CC BY
36
УДК 577. 125
СОДЕРЖАНИЕ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В ЛИПИДАХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
ЖИРОВОЙ ТКАНИ СОБАКИ
Л. В. КЛАДНИЦКАЯ, А. Й. МАЗУРКЕВИЧ, В. В. ДАНЧУК, С. В. ВЕЛИЧКО,
С. В. МИДЫК, В. Б. ДАНИЛОВ
Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины,
г. Киев, Украина, 03041
(Поступила в редакцию 23.08.2016)
Резюме. Исследован жирнокислотный состав липидов мезенхимальных стволовых клеток (МСК) жировой ткани собаки. Стволовые клетки получали из жировой ткани собаки возрастом до 12-ти месяцев. Жировую ткань отбирали при плановых оперативных вмешательствах. Стволовые клетки культивировали при стандартных условиях в СО2 инкубаторе при 5 % содержании СО2, при температуре 37 оС в среде культивирования Игла, модифицированной Дюльбекко. Для снижения гетерогенности культуры проводили субкультивирование 3-4 раза. Полученные стволовые клетки исследовали методом газовой хрома-тографи на содержание жирных кислот в липидах. Стволовые клетки жировой ткани собаки содержат в липидах коротко-, средне- и длинноцепочечные жирные кислоты. Суммарное количество насыщенных жирных кислот в МСК собаки составляла 65,65, ненасыщенных жирных кислот - 34,35 %. Моноеновые жирные кислоты составляют 24,46, а полиеновые - 9,89 %. Индекс насыщенности -1,91. Индекс соотношения n3 к n6 жирных кислот липидов МСК жировой ткани собаки составляет 0,46.
Ключевые слова: стволовые клетки, насыщенные, ненасыщенные жирные кислоты, собака, жировая ткань.
Summary. The fatty acid composition of lipids ofdog mesenchymal stem cells from adipose derived ones (MSC AD) was studied. Stem cells were obtained from adipose tissue of dogs aged up to 12 months. The adipose tissue was collected during elective surgery. The stem cells were cultivated in standard conditions in a CO2 incubator at 5 % CO2 content at 37°C in Dulbecco's Modified Eagle's Medium. To reduce the heterogeneity of the culture it was subcultivated 3-4 times. The MSC AD were examined by gas chromatography method and the percentage of fatty acids in the lipids was determined. Dog MSC AD contain short-, medium- and long-chain fatty acids in lipids. The total amount of saturated fatty acids in dog MSCs was 65.65 %, that of unsaturatedfatty acids - 34.35 %. Monoenic fatty acids and poly-enoic fatty acids amount to 24.46 % and 9.89 % respectively. Saturated to polyunsaturatedfatty acid ratio is 1.91, n3 to n6 fatty acid ratio in lipids of MSC adipose tissue is 0.46.
Key words: stem cells, saturated, unsaturated fatty acids, dog, adipose tissue.
Введение. Потенциал стволовых клеток по способности корректировать и восстанавливать структуру и функции клеток, систем и органов сегодня вызывает слишком большой интерес как в гуманной, так и в ветеринарной медицине. Успешное применение стволовых клеток в терапевтических целях зависит от многих факторов, в частности, от свойств биологического материала, таких как про-лиферативная активность, выживаемость, целенаправленная дифференциация, а также среды, в которой они находятся [1-3]. Разработка стратегий для решения указанных вопросов должно способствовать лучшему пониманию биологии стволовых клеток.
Значение насыщенных (НЖК), мононенасыщенных (МНЖК) и полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) для функционирования клеток, их мембран и целостного организма известно давно и переоценить его трудно [4]. Данные литературы свидетельствуют о влиянии жирных кислот и их метаболитов на пролиферативную активность и дифференциацию стволовых клеток, и доказано, что повышение содержания ненасыщенных жирных кислот и их метаболитов в среде культивирования приводит к повышению коэффициента пролиферации и процесса дифференциации стволовых клеток различных типов [5]. Наряду с этим известны результаты исследования влияния НЖК в культуральной среде на жизнеспособность и апоптоз мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга человека. Выяснено, что пальмитиновая кислота снижает пролиферацию и индуцирует апоптоз МСК костного мозга человека, а также вызывает цитотоксический стресс кардиальных миоцитов. Эти результаты позволяют предположить, что НЖК снижают выживание МСК костного мозга в естественных условиях, то есть in vivo [6].
