А.М. Научные основы технологии сублимационного консервирования /
A.М. Белоус, Ц.Д. Цветков. — Киев: Наукова думка, 1985. — 208 с.
3. Бланков, Б.И. Применение лиофилизации в микробиологии / Б.И. Бланков,
B.Л. Клебанов. — М.: Медгиз, 1961. — 282 с.?
4. Волков, В.Я. К вопросу о физиологических и физико-химических механизмах стабильности микроорганизмов к замораживанию и высушиванию // Микробиология. — 1994. — Т. 63. — Вып. 1. — С. 5-16.
5. Герна Р. Хранение микроорганизмов // Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Герхардта [и др.]. — М.: Мир, 1983. — С. 512-534.
6. Давыдкин, Ю.П. О движущей силе процесса сублимации влаги из различных материалов / Ю.П. Давыдкин, В.Д. Похиленко, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин // Системы управления и автоматизации технологических процессов — 1993. — Вып. 1. — 40. — C. 5?7.
7. Зурабова, Э.Р. Консервация культуры Bac. thuringiensis лиофильным методом / Э.Р. Зурабова, Т.П. Круглякова, М.К. Дерганюк // Сибирский вестник сельскохозяй-ственой науки. — 1988. — № 5. — С. 36-42.?
8. Карпов, А.М. Сушка продуктов микробиологического синтеза / А.М. Карпов, А.А. Улумиев. — М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. — 216 с.
9. Матвеева, Е.В. Сохранение генофонда фитопатогенных бактерии? методом лиофилизации // Агро21. — 2007. — № 10-12. — С. 29-31.
10. Сидорчук, А.А. Сохраняемость культур рода Bacteroides при лиофилизации./ Сидорчук А.А.// Бюллетень ВИЭВ. — 1980. — Вып. 38. — C. 41?42.
11. Сидякина, Т.М. Консервация микроорганизмов Conservation of of microorganisms / Т.М. Сидякина. — Пущино: ОНТИ НЦБИ, 1985. — 63 с.
12. Троицкая, Е.Н. Сравнение методов хранения культур штаммов Bac. thur- ingien-sisvar. galleriae / Е.Н. Троицкая // Прикладная биохимия и микробиология. — 1979. — Т. 15. — № 3. — С. 402-408.
13. Тутова, Э.Г. Консервация микробиологических препаратов и штаммов- продуцентов / Э. Г. Тутова, М. С. Идельчик // Труды НИИТЭХИМ, 1986. — Вып. 10 (197). — 84 с.
14. Феофилова, Е.П. Торможение жизненной активности как универсальный биохимический механизм адаптации микроорганизмов к стрессовым воздействиям / Е.П. Феофилова // Прикладная биохимия и микробиология. — 2003. — Т. 39. — № 1. — С. 5-24.
15. Цуцаева, А.А. Криобиология и биотехнология / А.А. Цуцаева, В.Г. Попов, К.М. Сыт-кин [и др.]. — Киев: Наукова думка, 1987. — 216 с.
16. Шмидт, П.Ю. Анабиоз / П.Ю. Шмидт. — М.;Л.: Изд-во АН СССР, 1955. — 436 с.
17. American type culture collection methods: 1. Laboratory manual on preservation. Freezing and freeze-drying as applied to algae, bacteria, fungi and protozoa. — Rock-ville (Maryland): ATCC, 1980. — 51 p.
18. Сameron, R.E. Viable microorganisms from ancient Ross Island and Taylor valley drill core / R. E. Cameron, P. A. Morelli // Antarctic J. U. S. — 1974. — Vol. 9. — No 4. — P. 113-116.
19. Calcott, P.H. Freezing and thawing microbes / P.H. Calcott // Patterns of progress. Microbiology. — England : Meadowfield Press Ltd., 1978. — 68 p.
20. Dawes, E.A. Endogenous metabolism and the survival of starved prokaryotes / E.A. Dawes // Symp. Soc. Gen. Microbiol. — 1976. — Vol. 26. — P. 19-59.
21. Donev, T. Methods for Conservation of Industrial Microorganisms / T. Donev. — Sofia, 2001. — 93 р.
22. Fortney, K.F. Stabilization of culture productivity / K.F. Fortney, R.W. Thoma // Dev. Industr. Microbiol. — 1977. — Vol. 18. — P. 319-325.
23. Hammes, W.P. The genus Lactobacillus. In The genera of Lactic Acid Bacteria / W.P. Hammes, R.F. Vogel. — L. (London) : Blackie Academic Press., 1995. — Р. 19-54.
