CC BY
32
УДК 582.675.1:57.085.23
DOI: 10.36305/0513-1634-2020-136-14-23
СОХРАНЕНИЕ РАСТЕНИЙ РЕДКИХ ЭНДЕМИКОВ ФЛОРЫ ГОРНОГО КРЫМА CREPIS PURPUREA (WILLD.) M. BIEB.) И SCROPHULARIA EXILIS POPL. В УСЛОВИЯХ ГЕНОБАНКА IN VITRO
Ирина Вячеславовна Митрофанова, Наталия Николаевна Иванова, Ольга Владимировна Митрофанова
Никитский ботанический сад - Национальный научный центр РАН, 298648, Республика Крым, г. Ялта, пгт Никита, ул. Никитский спуск, 52 E-mail: [email protected]
В статье впервые представлены результаты изучения особенностей сохранения в условиях генобанка in vitro в течение 12 месяцев эксплантов 2-х редких эндемичных видов. В исследования были включены микропобеги Crepis purpurea (Willd.) M. Bieb. (Asteraceae) и Scrophularia exilis Popl. (Scrophulariaceae), культивируемые in vitro. В качестве эксплантов для сохранения использовали сегменты микропобегов длиной 0,5-1,0 см. Экспланты помещали на агаризованную питательную среду по прописи % МС, дополненную ингибиторами роста: 0,2 г/л хлорхолинхлорида ССС (BASF, Германия) и 60,0 г/л сахарозы (Panreac, Испания). В качестве контроля использовали среду % МС, дополненную 60,0 г/л сахарозой без ретардантов. Культуральные сосуды помещали в холодильники с интенсивностью освещения 1,25-3,75 мкМ м-2 с- и температурой 4, 6, 8, 10 и 12°С. Растительный материал оценивали через 6 и 12 месяцев ку льтивирования с помощью качественных и количественных характеристик эксплантов. Установлено, что сохранению жизнеспособности и снижению кинетики роста эксплантов Crepis purpurea и Scrophularia exilis в течение 12 месяцев депонирования в условиях генобанка in vitro наряду с низкой интенсивностью освещения и использованием питательной среды с ингибиторами роста способствовало воздействие температуры 4-6°С. У депонируемых эксплантов исследуемых генотипов при переносе в стандартные условия культивирования сохранялся морфогенетический потенциал и способность к регенерации микропобегов и микророзеток.
Ключевые слова: редкие эндемики ; эксплант; осмотик; ретардант; депонирование; in vitro
Введение
Глобальное изменение климата на планете, активное сокращение ареалов обитания и полное исчезновение многих редких видов растений требует новых подходов к сохранению растительных ресурсов. В связи с этим основной задачей ботанических садов является сохранение биологического разнообразия, в том числе изучение и сохранение генетических ресурсов природной флоры [5, 9, 13]. В последние годы особое внимание уделяется редким эндемичным видам, у которых естественное возобновление в природных условиях затруднено. Одним из наиболее перспективных путей сохранения биоразнообразия растений является создание генобанков in vitro. Биотехнологические методы позволяют сохранять ценные редкие виды, а также единичные экземпляры в условиях in vitro, что является составной частью концепции сохранения биоразнообразия растительного мира [15, 17, 18]. В России в лаборатории биотехнологии и вирусологии растений Никитского ботанического сада проводятся многолетние системные исследования особенностей микроразмножения и сохранения в условиях in vitro реликтовых эндемиков флоры Горного Крыма [7]. Реликтовые эндемики представляют особый интерес как виды флоры с сокращающейся численностью и довольно низкой степенью возобновления в естественных условиях произрастания. Crepis purpurea (Willd.) M. Bieb. (Asteraceae) и Scrophularia exilis Popl. (Scrophulariaceae) по своей экологической природе относятся к облигатным петрофитам [8] и занесены в Красные книги РФ (2008) и Республики Крым (2015). Естественные ареалы этих видов располагаются в основном на открытых, хорошо освещенных горных
каменистых склонах, осыпях и в трещинах скал на высоте 400-1400 м над уровнем моря. Популяции облигатного гляреофита S. exilis локализованы всего лишь на двух осыпях южного макросклона Главной гряды в верхнем поясе Горного Крыма: Джунын -Кош и Шаган-Кая, а C. purpurea из-за своеобразной экологической приуроченности представлен локальными малочисленными популяциями на скалах Внутренней и Внешней гряды в среднем поясе Горного Крыма.