Незаменимые жирные кислоты и их метаболиты могут оказывать свое биологическое действие через несколько механизмов. ПНЖК могут быть легко включены в мембранные фосфолипиды, изменяя химические и физические свойства клеточных мембран и, таким образом, модулировать активность ассоциированных с мембранами функциональных белков, таких, как ионные каналы и рецепторы [7]. Простагландин Е (2), образованный из арахидоновой кислоты, может связываться с рецепторами, которые обеспечивают активацию путей, индуцирует рост клеток и пролиферацию [8]. Также известны данные, что эйкозаноиды и липидные медиаторы могут служить в качестве лигандов или коактивато-рами для ряда ключевых транскрипционных факторов, таких как активатора пролиферации перокси-
сом рецепторов [9], ядерных белков [10], и активаторов протеина-1 [11]. Активация этих факторов транскрипции оказывает глубокое влияние на пролиферацию и дифференцировку клеток.
ПНЖК могут влиять на структуру липидов в клеточной мембране, а затем модифицировать клеточные процессы, такие как рецептор-опосредованную сигнальную трансдукцию. Липидные рафты клеточной мембраны играют важную роль в регуляции стволовых клеток к самообновлению, клеточного цикла, выживании и индукции апоптоза [12, 13]. Модификация липидного состава клеток влияет на интенсивность обменных процессов и является тем компенсаторным механизмом, обеспечивающим функциональные возможности мембран при изменившихся условиях.
Цель работы - исследование содержания жирных кислот в липидах мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани собаки.
Материал и методика исследований. Исследования проводились на кафедре физиологии, патофизиологии и иммунологии животных Национального университета биоресурсов и природопользования Украины. В исследованиях были использованы мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани собаки. Эксперименты проводили в соответствии с требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых с экспериментальной и другой научной целью». Культивирование первичного материала из жировой ткани собаки проводили при стандартных условиях в СО2 инкубаторе с содержанием СО2 5 %, при температуре 37 оС в среде Игла, модифицированной Дюльбекко с добавлением 15-20 % фетальной сыворотки бычков и 1 % анти-биотика-антимикотика. Визуальную оценку процесса пролиферации клеток осуществляли с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 40 (Carl Zeiss).
Определение жирнокислотного спектра липидов мезенхимальных стволовых клеток собаки проводилось согласно ДСТУ ISO 5508-2001. Подготовка проб проводилась по ДСТУ ISO 5509-2002. Смесь метиловых эфиров жирных кислот анализировали на газовом хроматографе Trace GC Ultra с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке SPTM-2560, 100 m x 0,25 mm ID, 0,20 цт film (Supelco). Идентификацию жирных кислот проводили с помощью стандартного образца Supelco 37 Component FAME Mix. Количественную оценку спектра ЖК проводили методом нормирования плоскостей пиков метилированных производных ЖК и определяли их содержание в процентах от суммарного содержания всех ЖК.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятыми методами вариационной статистики. Достоверность разницы показателей оценивали по t-критерию Стьюдента. Различия между показателями, сравнивались, считали достоверными при уровне значимости р <0,05.
Результаты исследований и обсуждение. Первичный материал (жировую ткань) получали в ходе оперативных вмешательств от собак возрастом до 12-ти месяцев. Через 10-12 суток культивирования первичного материала из жировой ткани собаки было зарегистрировано 70-90 % конфлюентности культурального пластика клетками (рис. 1).
Р и с. 1. Монослой стволовых клеток жировой ткани собаки
Клетки снимали с дна культуральной посуды с помощью раствора 0,25 трипсина с 0,02 % этилен-диамидтетрауксусной кислотой (ЕБТА), рассеивали в соотношении 1:2 и пассажировали несколько
раз с целью снижения гетерогенности культуры. Подготовленные стволовые клетки исследовали на содержание жирных кислот.
В спектре ЖК МСК собаки обнаружено коротко-, средне- и длинноцепочечные ЖК (рис. 2).