24. Heckly, R.J. Preservation of microorganisms / R.J. Heckly // Adv. appl. micro-biol. — 1978. — Vol. 24. — P. 1-53.
25. Hubalek, Z. / Liquid nitrogen storage of yeast cultures: 1. Survival and literature review of the preservation of fungi at ultralow temperatures / Z. Hubalek, A. Kockova- Kro-tochvilova // Antonie van Leeuwenhoeck. — 1978. —V. 44. — No 2. — P. 229-234.
26. Joubert, W.A. A simple and inexpensive method for the long-term preservation of microbial cultures / W.A. Joubert, T.J. Britz // Journal of Microbiological Method. — 1987. — No 7. — P. 73-76.
27. Lapage, S.P. Culture collections and the preservation of bacteria / S.P. Lapage, J.E. Shelton, T.G. Mitchell, A.R. Mackenzie // Methods in microbiology. — 1970. — Vol. ЗА. — Р. 135-228.?
28. Malik, K.A. Bacterial culture collection: Their importance to biotechnology and microbiology / K.A. Malik, D. Claus // Biotech. and Genetic Engenering Rev. — 1987. — Vol. 5. — P. 137-197/
29. Morgan, C.A. Preservation of micro-organisms by drying: A review / C.A. Morgan, N. Herman, P.A. White, G. Vesey // Journal of Microbiological Methods. — 2006. — V. 66. — No 2. — P. 183-193.
30. Obara, Y. Preservation and transportation of bacteria by a simple gelatin disk method / Y. Obara, S. Yamai, T. Nikkawa [et al.] // J Clin Microbiol. — 1981. — Vol. 14. — No 1. — Р. 61-66.
References
1. Beker M.E., Rapoport A.I., Kalakuckii L.V. [et al.]. Tormozhenie zhiznedejatel'nosti kletok (Inhibition of cell vital activity), Riga, Zinatne, 1987, 240 p.
2. Belous A.M., Cvetkov C.D. Nauchnye osnovy tehnologii sublimacionnogo kon-servirovanija (Scientific bases of technology sublimation), Kiev, Naukova dumka, 1985, 208 p.
3. Blankov B.I., Klebanov V.L. Primenenie liofilizacii v mikrobiologii (Using lyophiliza-tion in Microbiology), M., Medgiz, 1961, 282 p.
4. Volkov V.Ja. Mikrobiologija, 1994, Vol. 63, Is. 1, pp. 5-16.
5. Gerna R. Hranenie mikroorganizmov. B kn. Metody obshhej bakteriologii (Storage of microorganisms. In Methods of general bacteriology, Pod red. F. Gerhard-ta [i dr.], M.: Mir, 1983, pp. 512-534.
6. Davydkin Ju.P., Pohilenko V.D., Davydkin V.Ju., Davydkin I.Ju. O dvizhushhej sile processa sublimacii vlagi iz razlichnyh materialov Sistemy upravlenija i avtom-atizacii tehnologicheskih processov, 1993, Is. 1, pp. 5?7.
7. Zurabova Je.R., Krugljakova T.P., Derganjuk M.K. Sibirskij vestnik sel'skohozja-jstvenoj nauki, 1988, No. 5, p[. 36-42.
8. Karpov A.M., Ulumiev A.A. Sushka produktov mikrobiologicheskogo sinteza (Drying products of microbial synthesis), Moscow, Legkaja i pishhevaja promyshlen-nost', 1982, 216 p.
9. Matveeva E.V. Agro21, 2007, No. 10-12, pp. 29-31.
10. Sidorchuk A.A. Bjulleten' VlJeV, 1980, Is. 38, pp. 41?42.
11. Sidjakina T.M. Konservacija mikroorganizmov, Pushhino, ONTI NCBI, 1985, P. 63.
12. Troickaja E.N. Prikladnaja biohimija i mikrobiologija, 1979, Vol. 15, No. 3, pp. 402-408.
13. Tutova Je.G. Idel'chik M.S. Konservacija mikrobiologicheskih preparatov i shtam-mov- producentov, Trudy NIITJeHIM, 1986, Is. 10 (197), 84 p.
14. Feofilova E.P. Prikladnaja biohimija i mikrobiologija, 2003, Vol. 39, No. 1, pp. 5-24.
15. Cucaeva A.A., Popov V.G., Sytkin K.M. [et al.]. Kriobiologija i biotehnologija (Cry-obiology and biotechnology), Kiev, Naukova dumka, 1987, 216 p.