Целью данного исследования было изучение особенностей сохранения при низких положительных температурах в течение 12 месяцев растений Crepis purpurea и Scrophularia exilis в условиях in vitro для дальнейшего создания генобанка ценной генетической плазмы растений при низкой положительной температуре.
Объекты и методы исследования
Исследования выполняли в лаборатории биотехнологии и вирусологии растений отдела биологии развития растений, биотехнологии и биобезопасности ФГБУН «Ордена Трудового Красного Знамени Никитский ботанический сад -Национальный научный центр РАН». В работе придерживались как общепринятых, так и разработанных в лаборатории биотехнологии и вирусологии растений методов [1, 5, 10].
Для депонирования использовали микропобеги S. exilis и микророзетки C. purpurea, культивируемых in vitro в течение 6-10 месяцев. В стерильных условиях вычленяли сегменты микропобегов и микророзеток длиной 1,0 см без листьев. Далее экспланты в количестве 3-4 штук помещали в химические стаканы емкостью 100-150 мл на среду Н МС [19], дополненную ингибиторами роста: 0,2 г/л хлорхолинхлорида ССС (BASF, Германия) и 60 г/л сахарозы (Panreac, Испания). В состав среды Н МС были включены макро - и микроэлементы (Sigma, США), витамины (Sigma, США) и 9,0 г/л агара. Контроль - среда Н МС, дополненная 60 г/л сахарозы без ретардантов. Питательные среды автоклавировали при 120°С в течение 5 мин в стерилизаторе LAC 5060S (DAIHAN LABTECH, Южная Корея). Все операции проводили в стерильных условиях бокса биологической безопасности SC2 («ESCO», Сингапур). Культуральные сосуды закрывали фольгой и изолировали парафиновой плёнкой, чтобы не допустить высыхания среды во время депонирования. Сосуды помещали в специальные холодильные камеры марки LIEBHERR FKvsl 4113 (Австрия) с пониженной положительной температурой в интервале 4-12°С, интенсивностью освещения 1,25-3,75 мкМ м-2 с-1, фотопериодом 16 часов. При закладке эксплантов на депонирование записывали основные показатели: генотип, дата введения на депонирование, размер экспланта (длина), этап развития, температура хранения, питательная среда.
Опыты проводили трижды в десятикратной повторности. Растительный материал оценивали через 6 и 12 месяцев культивирования с помощью качественных и количественных характеристик эксплантов: окраска, состояние листьев и побегов, длина микропобега, количество адвентивных микропобегов, количество листьев на микропобеге, количество корней на микропобег, длина корня и жизнеспособность, изменение окраски питательной среды.
Для тестирования регенерационной способности сохраняемых растительных объектов через 12 месяцев сначала осуществляли предадаптацию растительного материала при 14,0-18,0°С путем переноса в климатическую камеру MLR-352-PE (Sanyo, Япония). После предадаптации экспланты культивируовали в фитокапсулах.
Статистическая обработка данных проведена согласно общепринятым методам математической статистики при помощи стандартного пакета документов Microsoft Office Excel (2010).
Результаты и обсуждение
Ранее нами было установлено, что реализация морфогенетического потенциала двух видов реликтовых эндемиков в условиях in vitro проходила через прямой органогенез и адвентивное побегообразование [7].
Для индукции развития адвентивных почек и микропобегов наиболее эффективным оказалось введение в питательную среду 0,1 мг/л БАП, 0,1 мг/л ИМК совместно с 0,1 мг/л ГК3. После 3-го субкультивирования частота регенерации у всех исследуемых видов достигала 90-100% (рис. 1 А, 2 А). Для дальнейшего размножения использовали микрочеренкование полученных in vitro микропобегов и микророзеток на среде МС, дополненной 0,1 мг/л БАП или 0,1 мг/л БАП + 0,1 мг/л ИМК + 0,1 мг/л ГК3.