Р и с. 2. Хроматограмма выхода пиков жирных кислот стандарта (а) и липидов мезенхимальных стволовых клеток собаки
(б) (а -верхняя - стандарт, б - нижняя - проба)
Насыщенные жирные кислоты (НЖК) экстрактов липидов мезенхимальных стволовых клеток собаки представлены в диапазоне от С6: 0 до С18: 0 (табл. 1). Их концентрация в экстракте росла в ряду: С8: 0 <С15: 0 <С6: 0 <С10: 0 <С12: 0 <С14: 0 <С18: 0 <С16: 0. Интересно отметить наличие в биологическом материале пентадекановой кислоты, которая относится к жирных кислот с нечетным числом атомов углерода в цепи. Значение С15: 0 для организма мало раскрыто, хотя ее определяют в различных биологических объектах, в том числе и в молоке коров.
Т а б л и ц а 1. Показатели жирнокислотного состава липидов мезенхимальных стволовых клеток
жировой ткани собаки, % п = 3, M ± m
С6:0 2,07 +0,02
С8:0 1,26+0,02
С10:0 2,76+0,03
С12:0 3,08+0,04
С14:0 10,18+0,03
С15:0 1,51+0,04
С16:0 33,68+0,03
С16:1 2,02+0,04
С18:0 11,12+0,05
С18:1п9с 21,63+0,06
С18:2п6с 6,45+0,05
С20:1 0,81+0,02
С20:2п6 0,04+0,01
С20:3п6 0,06+0,01
С20:3п3 0,69+0,04
С22:2 0,31+0,02
С22:5п3 1,49+0,02
С22:6п3 0,86+0,03
Сума (X) насыщенных (НЖК) 65,65
X Ненасыщеных (ННЖК) 34,35
НЖК+ННЖК 100,00
X Моноеновые ННЖК 24,46
X Полиеновые ННЖК 9,89
НЖК/ННЖК 1,91
ю3/ю6 0,46
Среди НЖК в количественном отношении преобладает пальмитиновая кислота, которая в среднем составляет 33,68 % от суммы всех жирных кислот. Стеариновая и миристиновая кислоты составляют соответственно 11,12 и 10,18 %. Четвертое место по количеству среди НЖК занимает лауриновая кислота 3,08 %, которая снижает концентрацию холестерина в крови, и обладает тромбогенными свойствами.
Концентрация моноеновых жирных кислот в экстрактах мезенхимальных стволовых клеток собаки росла в ряду: C20 1 <С16: 1п9с <C18: 1n9c. Причем, содержание олеиновой кислоты составляло 21,63 ± 0,05 % от общего количества выявленных кислот, а цис-11-ейкозеновой - 0,81 ± 0,01 %.
Процентное содержание ПНЖК в экстрактах мезенхимальных стволовых клеток собаки повышался в ряду: C20: 2n6 <С20: 3n6 <С22: 2n6 <С20: 3n3 <С22: 6n3 <С22: 5n3 <C18: 2n6c. Среди полиено-вых ННЖК преобладает линолевая (6,45 %), низкое содержание наблюдалось в цис-11,14-ейкозадиеновой кислоты (0,04 %).
Суммарное количество НЖК выше такого ННЖК, коэффициент насыщенности составляет 1,91. Общее количество НЖК в исследуемых образцах составляла 65,65, тогда как ННЖК - 34,35 %. Мо-ноеновые жирные кислоты определены в количестве 24,46, а полиеновые - 9,89 %.
Следует отметить, что трансизомеры жирных кислот в МСК собаки отсутствуют. Наличие в пищевых продуктах трансизомеров ненасыщенных жирных кислот давно связывают с негативным влиянием на организм. Доказано, что транс-жирные кислоты существенно повышают вероятность возникновения сердечно-сосудистых заболеваний. Среди омега-6 кислот в исследованных образцах преобладала линолевая кислота, среднее содержание которой составляло 6,45 ± 0,05 %; обнаружены также ейкозодиеновая, ейкозотриеновая и докозагексаеновая кислоты.
Среди омега-3 кислот обнаружены цис-8,11,14 -ейкозатриеновую, цис-7,10,13,16,19-докозапентае-новая и цис-4,7,10,13,16,19-докозагесаеновая кислоты. Среди омега-6 кислот установлено в аналитических образцах наличие линолевой, цис-11,14-ейкозадиеновой, цис-8, 11,14-ейкозатриеновой кислот. Индекс соотношения полиненасыщенных жирных кислот n3 к n6 составляет 0,46.