16. Shmidt P.Ju. Anabioz (Anabiosis), M.; L.: Izd-vo AN SSSR, 1955, 436 p.
17. American type culture collection methods: 1. Laboratory manual on preservation, Freezing and freeze-drying as applied to algae, bacteria, fungi and protozoa, Rock-ville (Maryland), ATCC, 1980, 51 p.
18. Cameron R.E., P.A. Morelli Antarctic J. U. S., 1974, Vol. 9, No 4, pp. 113-116.
19. Calcott, P.H. Freezing and thawing microbes In Patterns of progress. Microbiology. — England: Meadowfield Press Ltd., 1978, 68 p.
20. Dawes, E.A. Symp. Soc. Gen. Microbiol., 1976, Vol. 26, pp. 19-59.
21. Donev, T. Methods for Conservation of Industrial Microorganisms, Sofia, 2001, 93 p.
22. Fortney K.F., Thoma R.W. Stabilization of culture productivity Dev. Industr. Microbiol., 1977, Vol. 18, pp. 319-325.
23. Hammes W.P., Vogel R.F. The genus Lactobacillus. In The genera of Lactic Acid Bacteria, L.: Blackie Academic Press., 1995, pp. 19-54.
24. Heckly R.J. Adv. appl. microbiol., 1978, Vol. 24, pp. 1-53.
25. Hubalek Z., Kockova- Krotochvilova A. Antonie van Leeuwenhoeck, 1978, Vol. 44, No 2, pp. 229-234.
26. Joubert W.A., Britz T.J. Journal of Microbiological Method, 1987, No 7, pp. 73-76.
27. Lapage S.P., Shelton J.E., Mitchell T.G., Mackenzie A.R. Methods in microbiology, 1970, Vol. 3A, pp. 135-228.?
28. Malik K.A., Claus D. Biotech. and Genetic Engenering Rev., 1987, Vol. 5, pp. 137-197.
29. Morgan C.A., Herman N., White P.A., Vesey G. Journal of Microbiological Methods, 2006, Vol. 66, No 2, pp. 183-193.
30. Obara Y., Yamai S., Nikkawa T. [et al.] J Clin Microbiol., 1981, Vol. 14, No 1, pp. 61-66.
SUMMARY
A.A. Sidorchuk, A.A. Krasnova.
Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology — MVA named after K.I. Skryabin (FGBOU VO MGAVMIB - MVA named after K.I. Scryabin) (109472, Moscow, Academician K.I. Skrabin str., 23).
Preservation of Bacterial Cultures Different Groups after Prolonged Storage in a Lyophilized Condition. The drying of biomaterials from the frozen state (lyophilization) is a widespread method to completely keep the structure and viability of the drying object. Using this method, many kinds of physiologically different objects — bacteriophages and bacteria able to maintain in a viable state and over 30 years. Theme lyophilization of microbial cultures and biological products, there are numerous developments.
Purpose of the study. To evaluate the survival of cultures of different taxonomic groups of microorganisms in the process of long-term storage in a lyophilized form with the time and conditions of storage, protective media etc.
Materials and methods. We used the freeze-dried cultures of strains of Fusobacterium necrophorum (n=45); Actinobacterium (Corynebac-terium) pyogenes (n=26); Staphylococcus aureus (n=12); Salmonella abortus ovis (n=5); Esherichia coli (n=5); Clostridium perfringens (n=8); Dichelobacter(Bacteroides) nodosus (n=2), kept from 1 year to 26 years.
To assess culture viability during storage vials (bottles) with the lyophilized mass dissolved and cultivated on nutrient medium, cultured at 37 °C for 1...7 days with growth on media and estimation microscopy.
Results. Dry F. necrophorum culture remained viable for 18 years of storage. Culture S. aureus remained stable during drying for a long time to 26 years old and were alive in all the researches. Similar results were obtained in studies of Enterobacteriaceae: Escherichia and Salmonella, which kept possession of up to 20 ... 24 years. Results for survival of freeze-dried cultures of C. perfringens research gave the ultimate survival period of 15 years, for a total duration of studies up to 17 years.
The most demanding of the studied microorganisms — causative agent of foot rot of sheep D. nodosus — stable safety showed not all the time. In this study, they are enough stable for 1...10 years.
Conclusion. The method of freeze-drying of microorganisms is the most effective and economical way of long-term preservation of viable bacteria of different taxonomic groups. microorganisms studied by us — fusobacterium, staphylococci, actinobacteria, clostridia, salmonella and escherichia — can survive up to 20 years or more. Keywords: lyophilization, bacterial cultures, storage of microorganisms.