А
Б
В
Г
Д
Рис. 1 Розетки Crepispurpurea в стандартных условиях культивирования (А), после 6 месяцев депонирования на среде % МС, дополненной 60 г/л сахарозы и 0,2 г/л ССС при различной температуре: 4°С (Б), 6°С (В), 8°С (Г) и 10°С (Д). Масштаб 1,0 см
При микроразмножении происходило как развития основного побега, так и образование 4-7 адвентивных микропобегов или микророзеток. В процессе культивирования выявлено, что растения вида Crepis purpurea отличались повышенным синтезом вторичных метаболитов, что приводило к ингибированию клеточных делений в тканях экспланта, а также снижению жизнеспособности или полной гибели микрорастений. Данный аспект необходимо учитывать при закладке эксплантов на депонирование.
Известно, что длительность хранения образцов в генобанке зависит от вида и сорта растения. Важно определить период, по истечении которого необходимо проводить субкультивирование образцов в каждой конкретной группе растений. Это предотвратит потерю образцов при депонировании в условиях генобанка in vitro [10].
А
Б
В
Г
Д
Рис. 2 Экспланты 8сторки1апа гхШъа в стандартных условиях культивирования (А) и после 6 месяцев депонирования на среде % МС с 60 г/л сахарозы и 0,2 г/л ССС при различной температуре:
4°С (Б), 6°С (В), 8°С (Г), 10°С (Д). Масштаб 1 см
Так, для долгосрочного сохранения культуры в условиях in vitro необходимо поддерживать физиологическую стабильность при изменении кинетики роста в сторону замедления. Длина микропобега, количество адвентивных микропобегов, количество междоузлий определяют кинетику роста растений. В наших исследованиях было использовано комплексное воздействие на эксплант пониженной температурой, интенсивностью освещения, внесением в питательную среду соединений -ингибиторов роста: осмотиков (сахароза) и ретардантов (ССС). Это было ранее успешно опробировано нами при разработке способов депонирования декоративных и эфиромасличных растений [2, 5, 6].
В процессе исследований при изменении морфометрических параметров эксплантов Crepis purpurea после 6 месяцев депонирования установлено, что их жизнеспособность на питательной среде У МС, дополненной 0,2 г/л ССС и 60 г/л сахарозы при температуре 4,0°С и 6,0 °С достигала 95,0-98,0% (рис. 3). Был отмечен незначительный рост микропобегов, образование 1-4 зеленых листьев на удлиненных черешках, а также дополнительных розеток в количестве 1-3 шт./эксплант (рис. 1 Б, В).
о £
ю ®
о 3
о .о
В я
£ £
100 80 60 40 - 20
IC. purpurea IS. exilis
4 6 8 10 12
Температура сохранения, °С Storage temperature, °С
Рис. 3 Влияние температуры на жизнеспособность эксплантов двух видов редких эндемиков после
6 месяцев депонирования в генобанке in vitro
В течение 6 месяцев депонирования сохраняемые розетки оставались зелеными, при этом наблюдали единичные коричневые отмершие листья в нижней части розетки, что является характерным для онтогенеза этого растения признаком и отмечено нами при культивировании C. purpurea в условиях in vitro. Сохранение при 8,0-10,0°С способствовало формированию адвентивных почек и микророзеток в количестве 3-5 шт./эксплант, интенсивному росту листьев на длинных черешках длиной 3,0-5,0 см, образованию 1-2 корней длиной 4,0-5,0 см (рис. 1 Г, Д). Жизнеспособность эксплантов составила 90,0-94,0%. Одновременно отмечали изменение окраски питательной среды продуктами окисления полифенолов, усиливающееся с повышением температуры до 12,0°С. С увеличением периода сохранения это в дальнейшем снижало физиологическую стабильность эксплантов. Депонирование при температуре 12,0°С способствовало в первые месяцы активному росту листьев, образованию дополнительных розеток и корней, а затем к их массовому подсыханию и гибели. Жизнеспособность сохраняли только корни и единичные адвентивные почки.
При температуре 4,0°С и 6,0°С экспланты S. exilis оставались жизнеспособными
(95.