Заключение. В составе липидов стволовых клеток жировой ткани собаки обнаружено 18 жирных кислот. Стволовые клетки, полученные из жировой ткани собаки, содержат в липидах коротко-, средне- и длинноцепочечные жирные кислоты. Суммарное количество НЖК в МСК собаки составляет 65,65 %, среди которых преобладает пальмитиновая кислота - 33,68+0,03 %. Суммарное количество ненасыщенных жирных кислот - 34,35, с преобладанием линолевой - 6,45+0,05 %. Моноеновые жирные кислоты составляют 24,46, а полиеновые - 9,89 %. Коэффициент насыщенности составляет 1,91. Индекс соотношения n3 к n6 жирным кислотам липидов МСК жировой ткани составляет 0,46.
ЛИТЕРАТУРА
1. ДСТУ ISO 5508-2001 Жири тваринш i рослинш та оли. Аналз методом газово! хроматографй метилових ефiрiв жир-них кислот.
2. ДСТУ ISO 5509-2002 Жири тваринш i рослинш та оли. Приготування метилових ефiрiв жирних кислот.
3. Кладницкая, Л. В. Получение культуры стволовых клеток из жировой ткани собаки / Л. В. Кладницкая, А. Й. Мазуркевич, С. В. Величко // Вестник Сумского национального аграрного университета. - серия «Ветеринарная медицина». - Вып. 6(38). - 2016. - С. 19-24.
4. Синяк, К. М. Метод приготовления липидов крови для газохроматографического исследования. Лаб. Дело / К. М. Синяк, М. Я. Оргела, В. И. Крук. - 1976; 1: 37-41.
5. Chapkin, R. S., Kim W., Lupton J.R. et al. Dietary docosahexaenoic and eicosapentaenoic acid: emerging mediators of inflammation. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2009; 81: 187-191.
6. Copland, I. B., Galipeau J. Death and inflammation following somatic cell transplantation. Semin Immunopathol. 2011; 33: 535-550. doi: 10.1007 / s00281-011-0274-8 [PubMed].
7. Fillmore, N., Huqi A., Jaswal J. S., Mori J., Paulin R., Haromy A., Onay-Besikci A., Ionescu L., Thebaud B., Michelakis E., Lopaschuk G. D. / Effect of fatty acids on human bone marrow mesenchymal stem cell energy metabolism and survival. PLoS One. 2015. Mar 13, 10 (3): e0120257. doi: 10.1371 / journal.pone.0120257. eCollection 2015.
8. Grundy, S. M. What is the desirable ratio of saturated, polyunsaturated, and monounsaturated fatty acids in the diet? / S. M. Grundy // Am. J. Clin. Nutr. - 1997. - Vol.66. - P. 988-990.
9. Iwahashi, H., Takeshita A., Hanazawa S. Prostaglandin E2 stimulates AP-1-mediated CD14 expression in mouse macrophages via cyclic AMP-dependent protein kinase A // J. Immunol 2000; 164: 5403-5408.
10. Kang, J. X., Wan J. B., He C. Concise review: Regulation of stem cell proliferation and differentiation by essential fatty acids and their metabolites. Stem Cells. 2014 May; 32 (5): 1092-8. doi: 10.1002 / stem.1620.
11. Lee, M. Y., Ryu J. M., Lee S. H et al. Lipid rafts play an important role for maintenance of embryonic stem cell self-renewal. J. Lipid Res2010; 51: 2082-2089.
12. Mangi, A. A., Noiseux N., Kong D., He H., Rezvani M., Ingwall J. S., et al. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts // Nat Med. 2003; 9: 1195-1201. [PubMed].
13. Rajasingh, J., Bright J. J. 15-Deoxy-delta (12,14) -prostaglandin J (2) regulates leukemia inhibitory factor signaling through JAK-STAT pathway in mouse embryonic stem cells. Exp Cell Res 2006; 312: 2538-2546.], [2424 Liu Q, Merkler KA, Zhang X et al. Prostaglandin F2alpha suppresses rat steroidogenic acute regulatory protein expression via induction of Yin Yang 1 protein and recruitment of histone deacetylase 1 protein. Endocrinology 2007; 148: 5209-5219.