на протяжении 6 месяцев; наблюдали снижение кинетики роста в 3 раза по
сравнению с контролем. Окраска микропобегов варьировала от зеленой до антоциановой (рис. 2 Б, В), удлинение побега составило 0,1 -0,2 см. Отсутствовали
0
листья, дополнительные побеги и корни. При температуре 8,0°С констатировали сохранение жизнеспособности (рис. 3): снижение роста в 2 раза по сравнению с контролем, отсутствие дополнительных побегов, листьев и корней (рис. 2 Г). Образование 3-5 листьев, зеленую окраску побега, отсутствие дополнительных побегов и корней отмечали при сохранении при температуре 10,0°С (рис. 2 Д). Депонирование при температуре 12,0°С способствовало интенсивному росту побегов и образованию листьев, однако наряду с этим появились признаки усыхания верхушек побегов. Корни отсутствовали. Жизнеспособность достигала 95,0%.
Таким образом, сохранение физиологической жизнеспособности и заметное снижения кинетики роста эксплантов exilis в течение 6 месяцев происходило при температуре 4,0-10,0 °С.
Проведенный скрининг депонируемых видов в течение 12 месяцев показал, что при низких положительных температурах жизнеспособность эксплантов оставалась высокой и составляла 85,0-95,0% (рис. 4). Наряду с этим наблюдали изменения морфометрических параметров эксплантов по истечении следующих 6 месяцев сохранения.
Рис. 4 Влияние температуры на жизнеспособность эксплантов 2 -х редких эндемиков после 12
месяцев депонирования в генобанке in vitro
После 12 месяцев сохранения в генобанке in vitro растений C. purpurea при 4 и 6°С наблюдали незначительный рост побега (рис. 5 А, Б, табл. 1), наличие зеленых, гофрированных листьев в количестве 3,2-6,6 шт./побег (табл. 1). Отмечали образование 1-4,5 корней длиной 1,6-4,1 см. Питательная среда на протяжении 12 месяцев депонирования оставалась прозрачной при температуре 4,0°С и слегка окрашивалась при 6,0°С.
С ростом температуры сохранения до 8,0, 10,0 и 12,0°С у растений C. purpurea наблюдали снижение жизнеспособности до 45-50% (рис. 5 В, Г). Это сопровождалось изменением окраски листьев (7,6-10,4 шт./побег) с зеленой на желтую, а затем их полный некроз. Жизнеспособными оставались корни (4-5 шт.) длиной 5-7 см (рис. 5 В, Г, табл. 1). В основании побегов отмечали наличие 1 -3 зеленых адвентивных почек. Наблюдали интенсивное окрашивание среды продуктами окисления фенолов, что также снижало жизнеспособность растений.
Jg. А
А Б В Г
Рис. 5 Розетки листьев C.purpurea после 12 месяцев депонирования на среде % МС с 60 г/л сахарозы и 0,2 г/л ССС при различной температуре: 4,0 °С (А), 6,0°С (Б), 8,0 °С (В) и 10,0°С (Г).
Масштаб 1,0 см
Таблица 1
Морфометрические показатели растений C.purpurea и S. exilis после 12 месяцев депонирования при различной температуре на среде % МС, дополненной 60,0 г/л сахарозы и 0,2 г/л ССС
Тем пе ра тура, °С Длина побега, см Кол-во листьев/побег, шт. Кол-во дополнитель ных побегов, шт. Кол-во корней/побег, шт. Длина корня, см
Crepis purpurea
4 0,88 ± 0,037 3,2±0,20 0 1,0 1,6 ±0,1
6 0,90 ± 0,024 6,6 ±0,24 1,0±0,0 4,5 ±0,4 4,1 ±0,4
8 1,0 ± 0,036 7,6 ±0,24 1,8±0,2 5,0 ±0,3 8,3 ±0,6
10 1,2 ±.0,032 10,4 ±0,4 1,8±0,2 4,5 ±0,3 8,2 ±0,5
12 1,34 ± 0,024 9,8 ±0,7 2,4±0,24 4,5 ±0,5 8,5 ±0,6
Scrophul aria exilis
4 2,42±0,04 4,6±0,24 0 0 0
6 5,32±0,04 9,8±0,37 1,0±0,0 0 0
8 2,76±0,04 6,4±0,4 1,0±0,0 0 0
10 2,32±0,04 3,8±0,2 1,0±0,0 0 0
12 2,34±0,04 3,6±,24 0 0 0
Жизнеспособность эксплантов exilis была высокой при сохранении образцов в течение 12 месяцев при температуре 4,0 и 6,0°С и составляла 93.0% (рис. 4). При температуре 4,0°С наблюдали снижение кинетики роста в 2 раза по сравнению с контролем, при 6,0°С - в 1,5 раза. Побеги длиной 2,4-5,3 см имели зелено-антоциановую окраску, количество листьев составило 4,8-9,8 шт./побег (рис. 6 А, Б; табл. 1). Образования корней не отмечено. Регенерацию адвентивных микропобегов наблюдали при температуре 6,0°С. Притательная среда на протяжении 12 месяцев оставалась прозрачной.
V
А
Б
В
Г
Рис. 6 Экспланты S. exilis после 12 месяцев депонирования на среде % МС с 60,0 г/л сахарозы и 0,2 г/л ССС при различной температуре: 4,0°С (А), 6,0°С (Б), 8,0°С (В), 10,0 °С (Г). Масштаб 1,0 см
При температуре 8,0°С происходило снижение жизнеспособности S. exilis после 12 месяцев депонирования до 85,0% (рис. 4). В этих условиях побеги имели антоциановую окраску, листья - зеленую окраску. Вместе с тем отмечали появление единичных дополнительных побегов и отсутствие корней (рис. 6 В). Сохранение эксплантов при 10°С и 12°С резко снижало жизнеспособность эксплантов (45,0%), что проявлялось в отмирании верхушек, а затем и всего побега (рис. 6 Г). Ризогенез не наблюдали. Исследования позволили выявить, что 50,0% эксплантов после 12 месяцев депонирования при температуре 10°С и 12°С были нежизнеспособными.
Представленные результаты согласуются с данными, полученными ранее для декоративных и плодовых культур. Так, в течение 12 месяцев депонирования растения розы эфиромасличной, хризантемы садовой и клематиса сохраняли высокую жизнеспособность, при этом отмечали снижение кинетики роста в 2 - 3 раза по сравнению с контролем на среде А МС, дополненной 0,2 г/л ССС и 60,0 г/л сахарозы при температуре 4,0 и 6,0°С [2, 5, 11, 16]. Повышение температуры способствовало интенсивному росту побегов и снижению жизнеспособности, что выражалось в отмирании верхушек побегов и листьев. При сохранении субтропических плодовых культур для эксплантов инжира и хурмы восточной оптимальная температура была на уровне 8-10°С [7, 11]. Увеличение температуры сохранения до 12,0-14,0°С вызывало интенсивное выделение фенолов с питательную среду, приводило к резкому снижению жизнеспособности и гибели эксплантов.
Для ретестирования регенерационной способности растений по окончании 12 месяцев депонирования сначала осуществляли преадаптацию растительного материала путем переноса растительного материала в климатическую камеру с температурой 14,0-18,0°С. После преадаптации экспланты культивировали в стандартных условиях на специализированных питательных средах. Отмечали регенерацию микропобегов и микророзеток. Полученные растения визуально не имели морфологических отклонений. При этом морфометрические характеристики регенерантов в культуре in vitro после депонирования были выше, чем при постоянном культивировании в стандартных условиях in vitro.
Таким образом, проведенные исследования показали, что на процесс сохранения двух видов редких эндемиков C. purpurea и S. exilis может оказывать влияние комплекс таких абиотических факторов как низкая положительная температура, интенсивность освещенния и концентрация ингибиторов роста, учитывая морфометрические характеристики депонируемых эксплантов.
Выводы
Таким образом, показана возможность сохранения растений C. purpurea и S. exilis в течение 12 месяцев в условиях генобанка in vitro. Эксперименты выявили способность растений сохранять морфогенетический потенциал при невысокой интенсивности ростовых процессов в течение года при комплексном использовании воздействия на депонирование эксплантов ряда абиотических факторов: пониженная положительная температура, низкая интенсивность освещения и наличие в питательной среде осмотиков и ретардантов.
Экспланты образовывали листья, корни, адвентивные и пазушные побеги при температуре 4,0 и 6,0°С на питательной среде У МС, дополненной 60,0 г/л сахарозы и 0,2 г/л ССС. При этом наблюдали снижение кинетики роста в 1,5-2 раза по сравнению с контролем. При переносе в стандартные условия культивирования отмечали регенерацию микропобегов и микророзеток, что подтверждает сохранение морфогенетического потенциала.
Повышение температуры сохранения до 8 -12°С оказывало негативное влияние на жизнеспособность изучаемых видов растений. В течение первых 6 месяцев отмечен интенсивный рост побегов и листьев. Однако затем наблюдали резкое снижение жизнеспособности при температуре 12,0°С до 38% у C. рurpurea и 35% - у S. exilis, что сопровождалось некротическими процессами у листьев и верхушек микропобегов. Это оказывает негативное воздействие на продолжительность сохранении растительных целевых объектов в условиях генобанка in vitro.
Благодарност ь
Благодарим старшего научного сотрудника ФГБУН «НБС -ННЦ», к.б.н. Никифорова А.Р. за предоставленные семена редких эндемиков.
Работа выполнена в рамках Госзадания № 0829-2019-0038 ФГБУН «НБС-ННЦ» на уникальной научной установке «ФИТОБИОГЕН»
Список литературы
1. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: учеб. пособ. - М.: ФГК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.
2. Иванова Н.Н., Митрофанова И.В., Жданова И.В. Особенности длительного сохранения in vitro розы эфиромасличной в виде медленно растущей коллекции // Актуальные проблемы химии, биотехнологии и сферы услуг.: материалы III Всерос. науч.-практич. конф. с междунар. участием (Иркутск, 24-26 апреля 2019 г.). - Иркутск: Изд-во ИРНИТУ, 2019. - С. 62-66.
3. Красная книга Российской Федерации (растения и грибы) / Министерство природных ресурсов и экологии РФ; Федеральная служба по надзору в сфере природопользования; РАН; Российское ботаническое общество; МГУ им. М. В. Ломоносова; Гл. редколл.: Ю.П. Трутнев и др.; Сост. Р.В. Камелин и др. - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2008. - 885 с.
4. Красная книга Республики Крым. Растения, водоросли и грибы / Отв. ред. А.В. Ена и А.В. Фатерыга. - Симферополь: ООО «ИТ «АРИАЛ», 2015. - 480 с.
5. Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур. - К: Аграрна наука, 2011. - 344 с.
6. Митрофанова И.В., Митрофанова О.В., Иванова Н.Н., Браилко В.А., Лесникова-Седошенко Н.П. Моделирование контролируемых условий, необходимых для адаптации и длительного хранения растительного материала декоративных, ароматических и плодовых
культур в генобанке in vitro: методические рекомендации / Под общей редакцией И.В. Митрофановой. - Симферополь: ИТ "АРИАЛ", 2018. - 72 с.
7. Митрофанова И.В., Митрофанова О.В., Лесникова-Седошенко Н.П., Иванова Н.Н., Жданова И.В., Челомбит С.В., Кузьмина Т.Н., Никифоров А.Р., Руденко М.В. Биотехнологические приемы размножения некоторых представителей редких и эндемичных видов флоры Крыма: Методические рекомендации / Под общей редакцией И.В. Митрофановой. - Симферополь: ИТ "АРИАЛ", 2019а. - 49 с.
8. Никифоров А.Р. Биологические и морфологические особенности некоторых облигатных гляреофитов Горного Крыма // Ботан. журн. - 2018. - Т. 103. - № 8. - С. 968980.
9. Никифоров А.Р., Никифорова А.А. Ритмологические различия в развитии растений Lagoseris callicephala и Lagoserispurpurea (Asteraceae) // Бюлл. ГНБС. - 2016.
- Вып. 118. - С. 58-63.
10. Новикова Т. И. Использование биотехнологических подходов для сохранения биоразнообразия растений // Растительный мир Азиатской России. - 2013. - № 2 (12). -С. 119-128.
11. Основы создания генобанка in vitro видов, сортов и форм декоративных, ароматических и плодовых культур: Коллективная монография / Под ред. д.б.н. И.В. Митрофановой. - Симферополь: ИТ «АРИАЛ», 2018. - 260 с.
12. Митрофанова И.В., Иванова Н.Н., Кузьмина Т.Н., Хохлов С.Ю. Клональное микроразмножение и сохранение в условиях in vitro двух сортов хурмы восточной (Diospyros kaki thunb.) // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. - 2019 б.
- Т. 9. - Вып. 4 - C. 712-721. DOI: https://doi.org/10. 21285/2227-2925-2019-9-4-712-721
13. Митрофанова И.В., Иванова Н.Н., Митрофанова О.В., Лесникова-Седошенко Н.П. Особенности депонирования хризантемы садовой в условиях in vitro // Бюлл. ГНБС. - 2019. - Вып. 131. - С. 110-117. DOI: https://doi.org/10.25684/NBG.boolt.131.2019.15
14. Belokurova V.B. Methods of biotechnology in system of efforts aimed at plant biodiversity preservation (Review) // Cytology and Genetics. - 2010. - Vol. 44. - N 3. - P. 174-185. DOI: https://doi.org/10.3103/S0095452710030096
15. Cruz-Cruz C.A., Gonzalez-Arnao M.T., Engelmann F. Biotechnology and Conservation of Plant Biodiversity // Resources. - 2013. - Vol. 2. - P. 73-95. DOI: 10.3390/resources2020073
16. Engelmann F. Biotechnology and Conservation of Plant Biodiversity // Resources.
- 2013. - Vol. 2. - P. 73-95. DOI: https://dx.doi.org/10.3390/resources2020073
17. Mitrofanova I.V., Brailko V.A., Ivanova N.N., Mitrofanova O.V. Some special features of the conservation of valuable, essential oil rose cultivars: in vitro deposition and cryopreservation // Acta Horticulturae. - 2019. - Vol. 1234. - P 195-201. DOI: 10.17660/ActaHortic. 2019.1234.26
18. Molkanova O., Egorova D., Mitrofanova I. Preservation Characteristics of Valuable Plant Species in In Vitro Genebanks at Russian Botanical Gardens // In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. - 2018 а. - Vol. 58. - Suppl. 1. - P. 46 DOI: https://doi. org/10.1007/s11627-018-9929-7
19. Molkanova O., Shirnina I., Mitrofanova I. Conservation and micropropagation of rare and endemic species in genpool collection of the Russian Federation // Journal of Biotechnology. - 2018 b. - Vol. 280S. - P. 83-84 DOI: https://doi.org/ 10.1016/j.biotec.2018.06.274
20. Murashige T., Skoog F. А revised medium for rapid growth and bioassays with Tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15. - N 3. - P. 473-497. DOI: http://dx.doi.org/10.1111/ j.1399-3054.1962.tb08052.x
Статья поступила в редакцию 29.03.2020 г.
Mitrofanova I.V., Ivanova N.N., Mitrofanova O.V. Rare endemic plants of the mountainous Crimea Crepis purpurea (Willd.) M Bieb.) and Scrophularia exilis Popl. preservation under in vitro genebank conditions // Bull. Of the State Nikita Botan. Gard. - 2020. - № 136. - P. 14-23.
The article presents for the first time the results of a study of the preservation features of explants of 2 rare endemic species under the conditions of the in vitro genebank for 12 months. Microshoots of Crepis purpurea (Willd.) M. Bieb (Asteraceae) and Scrophularia exilis Popl. (Scrophulariaceae), cultured in vitro were included in the research. Microshoots' segments 0,5-1,0 cm long were used as explants for preservation. The explants were placed on an agarized culture medium with a recipe of % MS supplemented with growth inhibitors: 0,2 g/l CCC chlorocholinchloride (BASF, Germany) and 60 g / l sucrose (Panreac, Spain). As a control, a medium of % MS was used, supplemented with 60 g / l sucrose without retardants. Culture vessels were placed in refrigerators with a light intensity of 1.25-3.75 mcM m-2 s-1 and a temperature of 4, 6, 8, 10 and 12,0°C. Plant material was evaluated after 6 and 12 months of cultivation using qualitative and quantitative characteristics of explants. It was found that the preservation of viability and reduction of growth kinetics of Crepis purpurea and Scrophularia exilis explants during 12 months of deposition in the in vitro genebank, along with low illumination intensity and the use of a nutrient medium with growth inhibitors, was facilitated by exposure to a temperature of 4,0-6,0°C. Conservated explants of the studied genotypes after transferring to standard cuture conditions the morphogenetic potential and the ability to regenerate microshoots and micro rosettes were remained.
Key words: rare endemics; explant; osmotic; retardant; deposition; in vitro
